Name: Quantifizierung des Zytokin-induzierten Zelltods in humanen Dickdarmorganoiden mittels Live-Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung zytokin-induzierten Zelltods in humanen Dickdarmorganoiden mittels Live-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung epithelialer Zelltodmechanismen bei Entzündungen.

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Die Autoren danken den Patientinnen und Patienten für ihre Einverständniserklärung und Teilnahme an der Forschungsstudie sowie dem klinischen Personal für die hervorragende Unterstützung. Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Science Foundation Ireland unterstützt, nämlich durch einen Career Development Award (CDA) für K.N. (SFI-13/CDA/2171), einen Zuschuss für ein Forschungszentrum (SFI-12/RC/2273) und einen Research Centre Spoke Award (SFI-14/SP/2710) für APC Microbiome Ireland. P.F. erhielt auch Mittel aus SFI/20/RP/9007.

Quantifizierung des Zelltods in menschlichen Kolonoiden als Reaktion auf zytotoxische Störungen

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<li>Flood, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sensor-associated+type+I+interferon+signaling+is+increased+in+ulcerative+colitis+and+induces+jak-dependent+inflammatory+cell+death+in+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).</li>
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<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+BCL-G+regulates+secretion+of+inflammatory+chemokines+but+is+dispensable+for+induction+of+apoptosis+by+IFN-%CE%B3+and+TNF-%CE%B1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).</li>
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<li>Mubaid, F., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+Longer+exposure+times+with+low+light+intensity+is+less+photo-toxic%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic.</a> Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).</li>
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K.N. erhielt während der Zeit, in der die Arbeiten abgeschlossen waren, Forschungsgelder von AbbVie Inc. Diese Finanzierung erfolgte im Rahmen eines Forschungszentrums-Spoke-Preises (SFI-14/SP/2710) an APC Microbiome Ireland.

Für die quantitative Analyse des Zelltods in Darmorganoiden wurden mehrere Methoden entwickelt. Die Untersuchung der Störung der Morphologie von Darmorganoiden durch Lichtmikroskopie ist ein einfacher Ansatz zur Quantifizierung der Auswirkungen zytotoxischer Substanzen11. Morphologische Veränderungen sind jedoch kein direktes Maß für den Zelltod, und die Methode ist nur semiquantitativ. Eine andere Methode besteht darin, die Stoffwechselaktivität von Organoiden mit Hilfe eines MTT- oder ATP-Assayszu bewerten 10,11. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Assays nur Veränderungen der Zellviabilität feststellen können und mit einem Zelltod-Assay validiert werden müssen. Über andere fluorometrische Zelltod-Assays mit DNA-Bindungsfarbstoffen wurde berichtet12,13. Ein nicht-bildgebender Ansatz mit einem fluoreszierenden Mikroplatten-Reader ist möglich und ermöglicht einen hohen Durchsatz12. Diese Methode misst jedoch das durchschnittliche Signal eines gesamten Bohrlochs, was sie für heterogene Populationen ungeeignet macht. Es erfordert auch die Verwendung eines Mikroplatten-Readers mit Z-Höhenverstellung. Auf Fluoreszenzbildgebung basierende Techniken können für die Analyse einzelner Organoide und die Erfassung zellulärer/subzellulärer und morphologischer Daten verwendet werden. Automatisierte konfokale High-Content-Imaging-Systeme (HCI) können große Datenmengen mit hohem Durchsatz erzeugen13. Leider erfordert konfokale HCI spezielle Geräte, verwendet komplexe Protokolle, erfordert in der Regel kommerzielle Bildanalysesoftware und ist teuer.
Unser Protokoll für die quantitative Analyse des Zelltods von Kolonoiden zu mehreren Zeitpunkten ist unkompliziert, einfach und kostengünstig. Im Vergleich zu automatisierten HCI- und Plattenlesesystemen ist es jedoch zeitaufwändig und hat den Durchsatz reduziert. Eine weitere Einschränkung unserer Methode ist die Verwendung der Weitfeldmikroskopie im Gegensatz zur konfokalen Mikroskopie. Die konfokale Mikroskopie eignet sich besser für die Bildgebung dicker 3D-Proben, wie z. B. Organoide, da sie unscharfe Signale reduziert und serielle optische Schnitte (Z-Stacks) erfassen kann. Die konfokale Bildgebung erfordert jedoch in der Regel längere Erfassungszeiten und hochintensive Laser, die die Phototoxizität/Photobleichung erhöhen. Es ist wichtig zu beachten, dass fluoreszierende Zelltodfarbstoffe wie SYTOX Green nur für die Messung von Formen des Zelltods geeignet sind, bei denen es zu einem Verlust der Zellmembranintegrität kommt, wie z. B. Nekrose, späte Apoptose-assoziierte sekundäre Nekrose, Nekroptose und Pyroptose21. Es gibt einige Formen des regulierten Zelltods, bei denen die Zellmembran zumindest in den frühen Phasen des Zelltods undurchlässig bleibt, wie z. B. die Caspase-abhängige Apoptose. Dieses Protokoll könnte jedoch leicht modifiziert werden, um auch die Bildgebung eines Caspase-Fluoreszenzreporters22 mit 3/7-Aktivität einzubeziehen. Dies würde zusätzliche Daten liefern, um die spezifische Zelltodmodalität zu charakterisieren.
Wir nutzten unser Protokoll, um die zytotoxische synergistische Interaktion zwischen den Zytokinen IFN-γ und TNF-α zu demonstrieren (Abbildung 2C), die wir zuvor in Organoiden von Zöliakie-Patienten berichtet haben 9,10. Die physiologische Relevanz dieser Form des Synergismus wurde auch in murinen Modellen der hämophagozytären Lymphohistiozytose und Sepsis nachgewiesen23. Zur Quantifizierung der Synergie zwischen Kombinationen biologischer Wirkstoffe wurden mehrere mathematische Referenzmodelle und -ansätze implementiert24,25. Sie unterscheiden sich in ihrer Komplexität, der Anzahl der Faktoren, die sie berücksichtigen, und der Schwelle, ab der eine Wechselwirkung als synergistisch angesehen wird24,25. Einige Modelle erfordern Vorkenntnisse über die getesteten biologischen Wirkstoffe, treffen bestimmte Annahmen über die Aktivität von Wirkstoffen und können umfassende Dosis-Wirkungs-Kurven für jede Einzel- und Kombinationsbehandlung erfordern25. Die von uns gewählte Methode zur Messung der Synergie ist eine Modifikation des Modells des Arzneimittelwechselwirkungskoeffizienten (CDI), das zuvor zur Messung der hemmenden Wirkungen von Chemotherapie-Wirkstoffkombinationen auf die Proliferation von Krebszelllinien verwendet wurde26. Der CDI ist ein Unabhängigkeitsmodell von Bliss; Bei der Berechnung der vorhergesagten kombinierten Wirkung zweier Störungen geht Bliss independence davon aus, dass sie auf getrennte Signalwege abzielen und unabhängige Wirkmechanismen aufweisen27. Damit eine Wechselwirkung zwischen Störungen synergistisch ist, muss der tatsächliche kombinierte Effekt größer sein als der vorhergesagte Effekt. Dieses Modell ist für unseren Versuchsaufbau geeignet, da bekannt ist, dass IFN-γ und TNF-α unterschiedliche Rezeptoren und nachgeschaltete Signalkomponenten aufweisen. Darüber hinaus ermöglicht die Bliss-Unabhängigkeit die Berechnung eines Interaktionskoeffizienten zur Quantifizierung des Synergismus und erfordert keine Dosis-Wirkungs-Datensätze.
Es gibt einige Schlüsselfaktoren, die berücksichtigt werden müssen, um optimale Ergebnisse für dieses Protokoll zu erzielen. Es ist wichtig, dass Koloide zu einer hohen Dichte vermehrt werden (Abbildung 1Bi), dass sie einen Durchmesser von etwa 25-50 μm haben und sich aktiv vermehren, bevor sie versuchen, Zellen zu säen. Die Verwendung suboptimaler Kolonoidkulturen für Assays kann zu unzureichenden Zellzahlen, geringer Kolonoidrückgewinnung und inkonsistenten Experimenten führen. Für reproduzierbare Ergebnisse ist es auch wichtig, die Dichte der Kolonoide zwischen den Experimenten konsistent zu säen. Es wurde bereits gezeigt, dass die in vitro Reaktion auf inflammatorische Zytokine durch die Zellaussaatdichte beeinflusst werden kann28,29. Ein weiteres häufiges Problem ist die Bildung von Luftblasen in der BME-Kuppel, die die Bildgebung beeinträchtigen können. Dies kann durch die Anwendung der umgekehrten Pipettiertechnik verhindert werden. Diese Technik führt auch zu einer gleichmäßigeren Aussaat.
Wenn Sie mehrere Zeitpunkte abbilden, bereiten Sie für jeden Zeitpunkt eine Bedingung für die maximale Toxizität vor. Triton-X 100, ein nichtionisches Tensid, wird häufig als Positivkontrolle (Max-Toxizitätsbedingung) für Zytotoxizitätsassays verwendet. Die Zugabe von Triton-X 100 lysiert und tötet die Kolnoide, so dass der fluoreszierende Zelltodfarbstoff in die Zellen eindringen kann. Die Verwendung einer maximalen Toxizitätsbedingung von einem früheren Zeitpunkt führt zu einer ungenauen und inkonsistenten Normalisierung der Daten, da das Fluoreszenzsignal im Laufe der Zeit abnimmt.
Ein letzter Punkt, den es zu berücksichtigen gilt, ist die Wahl des BME, das für die Kolonoidkultur verwendet wird. Es gibt mehrere kommerzielle Hersteller von BME; Für unser Protokoll haben wir jedoch nur die Marke getestet, die in der Materialtabelle aufgeführt ist. Eine kürzlich durchgeführte Studie mit Organoiden aus dem Bauchspeicheldrüsenkrebs von Patienten ergab, dass die kommerzielle Quelle von BME die Zellproliferationsraten veränderte, aber keinen signifikanten Einfluss auf das Ansprechen auf Chemotherapeutika oder die Genexpression hatte30. Vor diesem Hintergrund gehen wir davon aus, dass der Ergebnistrend bei den BME-Marken für unser Protokoll ähnlich sein wird, aber wir empfehlen, konsequent dieselbe Marke zu verwenden.
Wir haben gezeigt, wie dieses Protokoll für die Analyse des IFN-γ- und TNF-α-induzierten Zelltods mit Hilfe von Zöliakie-Patienten abgeleiteten Kolonoiden verwendet werden kann. Von Patienten stammende Darmorganoide sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Zöliakie, da sie viele Merkmale der Krankheit beibehalten, einschließlich einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber den zytotoxischen Wirkungen von TNF-α31. Das Protokoll könnte jedoch leicht modifiziert werden, um zytotoxische Wirkungen von anderen Störungen als Zytokinen oder anderen Krankheitszuständen als IBD wie Darmkrebs zu untersuchen (wir haben das Protokoll erfolgreich mit Nicht-IBD-Kolonoiden getestet). Wir glauben, dass diese Methode für alle Forschungsbereiche nützlich ist, die sich mit Zelltodmechanismen, der Funktion der Epithelbarriere oder der Immunologie der Darmschleimhaut befassen.

Das Darmepithel bildet eine physikalische semipermeable Barriere zwischen dem Inhalt des Darmlumens und dem darunter liegenden Gewebe. Um diese Barriere effektiv aufrechtzuerhalten, durchlaufen Darmepithelzellen (IECs) einen extrem hohen Zellumsatz mit einem kontinuierlichen Zyklus von Zelltod und Regeneration. Bei entzündlichen Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen (CED) kommt es jedoch zu einem höheren Grad an aberrantem Zelltod1. Dies kann einen Zusammenbruch der Barrierefunktion und die Aktivierung des Immunsystems begünstigen, was weitere Entzündungen auslöst. Bei Morbus Crohn (CD), einer Form von CED, wurde gezeigt, dass die Zytokin-Signalübertragung zu den erhöhten Todesraten bei IEC beiträgt2. Durch die Untersuchung, wie die Zytokin-Signalgebung den Zelltod von IECs induziert, hofft man, dass verbesserte Therapien für Patienten mit CED und anderen entzündlichen Darmerkrankungen entwickelt werden können1.
In der Biologie und der Erforschung von Wirkstoffzielen wird allgemein davon ausgegangen, dass Synergie auftritt, wenn ein biologisches System, das mit Kombinationen einzelner Stimuli behandelt wird, eine Reaktion auf die Kombination zeigt, die größer ist als die kombinierten additiven Effekte der einzelnen Stimuli allein. Synergistische Wechselwirkungen zwischen Zytokinen sind bei der Auslösung angeborener antiviraler Reaktionen gut dokumentiert3. Es ist auch bekannt, dass Zytokine den Zelltod synergistisch induzieren, unter anderem in IECs4. Die Rolle, die synergistische zytotoxische Zytokin-Signale bei intestinalen Entzündungserkrankungen wie CED spielen, ist jedoch noch wenig untersucht.
Humane Darmorganoide sind in vitro hergestellte 3D-Mikrogewebe, die aus Darmepithelstammzellen erzeugt werden. Darmorganoide können aus Darmschleimhautbiopsien von Patienten mit CED gezüchtet werden und behalten viele Merkmale der Erkrankungbei 5,6. Organoide haben sich als ideales Modellsystem für die Untersuchung der Zytotoxizität von Zytokinen im Rahmen von Darmentzündungen erwiesen 7,8. Zuvor hat unsere Gruppe die synergistischen Abtötungseffekte der IBD-relevanten Zytokine IFN-γ und TNF-α in von Zöliakie-Patienten stammenden Dickdarmorganoiden (Kolonoiden) charakterisiert9,10. Die genauen Mechanismen, die an der Vermittlung dieser Form des synergistischen Zelltods beteiligt sind, sind jedoch noch nicht bekannt. Es gibt möglicherweise auch viele weitere uncharakterisierte zytotoxische Zytokin-Wechselwirkungen, die für entzündliche Erkrankungen des Darms relevant sind.
Es stehen mehrere Protokolle zur Verfügung, um den Zelltod in Darmorganoiden zu untersuchen 10,11,12,13; Sie haben jedoch alle Nachteile. Einige dieser Techniken messen nur die Lebensfähigkeit von Zellen und messen den Zelltod nicht direkt, sind nicht in der Lage, Reaktionen einzelner Organoide zu bewerten, oder erfordern teure Geräte und komplexe Protokolle. Robuste und unkomplizierte Methoden sind erforderlich, um den Zelltod von Organoiden und störende Wechselwirkungen in Darmorganoiden zu quantifizieren. Das von uns vorgestellte Protokoll ist ein einfacher und kostengünstiger Ansatz zur Messung der Reaktionen einzelner Organoide auf zytotoxische Zytokine, kann aber für jede Art von Stimulus oder Störung verwendet werden. Wir zeigen auch, wie man das Bliss-Unabhängigkeitssynergiemodell verwendet, um einen Koeffizienten der Perturbagen-Interaktion (CPI) zu berechnen, der zytotoxische Zytokininteraktionen beschreibt.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B Lösung</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td>Science Suite Inc.</td><td>N/A</td><td>Wissenschaftliche Illustrationssoftware</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2058</td><td>Im Wesentlichen IgG-freies, niedriges Endotoxin</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-Well, klare, TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten, einzeln verpackt, steril</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Basalmembran-Extrakt, Typ 2, Pathclear</td><td>R& D Systems</td><td>3532-010-02</td><td>Basalmembran-Extrakt</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Digitales inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td>Digitales inverses Epifluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>EVOS 40x Objektiv, Fluorit, LWD, Phasenkontrast</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4683</td><td>Großer Arbeitsabstand 40x Fluoreszenzobjektiv</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ (Windows-Version)</td><td>Open-Source-Software</td><td>N/A</td><td>Bildanalyse-Software</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin-Lösung</td><td>Sigma-Merck</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für sanfte Zelldissoziation</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td>Reagenz für enzymfreie Zelldissoziation</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid-Ergänzung</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 (Windows-Version)</td><td>Dotmatics N</td><td>/A</td><td>Datengrafik- und Statistiksoftware</td></tr><tr><td>Greiner 15 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, steril mit konischem Boden & Schraubverschluss</td><td>Cruinn</td><td>188261CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Humane rekombinante EGF (tierversuchsfrei)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td>Breites Sortiment antimikrobielles Reagenz</td></tr><tr><td>Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-behandelte Mikroplatte mit flachem Boden</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15543115</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IFN-gamma Protein</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF</td><td>Resuspendierung in steril filtriertem 0,1 % PBS/BSA</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TNF-alpha-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA</td><td>Resuspendierung in steril filtriertem 0,1 % PBS/BSA</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Merck</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Retention</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Nukleinsäure-Färbung - 5 mM Lösung in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Fluoreszierender Zelltodfarbstoff, Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Merck</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung</td><td>Sigma-Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Reagenz für enzymatische Dissoziation</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td>Inhibitor von ROCK-I und ROCK-II</td></tr></tbody></table>

quantifizierung des zytokin-induzierten zelltods in humanen dickdarmorganoiden mittels live-fluoreszenzmikroskopie

Quantification of Cytokine-Induced Cell Death in Human Colonic Organoids Using Live Fluorescence Microscopy

Der Tod von Darmepithelzellen (IEC) ist bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) wie Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD) erhöht. Dies kann zu Defekten der Darmbarrierefunktion, einer Verschlimmerung von Entzündungen und der Immunpathogenese der Krankheit beitragen. Zytokine und Todesrezeptor-Liganden sind teilweise für diesen Anstieg des IEC-Todes verantwortlich. IBD-relevante Zytokine wie TNF-α und IFN-γ sind sowohl unabhängig als auch in Kombination zytotoxisch gegenüber IECs. Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen und praktischen Assay zur Quantifizierung der Zytokin-induzierten Zytotoxizität in Dickdarmorganoiden von Zöliakie-Patienten unter Verwendung eines fluoreszierenden Zelltodfarbstoffs (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), Live-Fluoreszenzmikroskopie und Open-Source-Bildanalysesoftware. Wir zeigen auch, wie das mathematische Modell der Bliss-Unabhängigkeit verwendet werden kann, um einen Koeffizienten der Perturbagen-Wechselwirkung (CPI) auf der Grundlage der organoiden Zytotoxizität zu berechnen. Der CPI kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob Wechselwirkungen zwischen Zytokinkombinationen oder anderen Arten von Störungen antagonistisch, additiv oder synergistisch sind. Dieses Protokoll kann implementiert werden, um die zytotoxische Aktivität von Zytokinen und anderen Störungen unter Verwendung von Dickdarmorganoiden von Patienten zu untersuchen.

Anhand dieses Protokolls konnten wir zeigen, wie Zöliakie-Patienten-Koloide verwendet werden können, um die zytotoxischen Wirkungen der IBD-relevanten Zytokine IFN-γ und TNF-α auf das primäre Epithel zu untersuchen. Wir haben einen kommerziell erhältlichen fluoreszierenden Zelltodfarbstoff (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) verwendet, der nur in Zellen eindringen kann, die eine kompromittierte Zellmembran haben, wo er dann durch Bindung an Nukleinsäuren aktiviert wird. Wir behandelten Kolonoide mit Zytokinen und dem fluoreszierenden Zelltodfarbstoff und führten Lebendzell-Imaging bei 8 h und 24 h mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop durch. Repräsentative Transmissions-/Fluoreszenz-Overlay-Bilder nach 8 h zeigen, dass nur die mit IFN-γ + TNF-α behandelten Koloide positiv für das Fluoreszenzsignal sind; es gibt jedoch nur eine geringe Anzahl von Fluoreszenzzellen (Abbildung 2A). Zellblebbing, ein morphologischer Indikator für den Zelltod20, kann auch in der IFN-γ + TNF-α beobachtet werden. Nach 24 Stunden zeigen mit IFN-γ + TNF-α behandelte Kolonoide große Bereiche, die positiv für das Fluoreszenzsignal sind (Abbildung 2A). Es gibt auch eine deutliche Aufschlüsselung in der Morphologie des Dickdarms - das zentrale Lumen ist nicht mehr sichtbar, und die Epithelbarriere ist vollständig gestört.
Um das Zelltodfarbstoffsignal zu quantifizieren, verwendeten wir eine Open-Source-Bildanalysesoftware, um die Fluoreszenzintensität jedes Kolonoids zu berechnen. Anschließend normalisierten wir die Daten, indem wir den Mittelwert jeder Bedingung als Prozentsatz der Max-Toxizitätsbehandlung ausdrückten. Nach 8 Stunden war der homöostatische oder Hintergrundzelltod in den BSA-Kontrollkolonoiden relativ gering (7,7 % der maximalen Toxizität) (Abbildung 2B). Zu diesem Zeitpunkt gab es keine statistisch signifikanten Veränderungen der Zellsterblichkeit; Erkrankungen, die mit TNF-α behandelt wurden, zeigten jedoch einen geringen Anstieg der Zytotoxizität (Abbildung 2B). Nach 24 Stunden war der Zelltod bei allen mit Zytokinen behandelten Erkrankungen gestiegen. Es gab jedoch eine minimale Veränderung des Zelltods für die BSA-Kontrollbedingung zwischen den Zeitpunkten (7,5 % der maximalen Toxizität nach 24 Stunden). Die mit IFN-γ + TNF-α behandelten Kolonoide wiesen im Vergleich zur BSA-Kontrolle den größten Anstieg des Zelltods auf (29,4 % der maximalen Toxizität). Der Unterschied in der Zelltodrate zwischen der kombinierten Behandlung und der Einzelzytokinbehandlung (IFN-γ, TNF-α) war hochsignifikant. Diese Ergebnisse deuten auf die Möglichkeit einer zytotoxischen synergistischen Interaktion zwischen IFN-γ und TNF-α nach 24 h hin.
Wir verwendeten den CPI, um die zytotoxischen Wechselwirkungen zwischen Zytokinbehandlungen zu quantifizieren und um festzustellen, ob sie synergistisch waren. Wechselwirkungen zwischen Zytokinen werden als synergistisch angesehen, wenn der CPI-Wert &lt;1 beträgt, additiv, wenn =1, oder antagonistisch, wenn &gt;1. Wir berechneten die VPI-Werte pro Zeitpunkt (Abbildung 2C). Nach 8 h zeigte der VPI-Wert einen leichten Synergismus (0,99), wobei der VPI-Wert nach 24 h deutlich abnahm (0,83). Diese Analyse bestätigte, dass die Interaktion zwischen IFN-γ und TNF-α nach 24 h synergistisch war. Darüber hinaus wird verdeutlicht, dass in diesem Zusammenhang der Synergismus zwischen IFN-γ und TNF-α zeitabhängig ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs und der Fehlerbehebung. (A) Schematische Übersicht des Protokolls. (B) Repräsentative Bilder. (Bi) Lichtmikroskopisches Bild, das die optimale Dichte der Kultur und die optimale Größe der Kolonoide vor der Passage für einen Assay veranschaulicht. Maßstabsbalken = 500 μm. (Bii) Lichtmikroskopisches Bild, das die optimale Größe von Kolonoidfragmenten nach der Dissoziation zeigt; Fragmente rot hervorgehoben. Maßstabsbalken = 100 μm. (Biii) Lichtmikroskopische Aufnahme der nekrotischen Colonoid-Morphologie nach MT-Behandlung (mit Triton X-100). Maßstabsbalken = 25 μm. (Biv) Lichtmikroskopische Aufnahme von zwei Kolonoiden, die sich in derselben Brennebene überlappen. Maßstabsbalken = 25 μm. (Bv) Lichtmikroskopische Aufnahme von Dickdarmzelltrümmern, die nach der Passage vorhanden sind; Trümmer rot hervorgehoben. Maßstabsleiste = 25 μm. Abkürzungen: ROI = Region of Interest; MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; MT = Maximale Toxizität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Quantitative Analyse des Zytokin-induzierten Zelltods bei humanen Zöliakie-Kolonoiden. (A) Repräsentative Live-Mikroskopie-Bilder von Zöliakie-Kolonoiden, die mit SYTOX Green Nukleinsäure-Fleck (fluoreszierender Zelltodfarbstoff) und Zytokinen nach 8 h und 24 h behandelt wurden; Übertragungs- und GFP-Kanäle (grüne Farbe) überlagert. Die Kolonoide wurden wie folgt behandelt: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/ml IFN-γ, 3) 10 ng/ml TNF-α, 4) 10 ng/ml IFN-γ + 10 ng/ml TNF-α. Maßstabsbalken = 25 μm. (B) Quantitative Analyse von Zöliakie-Kolonoiden, die mit dem fluoreszierenden Zelltodfarbstoff und den Zytokinen nach 8 und 24 Stunden behandelt wurden; Die Daten werden in % der MT-Bedingung ausgedrückt. N = 2 CD-Kolonoidlinien, 11-16 Coloide pro Bedingung. (C) CPI, berechnet pro Zeitpunkt unter Verwendung des Datensatzes aus B, N = 2 CD-Kolonoidlinien. Die Daten werden als Mittel ± SE ausgedrückt. In B wurde eine Zwei-Wege-ANOVA-Analyse durchgeführt, gefolgt von Bonferroni-Nachtests, *P &lt; 0,05, ***P &lt; 0,001, wie angegeben. Abkürzungen: CD = Morbus Crohn; GFP = grün fluoreszierendes Protein; CPI = Koeffizient der Wechselwirkung zwischen Störstoffen; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; BSA = Rinderserumalbumin; TNF-α = Tumornekrosefaktor-alfa; IFN-γ = Interferon-Gamma; MT = Maximale Toxizität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig02largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Zusammensetzung der Nährmedien für das Protokoll. Zur Herstellung von Organoid-Proliferationsmedien kombinieren Sie L-WRN-konditioniertes Medium und serumfreies Medium 1:1 und fügen Sie dann Nahrungsergänzungsmittel hinzu. Organoid-Proliferationsmedien sollten innerhalb von 2 Wochen nach der Zubereitung verwendet werden. Bitte beachten Sie, dass alle vollständigen Medien bei 4 °C gelagert werden sollten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Experimentelles 96-Well-Plattenlayout und Zytokinbehandlungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%202%20(1).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Untersuchung und Quantifizierung des Zelltods in menschlichen Dickdarmorganoiden als Reaktion auf zytotoxische Störungen wie Zytokine. Der Ansatz verwendet einen fluoreszierenden Zelltodfarbstoff (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), Lebendfluoreszenzmikroskopie und Open-Source-Bildanalysesoftware, um die Reaktionen einzelner Organoide auf zytotoxische Reize zu quantifizieren.

Quantifizierung des Zytokin-induzierten Zelltods in humanen Dickdarmorganoiden mittels Live-Fluoreszenzmikroskopie

Intestinal epithelial cell (IEC) death is increased in patients with inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease ...

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Forschung

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