Postmortale Diagnose von Tollwut bei Tieren mit dem aktualisierten, multiplexierten LN34 Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsassay

Tollwut ist hundertprozentig tödlich und eine schnelle, genaue Diagnose ist erforderlich, um eine lebensrettende Behandlung für diejenigen zu erhalten, die sie am dringendsten benötigen. Zuverlässige Labortests sind für die Tollwutbekämpfung wirklich entscheidend. Die CDC hat ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für Tollwuttests mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) entwickelt, wobei ein validierter Echtzeit-Alisa-Virustest namens LN34 verwendet wird, wodurch Labore die diagnostische Genauigkeit verbessern und Maßnahmen zur Tollwutprävention unterstützen können.

Jahrzehntelang basierte der Tollwuttest auf den direkten Fluoreszenzantikörpertests namens DFA oder FAT. Viele internationale Labore verwenden jedoch auch RT-PCR für Tollwuttests aufgrund seiner hervorragenden Empfindlichkeit und Genauigkeit. Der DFA-Test auf Tollwut erfordert spezialisierte Mikroskope, Kühlkettenlagerung, spezialisierte Ausbildung des Personals, und Reagenzien haben in den letzten Jahren Engpässe erlebt; PCR und RT-PCR werden heute weit verbreitet für Pathogentests eingesetzt.

Viele Labore verfügen bereits über PCR- und RT-PCR-Geräte und Fachkenntnisse, und die benötigten Reagenzien sind von kommerziellen Anbietern erhältlich. Kosten sind ein großes Hindernis für Tollwuttests in Gebieten mit den meisten menschlichen Tollwutfällen. Die CDC entwickelte eine Multiplex-Form des LN34-Tests, die die Qualitätskontrollen verbessert und die Kosten pro getesteter Probe senkt.

RT-PCR wird zunehmend für die Tollwutdiagnostik eingesetzt, da es häufig zur Untersuchung anderer Krankheitserreger eingesetzt wird und die Ergebnisse leicht zu interpretieren sind. Aber die Verwendung eines validierten Tests ist äußerst wichtig, und ebenso wichtig ist die Sicherstellung, dass der Test wie erwartet funktioniert. Unser Schritt-für-Schritt-Protokoll umfasst Qualitätskontrollen, Sicherheitsaspekte und PCR-Best Practices, um Labore beim Einstieg zu erleichtern.

Tragen Sie zunächst persönliche Schutzausrüstung, darunter eine Schutzbrille, einen geschlossenen Frontkittel und zwei Paar Handschuhe. Reinigen und desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit einer quartären Ammoniumverbindung oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel zur Inaktivierung des Tollwutviruss. Legen Sie ein mit Kunststoff ausgekleidetes absorbierendes Pad auf die Arbeitsfläche und verwenden Sie ein sauberes, einmaliges Skalpell, um Gewebe zu sammeln, das einen vollständigen Querschnitt von Hirnstamm und Kleinhirn repräsentiert.

Für die Homogenisierung und RNA-Extraktion werden die benötigten Gewebe schließlich mit einem Einmalskalpell zerkleinert. Verschmiert das Hackfleischgewebe mit einem Abstrich und überträgt den Abstrich in ein mit Homogenisierungspuffer und Perlen vorgefülltes Rohr. Nach dem Ablegen des äußeren Handschuhs mit QAC-Desinfektionsmittel verdünnt 1:256 reinigen und desinfizieren Sie den Arbeitsplatz, die Geräte und die Außenseite der Probenröhrchen.

Homogenisiere die Proben mit einem Mini-Perlenklopfer für 60 Sekunden. Und die Schläuche visuell inspizieren. Lassen Sie die Proben fünf Minuten bei Zimmertemperatur stehen.

Reinigen und desinfizieren Sie schließlich die Arbeitsstation, die Geräte und die Außenbereiche der Probenröhrchen mit QAC-Desinfektionsmittel, bevor Sie mit der RNA-Extraktion beginnen. Zu Beginn führen Sie eine Oberflächendekontamination des biologischen Sicherheitsschranks mit QAC durch, die auf 1:256 verdünnt ist. Führen Sie zusätzliche Reinigungen durch, um Staub oder andere Umweltverunreinigungen zu entfernen.

Lege eine mit Kunststoff ausgekleidete absorbierende Arbeitsplatte auf der Arbeitsplattform. Dann ordnen Sie die Reagenzien und die Proben im Biosicherheitsschrank an. Stellen Sie alle Sammelröhren in ein sauberes Regal für Mikrozentrifugenröhren.

Füllen Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 300 Mikrolitern 100%-Ethanol pro Gehirnprobe vor. Zentrifugiere die homogenisierten Blatt-Gehirnproben bei 10.000 bis 16.000 G für zwei Minuten in einer Tisch-Mikrozentrifuge. Übertragen Sie das klarrosa Überstandsmittel in ein neues steriles Rohr mit 100 % Ethanol, pipettieren Sie es auf und ab, um 600 Mikroliter des Ethanolüberstandsmittels in eine Rotationssäule in einem Sammelrohr zu mischen.

Zentrifugieren Sie eine Minute, bis die Flüssigkeit durch die Säule fließt, entsorgen Sie den Durchfluss und übertragen Sie jede Säule in ein neues Sammelrohr. Fügen Sie jeder Spalte 400 Mikroliter RNA-Vorwaschpuffer hinzu. Zentrifugieren Sie das Gemisch mit 10.000 bis 16.000 G für 30 Sekunden und entsorgen Sie den Durchfluss.

Stecken Sie jede Säule wieder in dasselbe Sammelrohr zurück und wiederholen Sie den Vorwaschschritt ein zweites Mal. Als Nächstes fügen Sie jeder Spalte 700 Mikroliter RNA-Wash-Puffer hinzu. Zentrifugiere bei 10.000 bis 16.000 g für zwei Minuten.

Und übertrage sie vorsichtig in einen RNase-freien Schlauch. Entsorge den Durchfluss und den Sammelschlauch, dann entferne und entsorge die äußeren Handschuhe. Gib nun 50 Mikroliter DNase und RNase-freies Wasser direkt zur Säulenmatrix und inkubiere 30 Sekunden.

Dann eine Minute lang mit 10.000 bis 16.000 G zentrifugieren. Übertragen Sie die RNA vorsichtig auf ein neues, mit Schraubendecke, flacher Untergrund beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen für den RT-PCR-Test. Zu Beginn tauen Sie einen Schritt RT-PCR-Puffer auf, keine Template-Kontrolle, nukleasefreies Wasser, Primer und Sonden auf Eis im Mastermix-Vorbereitungsraum.

Leg ein RT-PCR-Enzym auf Eis. Berechnen Sie das Volumen jedes Reagens für die LN34-multiplexierten und Beta-A-Mastermixes. Setzen Sie für jede Probe in dreifacher Form Bohrungen für den LN34-multiplexierten Assay mit einer 96-Bohrloch-Plattenkarte.

Nach dem Vortexen und Spinnen geben Sie 23 Mikroliter LN34-Multiplex-Master-Mix in jeden zugewiesenen LN34-Brunnen ein. Um negative Template-Kontrollreaktionen einzurichten, geben Sie zwei Mikroliter PCR-Qualitätswasser in jede negative Template-Kontrollwelle. Stelle die 96er-Well-Platte auf Eis.

Reinigen Sie die Arbeitsstation mit 70 % Ethanol. Jetzt im Template Edition Workspace, auftauen Sie RNA-Proben und positive Kontroll-Einweg-Aliquot von künstlicher RNA auf Eis. Nach dem Vortexen zentrifugieren Sie kurzzeitig Röhren mit RNA-Proben und pipettieren zwei Mikroliter Probe oder positiver Kontroll-RNA in das entsprechende Bohrloch.

Nachdem Sie alle Proben hinzugefügt haben, legen Sie die optische Klebeschichtung über die Brunnen, um sie vollständig abzudichten. Zentrifugiere die Platte bei 500 G für eine Minute bei Raumtemperatur, setze die versiegelte Platte in ein Echtzeit- oder quantitatives PCR-Gerät, das für Fam- und VIC-Hex-Reporter-Chips kalibriert ist. Stellen Sie das Instrument auf die entsprechenden Zyklusparameter ein.

Nach Abschluss des Durchlaufs setzen Sie die Schwellenwerte auf 0,2 für LN34 und 0,05 für Beta-Aktin. Überprüfe die Kontrollprobenkurven auf Qualitätsprobleme. Der LN34-Test zeigte erfolgreiche Amplifikationskurven mit positiven Ergebnissen, die die Schwelle bei unterschiedlichen Zyklusschwellenwerten auf logarithmischer Skala überschritten.

Und Sigmoid-Amplifikationskurveren auf linearer Skala sowohl für LN34 als auch für Beta-Aktin. Negative Ergebnisse zeigten flache Linien ohne Verstärkung. Abnormale Amplifikationskurven wurden festgestellt, wobei einige lineare statt sigmoiale Zunahmen der Fluoreszenz zeigten, was auf atypische Ergebnisse hinweist.

Die entsprechenden Mehrkomponentendiagramme zeigten unregelmäßige, wellenförmige fluoreszierende Signale statt erwarteter glatter Kurven. Dabei wird die Notwendigkeit hervorgehoben, Amplifikationsdiagramme zu analysieren, anstatt sich ausschließlich auf Zyklusschwellenwerte zu verlassen.