Name: Nassanfasen von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck zur Rückmeldung der Nadelöffnung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Lernen Sie die pneumatische Nassanfasung von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck zur präzisen Steuerung der Nadelöffnung. Diese Methode gewährleistet reproduzierbare Schärfe für genetische Forschung an Insekten.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protokoll für das Nassanfasen von Mikroinjektionsnadeln unter konstantem Luftdruck

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,0 mm Außendurchmesser Mikrokapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beveler Sockelöl</td><td>Sutter Instruments</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>Fahrrad Schutzblechclip</td><td>VeloOrange</td><td>R-Clip 4er-Pack</td><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack</td></tr><tr><td>Galgenstativ Mikroskop</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3,5X-90X Trinokular LED Galgenstativ Stereomikroskop oder äquivalent</td></tr><tr><td>BV-10 Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Diamant-Schleifplatte</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>Diamant-Schleifplatte - extra fein (0,2 & Mikro; bis 1,0 & Mikro; Spitzengrößen)</td></tr><tr><td>Dichtung, Buna-N</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>Wird zum Abdichten von Verbindungen an T&nbsp; oder L-Anschlüssen verwendet, falls nicht bereits im Lieferumfang enthalten</td></tr><tr><td>Schlauchschelle</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>5000-2-Packung</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchanschluss</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>Benötigen Sie 5 Schlauchanschlüsse</td></tr><tr><td>Mikroinjektionsnadelhalter</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3-10</td><td>Nadelhalter für Mikrokapillaren mit 1 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Jeder Nadelabzieher</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 Lösung</td><td>B& H Foto, Video und Audio</td><td>BH #KOPF200P&nbsp; MFR #1464510</td><td>Netzmittel</td></tr><tr><td>Manometer</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>0-100 psi Gauge</td></tr><tr><td>Referenzdocht</td><td>Sutter Instruments</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>Referenzdochthalter</td><td>Sutter Instruments</td><td>M100019</td><td></td></tr><tr><td>Regulator</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mär</td><td>Benötigen Sie #10-32 Anschlüsse für Anschlüsse</td></tr><tr><td>Gummi Packungsblatt 6 inx 6 Zoll</td><td>Danco</td><td>Modell # 59849</td><td></td></tr><tr><td>T-Anschluss</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>15002-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>Gewindestange</td><td></td><td></td><td>Entweder eine Gewindestange oder eine Stange mit Gewindeende. Die Gewinde müssen 10-32 sein.</td></tr><tr><td>Urethan-Schlauch</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

nassanfasen von mikroinjektionsnadeln mit konstantem luftdruck zur rückmeldung der nadelöffnung

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

Das oben beschriebene Verfahren erzeugt gleichbleibend scharfe Mikroinjektionsnadeln. Scharfe Nadeln zeichnen sich dadurch aus, dass sie in der Lage sind, weiche Chorion-Insektenembryonen, wie z. B. Mückenembryonen, mit wenig bis gar keinem Widerstand der Embryonalmembran einzuführen. Wenn Mückenembryonen zur genetischen Veränderung mikroinjiziert werden, ist die Embryonalmembran relativ elastisch. Wenn Sie eine stumpfe Nadel gegen die Embryonalmembran drücken, wird sie eingedrückt (Abbildung 4B). Wird die Nadel zurückgezogen, nimmt die Membran wieder ihre Form an. Mit genügend Druck reißt die stumpfe Nadel schließlich durch die Membran und das Embryoplasma tritt wahrscheinlich aus. Je schärfer die Nadel ist, desto weniger Einkerbungen entstehen, wenn die Nadel gegen die Embryonalmembran gedrückt wird (Abbildung 4E). Anstatt in die Membran zu reißen, schlüpft eine scharfe Nadel durch die Membran und fügt dem Embryo wenig bis gar keinen Schaden zu. Mit einer idealen Nadel gibt es fast keine Vertiefung der Embryonalmembran, wenn die Nadel in den Embryo gleitet.
Die University of Maryland Insect Transformation Facility (UM-ITF) ist eine Serviceeinrichtung, die gentechnisch veränderte Insekten für Kunden aus Wissenschaft und Industrie herstellt. Die Anlage verwendet abgeschrägte Nadeln für die Mikroinjektion von Mückenembryonen. Im Zeitraum zwischen Januar 2023 und Dezember 2023 injizierte die UM-ITF 12.795 Aedes-Embryonen in 56 Kundenprojekten (Tabelle 1). Durch die Verwendung von abgeschrägten Nadeln konnte die UM-ITF bei allen Projekten einen durchschnittlichen Spielraum von 31 % nach der Injektion aufrechterhalten (Tabelle 2). Darüber hinaus war das UM-ITF in der Lage, eine Injektionserfolgsrate von 96 % aufrechtzuerhalten, die durch die Nachbeobachtung nach dem Projekt mit den Kunden ermittelt wurde (Tabelle 2). Der Injektionserfolg ist ein Maß dafür, ob die injizierten Injektionsmaterialien (CRISPR-Guides, Cas9-Protein, Transposon-Vektor-Plasmide usw.) in die Embryonen des Projekts so eingebracht wurden, dass diese Materialien in der Lage waren, eine genetische Veränderung zu erzeugen. Mit anderen Worten, waren die Injektionen gut genug, um eine genetische Veränderung hervorzurufen, wenn die injizierten Komponenten ordnungsgemäß funktionierten. Es gibt viele Faktoren, die zum Erfolg eines genetischen Veränderungsprojekts beitragen, und qualitativ hochwertige Mikroinjektionen mit scharfen Nadeln sind ein Schlüsselfaktor für den Erfolg. Das Anfasen von Nadeln unter Verwendung des in dem obigen Protokoll beschriebenen Verfahrens ermöglicht es dem UM-ITF, qualitativ hochwertige scharfe Mikroinjektionsnadeln konsistent herzustellen, wodurch das UM-ITF gleichbleibend erfolgreiche Injektionen durchführen kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Komponenten des Luftsystems und des Anschlusses an die Mikrokapillare. Die Luft wird der Kapillarnadel durch ein System von Urethanschläuchen aus einer Luftzufuhr (entweder Hausluft oder Luftzylinder) zugeführt. Die Urethanschläuche sind über Schlauchverbindungen (HC), die aus einem Schlauchverbinder und einer Schlauchschelle bestehen, mit dem Regler (R) und dem Manometer verbunden. Der Schlauchanschluss wird in einen 10-32 Gewinde Innengewinde an der Basis des Reglers (R) und des Manometers eingeschraubt. Ein T-Anschluss (T) ist mit dem Regler (R) verbunden, um verschüttete Luft zwischen dem Manometer und dem Nadelhalter (NH) abzuleiten. Der Urethanschlauch wird über einen Luer-Anschluss (LC), der mit dem Nadelhalter (NH) geliefert wird, mit dem Nadelhalter verbunden. Der Anschluss an die Luftzufuhr variiert je nach verwendeter Luftversorgung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg"> Abbildung 2: Manipulatorteile und Luftaufstellung. Teile des Manipulators: a. Grobeinstellknopf, b. Feineinstellknopf, c. Messschieber, d. WPI-Nadelhalter, e. Winkellehre, f. Halteklammer und Fahrradschutzblechclip, g. Luer-Adapter und Luer-Schlauchanschluss und h. Urethanschlauch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg"> Abbildung 3: Platzierung der Nadel in Bezug auf die Drehung der Schleifplatte. (A) Richtige Platzierung der Nadel während des Anfasens. Die abzuschrägende Nadel sollte auf die rotierende Schleifplatte gelegt werden, die irgendwo senkrecht zur Drehung und in einer Linie mit der Drehung ausgerichtet ist, wobei sich die Drehung von der Nadelspitze weg bewegt. (B) Unsachgemäße Platzierung der Nadel. Durch die Drehung der Schleifplatte in dieser Ausrichtung drückt die Oberfläche der Schleifplatte auf die Nadelspitze und nicht unter und an der Spitze vorbei. In dieser Ausrichtung erfolgt die Abschrägung möglicherweise nicht glatt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg"> Abbildung 4: Vergleich des Einstechens der Nadel mit unscharfen und scharfen Nadeln. (A-C) nicht scharfe Nadel und (D-F) scharfe Nadel. (A) und (D) wurden aufgenommen, bevor die Nadel den Embryo berührte; (B) und (E) befinden sich an der Stelle, kurz bevor die Nadel die Embryonalmembran durchsticht, und (C) und (F) befinden sich unmittelbar nach dem Nadelstich. Der weiße Pfeil in (B) zeigt an, dass sich die Embryonalmembran einkerbt, da größerer Druck ausgeübt werden muss, damit eine unscharfe Nadel durchstechen kann. Der schwarze Pfeil in (E) zeigt das Fehlen einer Vertiefung an, da das Nadelstechen aufgrund einer scharfen Nadel leicht ausgeführt werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: UM-ITF Aedes-Projekte von Januar 2023 bis Dezember 2023. Liste der UM-ITF Aedes-Mikroinjektionsprojekte mit der Anzahl der injizierten Embryonen für jedes Projekt, der Anzahl der Larven, die aus diesen injizierten Embryonen geschlüpft sind, und dem Prozentsatz der geschlüpften Larven pro injiziertem Embryo insgesamt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Ergebnisse des UM-ITF-Projekts Aedes. Die UM-ITF ist eine Serviceeinrichtung, die Mikroinjektionsdienstleistungen für die genetische Veränderung von Insekten anbietet. In der Tabelle ist die Anzahl der Aedes-Projekte aufgeführt, die von der ITF von Januar 2023 bis Dezember 2023 injiziert wurden. Die Anzahl der Kunden, die auf Projektnachverfolgungsanfragen geantwortet haben, bei denen die Antwort auf den Erfolg oder Misserfolg des Injektionsprojekts hinweist. Die Zahl der erfolgreichen Projekte, bei denen ein erfolgreiches Projekt ein Projekt war, bei dem die Injektionsmaterialien zu einem bestimmten Zeitpunkt und an einem Ort in den sich entwickelnden Embryo mikroinjiziert wurden, so dass die Injektionen in der Lage waren, eine genetische Veränderung hervorzurufen, und die Anzahl der Projekte, die aufgrund fehlender genetischer Veränderungen als nicht erfolgreich angesehen wurden. Die durchschnittliche Schlupfrate für Aedes-Mikroinjektionsprojekte im Zeitraum von Januar 2023 bis Dezember 2023. Die Projekterfolgsrate und die Rücklaufquote des Kunden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Nassanfasen von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck zur Rückmeldung der Nadelöffnung

Microinjection needles are a critical tool in the delivery of genome modification reagents, CRISPR components (guide RNAs, Cas9 protein, and donor ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Poland, R. et al. Mikroinjektion des Gehirns von Nagetieren zur Untersuchung molekularer Substrate motivierten Verhaltens. J. Vis. Exp. (2015)In diesem Video wird ein wassergefüllter Mikroinjektionsaufbau, bestehend aus einer Spritze und einem Mikroinjektorschlauch, für eine präzise Wirkstoffabgabe verwendet. Eine Ratte mit einer präimplantierten Führungskanüle wird einer gezielten Mikroinjektion im Gehirn unterzogen, die eine genaue Verabreichung von Therapeutika bei wachen Tieren mit...

Mikroinjektionsbasierte Verabreichung eines Therapeutikums in ein waches Nagetiergehirn

Quelle: Vanegas, M. I., et al. Mikroinjektrodensystem für kombinierte Wirkstoffinfusion und Elektrophysiologie. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt ein mikroelektrodenbasiertes mikrofluidisches Gerät, das eine Arzneimittellösung durch ein Kapillarrohr abgibt, wobei eine ölbasierte Markerlösung für eine präzise Volumenverfolgung verwendet wird und eine gleichzeitige neuronale Aufzeichnung und Wirkstoffinfusion ermöglicht wird.

Mikrofluidik-basiertes Mikroinjektrodensystem für die kombinierte Wirkstoffinfusion und Elektrophysiologie

Quelle: Paolone, G., et al. Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Gehirn von Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video zeigt die Injektion einer Mikronadel in das Gehirn eines Nagetiers mit einer Quarz-Mikronadel mit Löchern. Die Mikronadel wird an einer Spritze und einer Mikropumpe befestigt, um die Fördermenge zu steuern. Die Nadel mit der Injektionslösung wird mit niedriger Einführgeschwindigkeit in das Gehirn eingeführt. Einmal positioniert, wird die Liefergeschwindigkeit erhöht.

Mikroinjektion des Gehirns von Nagetieren mit einer Quarz-Mikronadel

Nagetiere sind ein geeignetes Modell, um die molekularen Substrate von Verhalten und komplexen psychiatrischen Störungen zu untersuchen. Die Mikroinjektion des Gehirns bei wachen Nagetieren kann zur Aufklärung von Krankheitssubstraten verwendet werden. Es wird eine effiziente und anpassbare Mikroinjektionsmethode für das Gehirn sowie die Ausführung eines operanten Paradigmas vorgestellt, das die Motivation quantifiziert.

Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Mikroinjektion im Nagetier Gehirn, das Quarz-Nadeln verwendet. Diese Nadeln nicht nachweisbar Gewebeschäden zu produzieren und zuverlässige Lieferung auch in tiefen Regionen zu gewährleisten. Darüber hinaus können sie Forschungsbedarf durch personifizierte Entwürfe angepasst und können wiederverwendet werden.

Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn

Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Der Zebrabärbling ist ein Modell, das hat viele wertvolle Eigenschaften einschließlich optischen Klarheit, schnelle externe Entwicklung und von besonderer Bedeutung auf dem Gebiet der Gehör und Gleichgewicht befindet sich extern sensorischen Haarzellen. Dieser Artikel beschreibt wie transgene Zebrafisch Haarzelle Mechanosensation und präsynaptischen Funktion in toto assay genutzt werden.

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Wir präsentieren ein Mikroinjektionssystem für die Elektrophysiologie und die unterstützte Lieferung von experimentellen Sonden (d. h. Nanosensoren, Mikroelektroden) mit optionaler Medikamenteninfusion. Weit verbreitete mikrofluidische Komponenten sind mit einer Kanüle gekoppelt, die die Sonde enthält. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Mikroinjektionskonstruktion ist enthalten, mit Ergebnissen während der Muscimol-Infusion in Makaken-Kortex.

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