Name: Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Mitochondrien aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben für die Analyse respiratorischer Superkomplexe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der OXPHOS-Systemorganisation.

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Diese Arbeit wurde durch die Fördernummer "PGC2018-095795-B-I00" des Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) und durch die Fördernummer "Grupo de Referencia: E35_17R" und die Fördernummer "LMP220_21" der Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) an PF-S und RM-L unterstützt.

Mitochondriale Fraktionierung in kleinen Gewebeproben für die superkomplexe Analyse

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
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<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die methodischen Anpassungen, die in den hier beschriebenen Protokollen eingeführt wurden, zielen darauf ab, Verluste zu vermeiden und die Ausbeute zu erhöhen, während die Aktivitäten des mitochondrialen Komplexes erhalten bleiben (was entscheidend ist, wenn die Verfügbarkeit ausreichender Probenmengen beeinträchtigt ist) und das erwartete Muster von SCs des Gewebes oder der Zelllinie reproduziert wird (siehe Abbildung 2C). Zu diesem Zweck und da eine hohe mitochondriale Reinheit nicht erforderlich ist, um die SCs richtig zu detektieren, wurden die Anzahl der Schritte, Zeiten und Volumina reduziert, wann immer dies möglich war.
So werden nach der Homogenisierung und Entfernung von Zellkernen und ungebrochenen Zellen durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit die Überstände, die die Mitochondrien enthalten, in 1,5 mL Polypropylen-Röhrchen überführt, und die nachfolgenden Zentrifugationen zur Gewinnung der rohen mitochondrialen Fraktionen werden in einer Mikrofuge durchgeführt, indem die Geschwindigkeit erhöht und die Zeiten und Volumina im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen reduziert werden. Dies ermöglicht die Verarbeitung mehrerer Proben in relativ kurzer Zeit: Eine genaue Schätzung ist, dass 10 Proben in ~2-2,5 h verarbeitet werden können (vom Beginn der Homogenisierung (Protokollschritt 1.6. oder gleichwertig für Gewebe) bis zur Gewinnung der SCs-Fraktion, die bereit ist, in ein Gel geladen zu werden (Protokollschritt 3.7) und minimiert die Verluste bei gleichbleibender Aktivität. Eine weitere Änderung gegenüber den ursprünglichen Protokollen der Schägger-Gruppe besteht darin, dass nach der Membransolubilisierung zur Gewinnung der SCs-Fraktion ein Ultrazentrifugationsschritt durch eine einfache Mikrofugenzentrifugation ersetzt wird (Protokollschritt 3.4).
Es gibt einige kritische Schritte in diesem Verfahren. Erstens, die Effizienz des Zellbruchs, insbesondere bei kultivierten Zellen (siehe Anmerkung nach Protokollschritt 1.8) und insbesondere bei kleinen Zellen. Gewebe und Zelllinien weisen einen unterschiedlichen Schwierigkeitsgrad beim Zellbruch auf: Im Herzen und im Muskel ist dieser Schritt beispielsweise in der Regel weniger effizient als in der Leber oder Milz, aber er wird in der Ausbeute kompensiert, da erstere einen höheren Mitochondriengehalt haben. Eine Alternative zur Verbesserung der mitochondrialen Ausbeute bei Isolierung aus Muskeln oder Herzen wäre die Behandlung von Proben mit Trypsin vor der Homogenisierung. Das Gehirn ist ein weiteres Gewebe, das aufgrund der manuellen Homogenisierung, die milder und weniger effizient ist, und wahrscheinlich auch aufgrund der höheren Variation der Zelltypen in diesem Gewebe, wie bereits berichtet wurde, eine geringe Effizienz beim Zellbruch aufweist 42. Dies kann teilweise durch einen zweiten Homogenisierungsschritt kompensiert werden, wie in unserem Protokoll vorgeschlagen (Schritt 2.7.4). Auf der anderen Seite, wenn der Zellbruch übermäßig ist, könnte die endgültige Probe, die SCs enthält, mit nuklearen DNA-Fragmenten kontaminiert sein, die den elektrophoretischen Ablauf beeinträchtigen können. Dieses Problem zeigt sich in einer Erhöhung der Viskosität der Probe bei Zugabe von Digitonin zur Solubilisierung der Mitochondrienmembranen und kann durch Behandlung mit DNAse I gelöst werden.
Zweitens, wenn das Detergenz-zu-Protein-Verhältnis zu niedrig ist, würde dies zu einer weniger effizienten Membransolubilisierung und der Möglichkeit der Aggregatbildung führen. Dies könnte sich in den Gelen als schlechte Auflösung in hochmolekularen SCs zeigen (siehe Abbildung 4) oder als CIV, das mehrere Banden ergibt, die den Oligomeren43 entsprechen. Ist das Verhältnis zu hoch, kann dies zu einer Disaggregation von SCs (hauptsächlich CI-SCs) führen. Drittens ist es wichtig, das Erhitzen der Proben während des gesamten Verfahrens zu vermeiden (siehe Abbildung 4) und wiederholte Zyklen des Einfrierens und Auftauens zu vermeiden, da dies den Status der SC-Assemblierung beeinträchtigen kann.
In Tabelle 2 ist eine Zusammenfassung der erwarteten Erträge für verschiedene Zelltypen und Gewebeproben dargestellt. Die Werte sind ungefähre Angaben und hängen von der Effizienz des Zellbruchs und der Art der Quelle ab. Bei Geweben führt das Einfrieren des Ausgangsmaterials tendenziell zu einer höheren Ausbeute als bei frischen Proben. Es wird eine Abschätzung der Anzahl der Lanes (unter Berücksichtigung einer Belastung zwischen 50 und 60 μg mitochondrialem Protein pro Lane) vorgestellt, die geladen werden können.
Die hier vorgestellten Protokolle decken eine Vielzahl von Geweben und Zelltypen mit geringen Variationen ab, sie können mit frischen oder gefrorenen Proben verwendet werden und erfordern eine einfache Ausrüstung und relativ niedrige Kosten, ohne dass teure Aufreinigungskits oder Gradienten verwendet werden müssen. Sie benötigen jedoch möglicherweise einige Anpassungen, um mit bestimmten Zelltypen oder Proben verwendet zu werden, sowie wenn spezifische mitochondriale Populationen, wie z. B. synaptische Mitochondrien des Gehirns oder subsarkolemmale Mitochondrien der Muskeln, zum Beispiel, Gegenstand der Analyse sind.
Da die genaue physiologische Rolle sowie die mögliche Beteiligung von SCs an pathologischen Situationen noch definiert werden müssen, ist die Analyse ihrer Dynamik und der Faktoren, die ihre Assemblierung, Stabilität und Funktion beeinflussen, erforderlich. Unsere Protokolle können wertvolle Werkzeuge darstellen, die es ermöglichen, reproduzierbare Ergebnisse an den SCs-Mustern mit kleinen Probengrößen und aus einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben zu erhalten, insbesondere wenn mehrere experimentelle Bedingungen verglichen werden müssen29.

Superkomplexe (SCs) sind supramolekulare Assoziationen zwischen einzelnen Komplexen der Atmungskette 1,2. Seit der erstmaligen Identifizierung von SCs und der Beschreibung ihrer Zusammensetzung durch die Gruppe von Schägger 2,3, die später von anderen Gruppen bestätigt wurde, wurde festgestellt, dass sie die respiratorischen Komplexe I, III und IV (CI, CIII bzw. CIV) in unterschiedlichen Stöchiometrien enthalten. Es können zwei Hauptpopulationen von SC definiert werden: solche, die CI enthalten (und entweder CIII allein oder CIII und CIV) und mit sehr hohem Molekulargewicht (MW, beginnend mit ~1,5 MDa für die kleinere SC: CI + CIII2) und solche, die CIII und CIV, aber nicht CI enthalten, mit viel kleinerer Größe (wie CIII2 + CIV mit ~680 kDa). Diese SCs koexistieren in der inneren Mitochondrienmembran mit freien Komplexen, ebenfalls in unterschiedlichen Anteilen. Während CI also hauptsächlich in seinen assoziierten Formen vorkommt (d. h. in SCs: ~80 % im Rinderherz und mehr als 90 % in vielen menschlichen Zelltypen)3, ist CIV in seiner freien Form sehr häufig (mehr als 80 % im Rinderherzen), wobei CIII eine ausgewogenere Verteilung aufweist (~40 % in seiner häufigeren freien Form, als Dimer, im Rinderherz).
Während ihre Existenz heute allgemein anerkannt ist, wird ihre genaue Rolle immer noch diskutiert 4,5,6,7,8,9,10. Nach dem Plastizitätsmodell können je nach Zelltyp oder Stoffwechselstatus unterschiedliche Anteile an SCs und einzelnen Komplexen existieren 1,7,11. Dieser dynamische Charakter der Anordnung würde es den Zellen ermöglichen, den Verbrauch verfügbarer Brennstoffe und die Effizienz des oxidativen Phosphorylierungssystems (OXPHOS) als Reaktion auf Umweltveränderungen zu regulieren 4,5,7. SCs könnten auch dazu beitragen, die Erzeugungsrate der reaktiven Sauerstoffspezies zu kontrollieren und an der Stabilisierung und dem Umsatz einzelner Komplexeteilzunehmen 4,12,13,14. Modifikationen des SC-Assemblierungsstatus wurden im Zusammenhang mit verschiedenen physiologischen und pathologischen Situationen15,16 und mit dem Alterungsprozess17 beschrieben.
So wurden Veränderungen in den SC-Mustern in Hefe in Abhängigkeit von der für das Wachstum verwendeten Kohlenstoffquellebeschrieben 2 und in kultivierten Säugetierzellen, wenn Glukose durch Galaktose substituiert wird4. Modifikationen wurden auch in der Leber von Mäusen nach dem Fasten berichtet8 und in Astrozyten, wenn die mitochondriale Fettsäureoxidation blockiert ist18. Darüber hinaus wurde eine Abnahme oder Veränderung von SCs und OXPHOS bei Barth-Syndrom19, Herzinsuffizienz20, mehreren metabolischen21 und neurologischen 22,23,24 Erkrankungen und verschiedenen Tumoren 25,26,27,28 festgestellt. Ob diese Veränderungen in der SC-Assemblierung und -Spiegel eine primäre Ursache oder sekundäre Effekte in diesen pathologischen Situationen darstellen, wird noch untersucht15,16. Unterschiedliche Methoden können Aufschluss über den Aufbau und die Funktion von SCs geben; Dazu gehören Aktivitätsmessungen 8,29, Ultrastrukturanalyse30,31 und Proteomik32,33. Eine nützliche Alternative, die zunehmend eingesetzt wird und den Ausgangspunkt für einige der zuvor genannten Methoden bildet, ist die direkte Bestimmung des SC-Assemblierungsstatus mittels Blue Native (BN) Elektrophorese, die zu diesem Zweck von Schäggers Gruppe34,35 entwickelt wurde.
Dieser Ansatz erfordert reproduzierbare und effiziente Verfahren zur Gewinnung und Solubilisierung von Mitochondrienmembranen und kann durch andere Techniken wie In-Gel-Aktivitätsanalyse (IGA), Second-Dimension-Elektrophorese und Western Blot (WB) ergänzt werden. Eine Einschränkung in den Untersuchungen zur SC-Dynamik mittels BN-Elektrophorese kann die Menge der Ausgangszellen oder Gewebeproben sein. Wir stellen eine Reihe von Protokollen für die Analyse der SC-Assemblierung und -Funktion vor, die von den Methoden der Schägger-Gruppe adaptiert wurden und auf frische oder gefrorene Zell- oder Gewebeproben ab nur 20 mg Gewebe angewendet werden können.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Aminocapronsäure</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Assay</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino&nbsp; Benzidin (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Fettsäurefrei BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator Teflon</td><td>Stößel Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Monoklonaler Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 bis 12% Mini-Proteingele</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Kathodenpuffer-Additiv (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Laufpuffer (20x)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 Monoklonaler Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF-Membran</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Phenazinmethasulfat (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL-Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td></td><td>Merck PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Monoklonaler Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin/Penicillin</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 monoklonaler Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von mitochondrien für die mitochondriale superkomplexanalyse aus kleinen gewebe- und zellkulturproben 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

In den letzten Jahrzehnten haben die gesammelten Beweise für die Existenz von respiratorischen Superkomplexen (SCs) unser Verständnis der Organisation der mitochondrialen Elektronentransportkette verändert, was zu dem Vorschlag des "Plastizitätsmodells" führte. Dieses Modell postuliert die Koexistenz unterschiedlicher Anteile von SCs und Komplexen in Abhängigkeit vom Gewebe bzw. dem zellulären Stoffwechselstatus. Die dynamische Natur der Anordnung in SCs würde es den Zellen ermöglichen, die Nutzung der verfügbaren Brennstoffe und die Effizienz des Elektronentransfers zu optimieren, die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies zu minimieren und die Fähigkeit der Zellen zur Anpassung an Umweltveränderungen zu begünstigen. 
In jüngerer Zeit wurden Anomalien in der SC-Assemblierung bei verschiedenen Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer und Parkinson), Barth-Syndrom, Leigh-Syndrom oder Krebs berichtet. Die Rolle von Veränderungen der SC-Assemblierung bei der Krankheitsprogression muss noch bestätigt werden. Dennoch ist die Verfügbarkeit ausreichender Mengen an Proben zur Bestimmung des SC-Montagestatus oft eine Herausforderung. Dies geschieht bei Biopsie- oder Gewebeproben, die klein sind oder für mehrere Analysen geteilt werden müssen, bei Zellkulturen, die ein langsames Wachstum aufweisen oder aus mikrofluidischen Geräten stammen, bei einigen Primärkulturen oder seltenen Zellen, oder wenn die Wirkung bestimmter kostspieliger Behandlungen analysiert werden muss (mit Nanopartikeln, sehr teuren Verbindungen usw.). In diesen Fällen ist eine effiziente und einfach anzuwendende Methode erforderlich. In dieser Arbeit wird ein Verfahren vorgestellt, das geeignet ist, angereicherte mitochondriale Fraktionen aus kleinen Mengen von Zellen oder Geweben zu erhalten, um die Struktur und Funktion mitochondrialer SCs durch native Elektrophorese zu analysieren, gefolgt von In-Gel-Aktivitätsassays oder Western Blot.

Die Ausbeuten an Mitochondrien, die nach den oben beschriebenen Protokollen erhalten werden, variieren in Abhängigkeit von mehreren Faktoren, wie z. B. der Zelllinie oder dem Gewebetyp, der Art der Proben (d. h. ob frisches oder gefrorenes Gewebe verwendet wird) oder der Effizienz des Homogenisierungsprozesses. Die erwarteten Erträge an Mitochondrien aus verschiedenen Zelllinien und Geweben sind in Tabelle 2 aufgeführt. Sobald die mitochondrialen Fraktionen erhalten wurden, ist der nächste Schritt die Analyse des respiratorischen SCs-Musters, die nach der Solubilisierung der mitochondrialen Rohprobe und der elektrophoretischen Trennung durch BN-PAGE durchgeführt wird, gefolgt von einer IGA-Analyse oder WB-Immundetektion. Abbildung 1 zeigt das Aussehen der ungefärbten Gelbahnen unmittelbar nach dem Lauf und das Muster der Banden nach der Standard-Coomassie-Färbung einer kultivierten Zelllinie und einer mitochondrialen Leberprobe der Maus.
In Abbildung 2A,B sind deutliche Unterschiede zwischen den SC-Assemblierungsmustern in humanen und Mauszellen nach Verwendung von IGA-Assays zu sehen. So wird der freie Komplex I in Mauszellen beobachtet, während er in menschlichen Mitochondrien nicht nachweisbar ist. Das komplexe IV-IGA-Muster ist in beiden menschlichen Zelllinien sehr ähnlich (Abbildung 2B), weist jedoch Unterschiede zwischen den beiden in Abbildung 2A analysierten Mauszelllinien auf. Diese Unterschiede sind darauf zurückzuführen, dass BL6-Zellen eine mutierte Variante von SCAF18 exprimieren.
Die SC-Muster, die mit dem hier beschriebenen Protokoll für die mitochondriale Isolierung für die Arbeit mit kleinen Proben erhalten wurden, werden in Bezug auf die "konventionellen" Protokolle, die für größere Proben verwendet werden, beibehalten. Dies ist in Abbildung 2C zu sehen, indem die Spuren 1 und 6 (nach mitochondrialer Isolierung unter Verwendung eines konventionellen Protokolls aus 3 g Leber und 1,1 g BVT gewonnen) mit den Spuren 2 und 5 (erhalten unter Verwendung der hier vorgestellten Protokolle aus etwa 0,1 g beider Gewebe) verglichen werden. Wie im Plastizitätsmodell vorgeschlagen, variiert der relative Anteil von respiratorischen Komplexen und SCs je nach Zelltyp und Stoffwechselzustand. Wie in Abbildung 2C,D gezeigt, zeigen die verschiedenen Gewebe unterschiedliche SC-Assemblierungsmuster. So weisen die Mitochondrien des Gehirns im Vergleich zu den anderen Geweben einen sehr niedrigen Gehalt an freiem Komplex I und einen höheren Anteil an SCs auf, und BAT zeichnet sich durch niedrige CV-Spiegel (Abbildung 2A) und hohe Mengen an SC III + IV (Abbildung 2D) aus. Herzmitochondrien weisen ein hohes Maß an SCs und CV auf. Die CV-Assemblierungsmuster sind zwischen der kultivierten Zelllinie und einer mitochondrialen Leberprobe der Maus sehr ähnlich (Abbildung 2E).
Die SC-Assemblierung kann auch mittels WB analysiert werden, wie in Abbildung 3 für zwei Proben aus Milzkontroll- und Tumorzellen gezeigt. In diesem Fall reichen in der Regel 30-50 μg mitochondriales Protein aus, um die verschiedenen Komplexe und SCs mit den spezifischen Antikörpern nachzuweisen. Abbildung 4 zeigt einige der wichtigsten Fallstricke, die bei der Anwendung dieser Protokolle auftreten können. Falsche Gelgradienten können zu abnormalen und unerwünschten Migrationsmustern führen, wie in Abbildung 4A, Spur 1, wo die SCs aufgrund einer überdurchschnittlich hohen Acrylamidkonzentration im Gel in der Nähe der Vertiefung im oberen Teil der Spur verbleiben. Die Inkubation der Proben, auch für relativ kurze Zeiträume, bei hohen Temperaturen (hier 37 °C und 40 °C für 10 min) führt zu einer Degradation von SCs und CI (Abbildung 4A , Fahrspuren 2-4). Ebenso ist das Waschmittel-Protein-Verhältnis entscheidend für gute Ergebnisse und eine angemessene Gelauflösung. Unterhalb eines Verhältnisses von 2 g Digitonin/g Protein wird die Bandenauflösung progressiv reduziert und bei der niedrigeren Konzentration (0,5 g/g) ist nur ein Abstrich im Bereich sichtbar, der den SCs entspricht (Abbildung 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> Abbildung 1: Muster der mitochondrialen Komplexe und Superkomplexe nach BNGE-Trennung von Digitonin-permeabilisierten Mitochondrien aus einer Kulturzelllinie (L929Balbc) und Mausleber. Die Spuren auf der linken Seite (1 und 2) stellen das Aussehen des ungefärbten Gels kurz nach dem Lauf dar, bei dem nur CV nachweisbar ist, während die Spuren auf der rechten Seite (3 und 4) das Muster der Banden nach der Coomassie-Färbung zeigen. Abkürzungen: BNGE = Blue Native Gelelektrophorese; CV = Komplex V; SCs = Superkomplexe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> Abbildung 2: IGA-Analyse von Mitochondrien, die aus verschiedenen Zelllinien und Mausgeweben isoliert wurden. (A,B) In-Gel-Aktivität der angegebenen Komplexe in Mitochondrien, die aus (A) Maus- oder (B) humanen Zelllinien isoliert wurden. L929Balbc ist eine transmitochondriale Zelllinie, die in unserem Labor durch Übertragung von Mitochondrien aus Balb/cJ-Mausplättchen auf ρ°L929neo-Zellen erzeugt wird, wie zuvor beschrieben40,41. BL6-Fibroblasten sind eine immortalisierte Zelllinie, die in unserem Labor aus einer Ohrbiopsie einer BL6-Maus gewonnen wurde. (C) CI-IGA-Muster aus Mitochondrien von Mäusen, die entweder mit einer konventionellen Methode beginnend mit 3 g Leber (Spur 1) und mit 1,1 g BAT (Spur 6) oder mit dem hier vorgestellten Protokoll isoliert wurden und in allen Fällen mit etwa 0,1 g Gewebe beginnen (Spur 2, Leber; Spur 3, Herz; Spur 4, Gehirn und Spur 5 BAT). (D) CIV-IGA-Muster (durchgeführt nach CI-IGA, gezeigt in Panel 2C, Spuren 2-5) in Leber, Herz, Gehirn und BAT-Mitochondrien von Mäusen. (E) CV-IGA-Aktivität, analysiert in kultivierten Zellen und Lebern von Mäusen. Etwa 60-75 μg mitochondriales Protein pro Spur wurden geladen. Abkürzungen: IGA = In-Gel-Aktivität; SCs = Superkomplexe; CI = Komplex I; BAT = braunes Fettgewebe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> Abbildung 3: WB-Immundetektion der verschiedenen mitochondrialen Komplexe und Superkomplexe in Milzproben. Nach der Blue Native PAGE-Trennung von mitochondrialen Komplexen und SCs, die aus Milzkontroll- (Milz M9) und Tumorproben (Tumor M9) gewonnen wurden, wurden sie auf eine PVDF-Membran übertragen und sequentiell mit Antikörpern hybridisiert, die die angegebenen CI-, CIII-, CIV- und CII-Untereinheiten erkennen (Panels A-D). Pro Spur wurden etwa 50 μg mitochondriales Protein geladen. Sternchen zeigen das Signal an, das von einem früheren Western Blot übrig geblieben ist. Abkürzungen: SC = Superkomplex; CI = Komplex I; CIII = Komplex III; CIV = Komplex IV; CII = Komplex II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Fallstricke bei der SC-Analyse durch Blue-Native PAGE. CI IGA-Analyse von Mitochondrien, die aus (A) frischer Mausleber und (B) gefrorener Rattenleber unter verschiedenen Solubilisierungsbedingungen isoliert wurden. (A) Spur 1, falsche Gelgradientenkonzentration (8-13% statt der normalen 3-13%). Bahnen 2-4: Die Proben wurden vor dem Laden 10 Minuten lang auf Eis oder bei 37 °C bzw. 40 °C inkubiert. (B) Muster nach IGA für CI von Mitochondrien, die aus gefrorener Rattenleber unter Verwendung unterschiedlicher Digitonin/Protein-Verhältnisse für die Solubilisierung gewonnen wurden. Abkürzungen: SC = Superkomplex; PAGE = Elektrophorese des Polyacrylamid-Gels; CI = Komplex I; IGA = In-Gel-Aktivität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mittel</td>
			<td colspan="3">Zusammensetzung</td>
		</tr><tr><td>Hypotonischer Puffer</td>
			<td colspan="3">10 mM MOPS, 83 mM Saccharose, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Hypertonischer Puffer</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM Saccharose, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Homogenisierungs-Puffer A</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M Saccharose, pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Homogenisierungspuffer AT</td>
			<td colspan="3">225 mM Mannitol, 1 mM EGTA, 75 mM Saccharose, 0,01 % BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Homogenisierungspuffer AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM Mannitol, 1 mM EGTA, 75 mM Saccharose, 0,02% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>BN Probenpuffer</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 2 mM Aminocapronsäure, 1 mM EDTA pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Digitonin-Lösung</td>
			<td colspan="3">10% Digitonin in 50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 5 mM Aminocapronsäure, 4 mM PMSF</td>
		</tr><tr><td>BN-Ladepuffer</td>
			<td colspan="3">5% Coomassie Blue G in 0,75 M Aminocapronsäure</td>
		</tr><tr><td>BN Kathodenpuffer A</td>
			<td colspan="3">50 mM Tricin, 15 mM Bis-Tris pH = 7,0 (4 °C), 0,02 % G-250 (Coomassie Brillantblau G-250)</td>
		</tr><tr><td>BN Kathodenpuffer B</td>
			<td colspan="3">50 mM Tricin, 15 mM Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250</td>
		</tr><tr><td>BN-Anodenpuffer</td>
			<td colspan="3">50 mM Bis-Tris, pH=7,0</td>
		</tr><tr><td>Komplex I IGA-Substrat</td>
			<td colspan="3">5 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL NADH, 2,5 mg/mL Nitroblue Tetrazolium (NBT)</td>
		</tr><tr><td>Komplex II IGA-Substrat</td>
			<td colspan="3">50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4, 20 mM Natriumsuccinat, 0,2 mM Phenazinmethosulfat (PMS), 2,5 mg/mL NBT</td>
		</tr><tr><td>Komplex III IGA-Substrat</td>
			<td colspan="3">50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,2, 0,05 % Diaminobenzidin (DAB)</td>
		</tr><tr><td>Komplexes IV IGA-Substrat</td>
			<td colspan="3">Gleiche Lösung wie CIII plus 50 μM Cytochrom c</td>
		</tr><tr><td>Komplexes V IGA-Substrat</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM Glycin pH 8,3, 14 mM MgSO4, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>Lösung zum Färben</td>
			<td colspan="3">Coomassie-Farbstoff R-250 mit 0,25 % in 40 % Methanol und 10 % Essigsäure</td>
		</tr><tr><td>Entfärbungs-/Fixierlösung</td>
			<td colspan="3">40% Methanol, 10% Essigsäure</td>
		</tr><tr><td>Puffer übertragen</td>
			<td colspan="3">48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20% Methanol</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Puffer und Medienzusammensetzung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Zelltyp/Gewebe</td>
			<td>Ausgangsbetrag</td>
			<td>Erwartete Ausbeute (μg mitochondriales Protein)</td>
			<td>Anzahl der Bahnen (50-60 μg/Bahn)</td>
		</tr><tr><td>Kultivierte Zellen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468</td>
			<td>100 μl vpc</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>143B-abgeleitet</td>
			<td>100 μl vpc</td>
			<td>200-350 μg</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>Fibroblasten der Maus</td>
			<td>100 μl vpc</td>
			<td>150-200 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>Herz</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>Skelettmuskulatur</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>Leber</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>Milz</td>
			<td>50 mg</td>
			<td>150-250 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>FLEDERMAUS</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>200-300 μg</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>Gehirn</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>250-300 μg</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Erwartete Erträge von Mitochondrien aus verschiedenen Zelltypen und Mausgeweben. Die mitochondrialen Fraktionen, die aus dem Herz- oder Skelettmuskel gewonnen werden, sind reiner als die aus anderen Geweben gewonnenen. So können kleinere Mengen in die Gele geladen werden (*).

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Analyse von respiratorischen Superkomplexen, wenn nur geringe Mengen an Proben zur Verfügung stehen.

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf ein besseres Verständnis der mitochondrialen Biogenese, insbesondere der Organisation und Regulation des OXPHOS-Systems, sowie auf die Definition der Rolle, die Mitochondrien bei Krankheiten von Krebs bis hin zu neurodegenerativen Erkrankungen spielen. Mitochondrien spielen mehrere und wesentliche Rollen in der Zelle und beeinflussen ihren gesamten Stoffwechsel und ihr Überleben. Wir erweitern langsam unser Wissen über die mitochondriale Komplexität und ihren Beitrag zu den Zellanpassungsmechanismen bei Gesundheit und Krankheit.Wir haben dazu beigetragen, ein neues Organisationsmodell für das OXPHOS-System zu etablieren, das Plastizitätsmodell, das frühere Vorschläge integriert und die Koexistenz von Superkomplexen und freien Komplexen in unterschiedlichen Anteilen vorausgeht, um seine Funktion zu optimieren und zelluläre Anpassungen zu ermöglichen. Unser Protokoll ermöglicht es, ausgehend von kleinen Geweben oder Zellkulturproben genügend mitochondriale Proteinmengen zu erhalten, um die Assemblierung, den Status und die Funktion von Superkomplexen durch blaue native Elektrophorese oder andere Techniken zu analysieren. Dies können wir in kurzer Zeit mit einer einfachen Ausrüstung und relativ geringen Kosten reproduzierbar tun.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video beschreibt das Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus menschlichem Eierstockkrebsgewebe mittels Differential-Speed-Zentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation. Die isolierten Mitochondrien können für die proteomische Analyse des mitochondrialen Proteoms des menschlichen Eierstockkarzinoms verwendet werden.

Mitochondriale Isolierung: Eine Technik zur Isolierung von Mitochondrien aus Gewebeproben von menschlichem Eierstockkrebs

Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit &lt;30 min im Vergleich zu 60 bis 100 min mit alternativen Methoden.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Der Vergleich des mitochondrialen Membranpotentials zwischen Proben liefert wertvolle Informationen über den zellulären Status. Detaillierte Schritte zur Isolierung von Mitochondrien und zur Beurteilung des Ansprechens auf Inhibitoren und Entkoppler mittels Fluoreszenz werden beschrieben. Die Methode und der Nutzen dieses Protokolls werden anhand eines Zellkultur- und Tiermodells für zellulären Stress veranschaulicht.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Hier präsentieren wir eine Modifikation einer zuvor berichteten Methode, die die Isolierung von qualitativ hochwertigen und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Verfahren führt zu hochgradig gekoppelten Mitochondrien, die während mikrotiterplattenbasierter Respirometirc-Assays mit hoher Funktion atmen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Da Mitochondrien nur ein kleiner Prozentsatz der Pflanzenzelle sind, benötigen sie für eine Reihe von Studien gereinigt werden. Mitochondrien können aus einer Vielzahl von Pflanzenorganen durch Homogenisierung, gefolgt von Differential und Dichte Gradienten Zentrifugation zu einem hochgereinigten mitochondriale Bruchteil isoliert werden.

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondrien haben Ribosomen spezialisiert, die von bakteriellen und zytoplasmatischen Gegenstücke abwich. Hier zeigen wir, wie Mitoribosomes ihre native Fach in HEK Zellen entnommen werden können. Die Methode besteht darin, Isolierung von Mitochondrien aus Aussetzung Zellen und konsequente Reinigung der Mitoribosomes.

Schnelle Isolierung von Mitoribosome von HEK Zellen

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Wir präsentieren ein zweistufiges Protokoll für die qualitativ hochwertige Isolierung von Mitochondrien, das mit der Entdeckung und Quantifizierung von Proteinen auf Proteomebene kompatibel ist. Unser Protokoll kommt ohne Gentechnik aus und eignet sich daher für die Untersuchung von Mitochondrien aus allen primären Zellen und Geweben.

Zweistufige tag-freie Isolierung von Mitochondrien für eine verbesserte Proteinentdeckung und -quantifizierung

Bioenergetische und metabolomische Studien an Mitochondrien haben ihre facettenreiche Rolle bei vielen Krankheiten gezeigt, aber die Isolierungsmethoden für diese Organellen variieren. Die hier beschriebene Methode ist in der Lage, hochwertige Mitochondrien aus mehreren Gewebequellen zu reinigen. Die Qualität wird durch Atemkontrollverhältnisse und andere Metriken bestimmt, die mit hochauflösender Respirometrie bewertet werden.

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren 

Erfahren Sie die Isolierung von Mitochondrien aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben für die Analyse respiratorischer Superkomplexe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der OXPHOS-Systemorganisation.

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben

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