Name: Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung humaner Thymus-Organoide in 3D-Fibrin-Hydrogelen zur Untersuchung von Selbsttoleranz und Autoimmunität. Diese Methode unterstützt die Reifung thymischer Epithelzellen für sechs Wochen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Nachbildung der Thymus-Mikroumgebung mit iPSC-abgeleiteten Organoiden

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
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<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+thymus+and+its+impact+on+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The function of the thymus and its impact on modern medicine.</a> Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).</li>
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<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
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<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
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<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
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<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
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<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
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<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
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<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klon: 3D12; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>Klon: M5E2; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klon: HIB19; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>BioLegend</td><td>FITC</td><td>Klon: MG38; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klon: HIT3a; Verdünnung: 1: 200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>Klon: 8G12; Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klon: RPA-T4; Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>Klon: L200; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>Klon: HI30; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klon: B159; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td><td>Klon: DREG-56; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD</td><td>Biosciences BV510</td><td>Klon: FN50; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td>APC</td><td>Klon: M-T701; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PeCy7</td><td>Klon: RPA-T8; Verdünnung: 1:200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klon: HIT8a; Verdünnung: 1: 200</td></tr><tr><td>Dynabeads Pan Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Klon: HEA-125; Verdünnung: 1: 200</td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>Klon: EBA-1; Verdünnung: 1: 200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R& D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RANK L</td><td>Biotechne R& D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>Lösung zur Lyse roter Blutkörperchen</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

bildung humaner thymus-organoide in dreidimensionalen fibrin-hydrogelen

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Der Arbeitsablauf des Protokolls ist in Abbildung 4 zusammengefasst. Für dieses 3D-Organoid-Kulturmodell verwendeten wir ein Thrombin- und Fibrinogen-Hydrogel, das zuvor von unserem Team verwendet worden war, um primäre mTECs der Maus für ein paar Tage aufrechtzuerhalten, dank der physikalischen und mechanischen Hinweise, die es lieferte34. Nach der Polymerisation sollte das Gel eine lockere, schwammartige Netzstruktur aufweisen (Abbildung 5).
Nach der anfänglichen Aussaat- und Anheftungsphase wuchsen und entwickelten sich die Organoide nach und nach sowohl an der Oberfläche als auch in den obersten Schichten des Gels. Abhängig von den Eigenschaften des Gels, den Aussaatbedingungen und der Anzahl der auf dem Gel ausgesäten Organoide bildeten die Organoide kugelförmige bis längliche Strukturen (Abbildung 6) und verschmolzen gelegentlich zu größeren Strukturen. Nach der ersten Kulturwoche wurden innerhalb der Organoide zwei bestimmte Unterebenen der Organisation beobachtet: Zunächst beobachteten wir lange, zelloberflächenprojektionsähnliche Strukturen, die von großen Zellen gebildet wurden, die von den Organoiden bestrahlt wurden und das Hydrogel in alle Richtungen besiedelten (Abbildung 6 und Abbildung 7). Zweitens beobachteten wir clusterartige Strukturen, die von kleineren Zellen gebildet werden, die sich um diese Zellprojektionen herum konzentrieren. Obwohl wir nicht in der Lage waren, beide Zelltypen zu isolieren, um die Hypothese der Studie zu bestätigen, erinnert dieses Phänomen an 3D-Anordnungen, die im thymischen Kortex zu finden sind und durch die Interaktion einzelner cTECs mit einer großen Anzahl viel kleinerer sich entwickelnder T-Zellen gebildet werden, die als thymusische Ammenzellkomplexe bekannt sind11 (Abbildung 8).
Zu mehreren Zeitpunkten während der Organoid-Kulturphase untersuchten wir die zelluläre Zusammensetzung der Thymus-Organoide mittels Durchflusszytometrie und identifizierten mehrere Schlüsselkompartimente: TEC (charakterisiert als EPCAM+ CD45-), Thymozyten (EPCAM-CD45+ CD3+) (Abbildung 9) sowie ein EPCAM-CD45+ CD3-Kompartiment, das aus thymushämatopoetischen Nicht-Thymozyten-Untergruppen besteht. Weitere Details finden sich in Provin et al.23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> Abbildung 1: Charakterisierung der Differenzierung von iPSC zu TEP. (A) Beispiel für eine Differenzierung von iPSC zu TEP am D13, inverses Phasenkontrastmikroskop, 400x. Maßstabsbalken: 500 μm. (B) Beispiel für ein Dotplot, das Verhältnis von EPCAM+-Zellen zu DAPI-Zellen am Tag 14 der Differenzierung, Bild von FlowJo 10.0.7. (C) Immunfärbung gegen DAPI (blau), PAX9 (rot) und KRT8 (grün), Immunfluoreszenz und konfokale Bildgebung am Tag 16 der Differenzierung von iPSC zu TEP. Weiße Pfeile zeigen auf Beispiele für Anti-PAX9-Färbungen. Skalenbalken: 50 μm (D) Expressionsniveau von FOXN1 (RQ bis GAPDH) während der Differenzierung von iPS zu TEP. TEC: Positivkontrollreferenz, primäre humane TECs, die aus pädiatrischen Thymusproben isoliert wurden. Diagramm von Prism (GraphPad Version 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> Abbildung 2: Versuchsaufbau für die Hydrogelbildung, die Aussaat von Organoiden und die Verteilung des Kulturmediums. (A) Kulturplatte mit Hydrogelen, die in hängende Einsätze gegossen werden, die in der oberen und unteren Reihe platziert sind. (B) Organoid-Aussaat: Der geschnittene Pipettenkegel, der 1 Organoid enthält, wird über das Hydrogel gelegt, ohne es zu berühren, und das Organoid wird vorsichtig an der Oberfläche des Gels ausgesät. (C) Das Nährmedium wird in die Kulturvertiefung eingebracht, indem die Spitze der Pipette zwischen den Armen des hängenden Einsatzes positioniert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> Abbildung 3: D0 der Thymus-Organoidkultur vor der Aussaat (Tage 13-15 des vollständigen Protokolls). (A) Organoid, das mit TECs hergestellt wurde, die von der Lon71.019 iPS-Linie abgeleitet sind. (B) Organoid, hergestellt mit TECs, die von der iPS-Linie MIPS203,003 abgeleitet sind. Inverses Phasenkontrastmikroskop, 1000x. Maßstabsleisten: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> Abbildung 4: Zusammengefasste Darstellung aller Schritte des Protokolls. Pädiatrische Thymusproben wurden entnommen und dissoziiert, und primäre Lin-CD34+ CD7+ ETPs wurden mittels Durchflusszytometrie sortiert. Die Differenzierung der iPS-Zellen erfolgte in Richtung einer TEP-Identität. ETPs und iPS-abgeleitete TEPs wurden gepoolt und in 96-Well-Platten mit geringer Bindung ausgesät und über Nacht zu Thymus-Organoiden aggregiert. Fibrin-Hydrogele wurden aus Aprotinin, Fibrinogen und Thrombin hergestellt und in hängende Einsätze gegossen. Nach der Polymerisation wurden die Organoide auf die Hydrogele ausgesät und das Phase-1-Kulturmedium in die Vertiefungen gegeben. Die Organoide wurden bis zu 6 Wochen in Kultur gehalten. Erstellt in BioRender, Veröffentlichungslizenz AG26EFCZOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> Abbildung 5: Organisation und Struktur des Hydrogels. Inverses Phasenkontrastmikroskop, 1000x. Maßstab: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> Abbildung 6: Reife Organoide und dreidimensionale Struktur. (A) Thymus-Organoid am Tag 24 der 3D-Kultur, MIPS203,003 iPS-Linie. (B) Kompositbild eines Thymus-Organoids am Tag 32 der 3D-Kultur, Lon71.019 iPS-Linie. Inverses Phasenkontrastmikroskop. Maßstabsleisten: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> Abbildung 7: Strukturdetail von Thymus-Organoiden. (A) Thymus-Organoid am Tag 32 der 3D-Kultur, L71.019 iPS-Linie. (B) Thymus-Organoid am Tag 27 der 3D-Kultur, L80.002 iPS-Linie. Inverses Phasenkontrastmikroskop, 400x. Maßstabsleisten: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> Abbildung 8: Strukturdetail eines Thymus-Organoids am Tag 32 der 3D-Kultur. Weiße Pfeile zeigen auf Cluster kleiner Thymozyten, die sich in unmittelbarer Nähe der TEC-Zellen vermehren. Inverses Phasenkontrastmikroskop, 400x. Maßstab: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> Abbildung 9: Anteil des T-Zell-Kompartiments innerhalb von Thymus-Organoiden. (A) Dotplot-Beispiel, Anteil von CD45+ CD3+ Zellen in lebenden (DAPI-) Zellen in Thymus-Organoiden am Tag 35 der 3D-Kultur, Bild von FlowJo 10.0.7. Die CD45+ CD3-Fraktion besteht aus hämatopoetischen Nicht-Thymozytenzellen. (B) Der Anteil von CD45+ CD3+-Zellen in lebenden Zellen in Thymus-Organoiden an den Tagen 17, 24/25, 32 und 39/40 der 3D-Kultur, n=2 in technischem Duplikat oder Triple-Plikat, Grafik von Prism (GraphPad Version 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Einheit</td>
			<td>Phase 1 mittel Tag 14 bis Tag 18</td>
			<td>Phase 2 mittel ab Tag 19</td>
		</tr><tr><td>Basis</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>RANG L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>IL7</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>SCF</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>Glutamax</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Nahrungsergänzungsmittel und ihre jeweiligen Konzentrationen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Aprotinin (μL)</td>
			<td>Thrombin (μL)</td>
			<td>Fibrinogen (μL)</td>
			<td>Phase 1 mittel</td>
			<td>Organoide (Einheit)</td>
		</tr><tr><td>24-Well-Platte</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>3 bis 5</td>
		</tr><tr><td>12-Well-Platte</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>6-Well-Platte</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>8 bis 9</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Erforderliche Verhältnisse von Komponenten für die Herstellung von Hydrogelen und die Aussaat von Organoiden in 6-, 12- und 24-Well-Platten.

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

formation-human-thymus-organoids-three-dimensional-fibrin

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video die Herstellung von 2-dGuo behandelten reaggregieren Thymus Kulturen demonstriert.

Reaggregieren Thymus Kulturen

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Anreicherung von Thymusepithelzellen (TECs) mit einem Dichtegradienten für die FACS-Isolierung. Es zeigt auch die Verwendung von EAK16-II/EAKIIH6-Peptiden zur Förderung der TEC-Aggregatbildung. Die Mikroumgebungen des Hydrogels EAK16-II/EAKIIH6 bieten die 3-D-Konfiguration, die zur Aufrechterhaltung des Überlebens und der Funktion der TECs erforderlich ist.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Darin demonstrieren wir ein dreistufiges Organoidmodell (zweidimensionale [2D]-Expansion, 2D-Stimulation, dreidimensionale [3D]-Reifung), das ein vielversprechendes Werkzeug für die Sehnengrundlagenforschung und eine potenziell gerüstfreie Methode für das Tendon Tissue Engineering bietet.

Demonstration einer selbstorganisierten Zellblattkultur und manuelle Generierung eines 3D-Sehnen-/Ligamenten-ähnlichen Organoids unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten

Dieses Protokoll beschreibt eine definierte, hydrogelbasierte Methode zur Erzeugung menschlicher Brustorganoide, die zentrale Merkmale der Mammarienmorphogenese in einem kontrollierten dreidimensionalen Kultursystem nachbilden.

Eine definierte hydrogelbasierte Methode zur Erzeugung dreidimensionaler menschlicher Brustorganoide, die die Mammarienmorphogenese rekapitulieren

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