Name: Vitrifikation des Gewebes der Ovarialrinde, um einen glasartigen Aggregatzustand zu erreichen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Vitrifikation von Ovarialgewebe zur Fruchtbarkeitserhaltung bei jungen Krebspatientinnen. Diese Methode bietet eine verbesserte Alternative zum langsamen Gefrieren und erhöht die Erfolgschancen für spätere Schwangerschaften.

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<meta charset="utf8"></head><body>Beurteilung der follikulären Viabilität in vitrifiziertem humanem Ovarialrindengewebe

<table><tbody><tr><td>1,8 mL Fläschchen</td><td>VWR International GmbH</td><td>479-6837</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>4 Well-Platte</td><td>Gynemed</td><td>GYOOPW-FW04</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.559.001</td><td></td></tr><tr><td>6 Well-Platten</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Bacillol AF</td><td>Hartmann</td><td>973385</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Merck</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 1A</td><td>Merck</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Cryosure DMSO</td><td>WAK Chemie</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie</td><td>00867288</td><td></td></tr><tr><td>DPBS CTS</td><td>Gibco Life technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne Pipettenhilfe</td><td>Starlab</td><td>S7166-0010</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Euronda Sterilisationscontainer</td><td>euronda</td><td>282021</td><td></td></tr><tr><td>G-MOPS+</td><td>Vitrolife</td><td>10130</td><td></td></tr><tr><td>Metall Netze</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Schere</td><td>Welt Präzisionsinstrumente</td><td>501262102</td><td></td></tr><tr><td>N-Bath System</td><td>Nterilizer</td><td>N-Bath 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon (PVP)</td><td>SAGE</td><td>ART-4005</td><td></td></tr><tr><td>Serumersatz Ergänzung (SSS)</td><td>Fujifilm Irvine scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tasse</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pinzette</td><td>Carl Roth</td><td>KL05.1</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrifikation des gewebes der ovarialrinde, um einen glasartigen aggregatzustand zu erreichen

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

Dieses Protokoll stellt die Verfahren für die Herstellung von Vitrifikationsmedien, Ladevorrichtungen, Vitrifikation, Herstellung von Schnellerwärmungsmedien, Schnellerwärmung und Bestimmung der Follikelviabilität vor. Ein direkter Vergleich der follikulären Viabilität und der angiogenen Faktoren zwischen langsamem Einfrieren und Vitrifikation wurde validiert und veröffentlicht31,32.
Der Gesamterfolg des beschriebenen Vitrifikationsprotokolls wurde durch den Vergleich der vitalen Follikelzahl vor und nach der Vitrifikation/schnellen Erwärmung bewertet. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt, und die Ergebnisse sind in Abbildung 6 dargestellt. Bei 50 Patienten wurde eine mittlere Anzahl von 77,98 vitalen Follikeln vor der Vitrifikation und 62,99 nach der Vitrifikation/schnellen Erwärmung beobachtet, was einer Überlebensrate von 80,8 % entspricht. Dies war nach dem Wilcoxon-Test33 nicht signifikant anders.
Metallgitter werden individuell mit einer scharfen Schere auf eine Größe von 25 mm x 8 mm angepasst, die in die Kappen von 1,8 mL-Kryoröhrchen passt, wie in Abbildung 2A,C gezeigt. Nach der Sterilisation durch Dampfautoklavieren werden die Gitter und Kappen der 1,8-ml-Fläschchen unter einer Laminar-Flow-Bank zusammengebaut, wie in Abbildung 2B dargestellt. Dieser Aufbau sorgt für einen sicheren Halt in der Kappe, ohne dass zusätzliche Handgriffe erforderlich sind, und bietet ausreichend Platz für Gewebe unterschiedlicher Größe. Typischerweise werden Gewebestücke von 5 mm x 10 mm für die Transplantation und Stücke mit einem Durchmesser von 2 mm zur Beurteilung der vitalen Follikelzahl nach schnellem Auftauen vitrifiziert. Beide Größen passen perfekt auf die Metallgitter.
Die Äquilibrierung mit Vitrifikationslösungen (VS1, VS2 und VS3) wird in einer 6-Well-Platte auf einem Wippschüttler bei Raumtemperatur unter einer Laminar-Flow-Bank durchgeführt, wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Zeitrahmen im Schema gewährleisten die effektive Aufnahme des Kryoprotektivums Ethylenglykol. Die Verwendung einer 6-Well-Platte über einzelnen Gefäßen wird empfohlen, da sie eine schnelle Bewegung des Gewebes zwischen den Lösungen ermöglicht und Verwechslungen verhindert.
Für eine schnelle vertikale Vitrifikation in flüssigem Stickstoff wird das Gewebe der Ovarialrinde in geeignete Stücke geschnitten (Abbildung 4A). Die Proben der Ovarialrinde werden auf Ladevorrichtungen gelegt (Abbildung 4B, C) und vertikal in flüssigen Stickstoff getaucht (Abbildung 4D), um durch Vitrifikation einen glasartigen Aggregationszustand zu erreichen. Die gewählten Metallgitter ermöglichen eine vertikale Handhabung des Gewebes, wie in Abbildung 4D gezeigt. Darüber hinaus sind die Metallgitter hochgradig wärmeleitfähig und sorgen für schnelle Abkühlraten von 22 °C bis -196 °C, was ein entscheidender Schritt im Vitrifikationsprozess ist.
Für eine schnelle Erwärmung wird RWS in einem sterilen Becher bei 37 °C zubereitet. ES, RS1 und RS2 werden in einer 6-Well-Platte auf einem Wippschüttler bei Raumtemperatur zubereitet, wie in Abbildung 5 gezeigt. Das hohe Volumen an vorgewärmtem RWS verhindert, dass die Lösung bei Zugabe des verglasten Gewebes übermäßig abkühlt, und sorgt für eine gleichbleibend warme Umgebung für das Gewebe während des gesamten schnellen Erwärmungsprozesses.
Um hohe Qualitätsstandards zu beurteilen und zu gewährleisten, werden 2 mm x 2 mm große Biopsiestanzen vor der Vitrifikation und nach der schnellen Erwärmung mit Calcein gefärbt, um die Follikelviabilität mittels Fluoreszenzmikroskopiezu bestimmen 34,35 (Abbildung 6). Lebensfähige Follikel emittieren nach der intrazellulären Aufnahme von Calcein eine grüne Fluoreszenz bei 495 nm. Alternativ kann die Follikelviabilität (Tabelle 3) mit neutralroten Farbstoffen36 bestimmt werden.
Durch die Befolgung der in diesem Protokoll beschriebenen Schritte wird das Eierstockgewebe in einen glasartigen Aggregatzustand überführt, der nach einer schnellen Erwärmung hohe Überlebensraten ermöglicht, wie die Fluoreszenzmikroskopie bestätigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Studiendesign. Ovarialkortikale Proben von 50 Patientinnen wurden vor (frisch) und nach der Vitrifikation und der schnellen Erwärmung auf die Anzahl der lebensfähigen Follikel untersucht. Für jede Gruppe wurden zwei Gewebestücke mit einem Durchmesser von 2 mm 24 Stunden lang kultiviert, bevor die Follikelzahl beurteilt wurde. Das Gewebe wurde mit Kollagenase verdaut und mit Calcein gefärbt, um die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Die Anzahl der lebensfähigen Follikel wurde mit Hilfe eines Mikroskops bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Vorbereitung der Ladevorrichtungen. Metallgitter wurden auf eine Größe von 8 mm x 25 mm (A) zugeschnitten. Die kundenspezifischen Metallgitter wurden durch Autoklavieren (B) sterilisiert. Die sterilisierten Metallgitter wurden dann in Verschlüsse mit 1,8-ml-Fläschchen eingesetzt, die gebrauchsfertig waren (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Aufbereitung von Vitrifikationslösungen. Vitrifikationslösungen (VS) wurden hergestellt und auf eine 6-Well-Platte übertragen. Die Vertiefungen zeigen das Volumen jeder Lösung und die einzelnen Inkubationszeiten, die im Vitrifikationsprotokoll verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Verarbeitung und Vitrifikation der Ovarialrinde. Das Gewebe der Ovarialrinde wurde für die Kryokonservierung aufbereitet, indem das Mark entfernt und das Gewebe in 5 mm x 10 mm große Stücke geschnitten wurde (A). Nach der Inkubation in den in Abbildung 3 gezeigten Vitrifikationslösungen wurde das Gewebe auf die Vitrifikationsladevorrichtung (B,C) geladen. Für eine schnelle vertikale Vitrifikation von Proben der Ovarialrinde wurden die Kappen mit dem geladenen Gewebe schnell in sterilisierten flüssigen Stickstoff (D) eingesetzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Herstellung von Lösungen für die schnelle Erwärmung. Die Schnellerwärmungslösung (RWS), die Äquilibrierungslösung (ES) und die Spüllösungen (RS) 1 und 2 wurden hergestellt und auf eine 6-Well-Platte überführt. Die Gefäße und Vertiefungen zeigen das Volumen jeder Lösung und die entsprechenden Inkubationszeiten an. Beachten Sie, dass RWS auf einer Heizplatte bei 37,2 °C gehalten wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig06.jpg"> 
Abbildung 6: Anzahl der Lebensfähigkeiten. Um die Anzahl der lebensfähigen Follikel zu bestimmen, wurden Gewebestücke mit einem Durchmesser von 2 mm mit Kollagenase verdaut und mit Calcein gefärbt. Die repräsentativen Bilder zeigen (A) die Calcein-Färbung von 3 gewonnenen Follikeln vor der Vitrifikation. (B) Ein wiedergewonnener lebensfähiger Follikel nach Vitrifikation und rascher Erwärmung. (C) Ein wiedergewonnener lebensfähiger Follikel vor dem langsamen Einfrieren. (D) Wiedergewonnene lebensfähige Follikel nach langsamem Einfrieren und Auftauen. Die Follikelviabilität wird durch Calcein angezeigt, einen grün fluoreszierenden Farbstoff, der grüne Fluoreszenz emittiert, wenn er von lebensfähigen Zellen bei 495 nm enzymatisch umgewandelt wird. Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>VS 1 (15 ml)</td>
			<td>Ethylenglykol</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 2 (15 ml)</td>
			<td>Ethylenglykol</td>
			<td>20%</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>10,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 3 (15 ml)</td>
			<td>Ethylenglykol</td>
			<td>35%</td>
			<td>5,25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Saccharose</td>
			<td>0,5 mol/L</td>
			<td>2,57 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PVP</td>
			<td>5 % (w/v)</td>
			<td>0,75 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Zusammensetzung der Vitrifikationslösungen (VS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RWS (30 ml)</td>
			<td>Saccharose</td>
			<td>0,8 mol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8,22 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES (15 ml)</td>
			<td>Saccharose</td>
			<td>0,4 mol/L</td>
			<td>ca. 2,05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS 1&amp;2 (15 mL)</td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Zusammensetzung der Schnellerwärmungslösung (RWS), der Äquilibrierungslösung (ES) und der Spüllösung (RS). Diese Tabelle enthält die Komponenten und Konzentrationen für die Schnellerwärmungslösung (RWS), die Äquilibrierungslösung (ES) und die Spüllösungen (RS), die bei der Nachverglasung verwendet werden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parameter</td>
			<td>Frisch</td>
			<td>Intervall</td>
			<td>Schnelle Erwärmung nach der Vitrifikation</td>
			<td>Intervall</td>
			<td>n</td>
			<td>*P-Wert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anzahl der follikulären Viabilität [n]</td>
			<td>77.98</td>
			<td>0-386</td>
			<td>62.99</td>
			<td>0.5-349</td>
			<td>50</td>
			<td>0.130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>77.95</td>
			<td></td>
			<td>80.02</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Wilcoxon-Test</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 3: Repräsentative Ergebnisse der Follikelviabilität. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse der Bewertung der Follikelviabilität vor der Kryokonservierung und nach einer schnellen Erwärmung. Pro Patient wurden zwei Gewebestücke mit einem Durchmesser von 2 mm verwendet, um die Anzahl der lebensfähigen Follikel vor und nach der Vitrifikation/schnellen Erwärmung zu zählen. Gepaarte Gewebeproben von 50 Patienten wurden mit dem Wilcoxon-Test analysiert.

Vitrifikation des Gewebes der Ovarialrinde, um einen glasartigen Aggregatzustand zu erreichen

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Forschung

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