Name: Ein webbasierter Workflow zur Auswahl gen- und gewebespezifischer Enhancer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T13:10:10.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie einen webbasierten Workflow zur Identifizierung gen- und gewebespezifischer Enhancer ohne Programmierkenntnisse. Diese Methode nutzt öffentliche Histon-Markierungen und Hi-C-Daten für die Genomforschung.

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<ol><li>Barral, A., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+signatures+of+enhancers+and+their+dynamic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation.</a> Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).</li>
<li>Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+control+of+gene+expression%3A+emerging+mechanisms+and+disruption+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).</li>
<li>Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+redundancy+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancer redundancy in development and disease.</a> Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).</li>
<li>Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+biology+and+enhanceropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancer biology and enhanceropathies.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).</li>
<li>Sur, I., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+enhancers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of enhancers in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).</li>
<li>Panigrahi, A., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+enhancer+action%3A+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown.</a> Genome Biol. 22 (1), 108(2021).</li>
<li>Bulger, M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mechanistic+diversity+of+distal+transcription+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers.</a> Cell. 144 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+promoter+interactions-long+distance+calls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Enhancer and promoter interactions-long distance calls.</a> Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+connectivity+maps+reveal+dynamic+promoter-enhancer+long-range+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations.</a> Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Thurman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accessible+chromatin+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The accessible chromatin landscape of the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).</li>
<li>Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Gao, T., Qian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EnhancerAtlas+2.0%3A+an+updated+resource+with+enhancer+annotation+in+586+tissue%2Fcell+types+across+nine+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).</li>
<li>Erwin, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+diverse+datasets+improves+developmental+enhancer+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction.</a> PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Spicuglia, S., Vanhille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of active enhancers.</a> Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).</li>
<li>Borsari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+with+tissue-specific+activity+are+enriched+in+intronic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions.</a> Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).</li>
<li>Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+variation+in+a+TBX5+enhancer+leads+to+isolated+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease.</a> Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).</li>
<li>Boogerd, C. J., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBX5+and+NuRD+divide+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">TBX5 and NuRD divide the heart.</a> Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+compendium+and+functional+assessment+of+in+vivo+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers.</a> Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+of+sequence+and+functional+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Limits of sequence and functional conservation.</a> Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).</li>
<li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISTA+Enhancer+Browser-a+database+of+tissue-specific+human+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers.</a> Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Computerarbeitsplatz</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Webbrowser-fähiger Rechner, Windows/Mac/Linux-Betriebssystem</td></tr><tr><td>4DN Datenportal</td><td>4DN Datenportal</td><td>https://data.4dnucleome.org/</td><td></td></tr><tr><td>Galaxie</td><td>Galaxie</td><td>https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445</td><td></td></tr><tr><td>Github (Englisch)</td><td>Github (Englisch)</td><td>https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow</td><td></td></tr><tr><td>VISTA&nbsp;</td><td>VISTA Cardiac Enhancer Browser</td><td>https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/</td><td></td></tr></tbody></table>

ein webbasierter workflow zur auswahl gen- und gewebespezifischer enhancer

A Web-Based Workflow for Selecting Gene- and Tissue-Specific Enhancers

Um die Verwendung des vorgestellten Protokolls zu veranschaulichen, untersuchten wir das TBX5-Gen im menschlichen Herzen und untersuchten TBX5-assoziierte Enhancer unter Verwendung des umfassenden Arbeitsablaufs mit H3K4me1-, H3K27ac- und Hi-C-Daten. TBX5 ist ein Gen, das zur Entwicklung der Gliedmaßen und des Herzens beiträgt, einschließlich der Bildung der vier Kammern und der Septumtrennung24. Die Mutation in diesem Gen ist eine der Hauptursachen für das Holt-Oram-Syndrom (HOS), das Anomalien der Gliedmaßen und angeborene Herzfehler (KHK), einschließlich Septumdefekte, verursacht24. Die Mutation von TBX5-assoziierten Herzverstärkern kann die CHD24 entscheidend beeinflussen. In einer früheren Studie wurden drei bekannte TBX5-Enhancer in humanem kardialspezifischem Gewebe entdeckt - nämlich "Enhancer 2", "Enhancer 9" und "Enhancer 16" (Supplementary File 2), bei denen in transgenen Mäusen vergleichbare Phänotypen nachgewiesen wurden23.
Wir untersuchten H3K4me1- und H3K27ac-angereicherte Regionen zwischen RBM19 und TBX3, zwei flankierende Gene stromabwärts und stromaufwärts von TBX5 im Menschen, um mutmaßliche Enhancer am TBX5-Locus zu gewinnen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Um herzspezifische Enhancer zu identifizieren, wurden die Herzmuskelzellen ausgewählt. Die mutmaßlichen TBX5-Herzverstärkerregionen wurden als Koordinaten abgerufen (chr12: Start-Ende), und es wurden 22 sowohl H3K4me1- als auch H3K27ac-assoziierte Regionen identifiziert (Abbildung 3 und Zusatzdatei 3). Mutmaßliche TBX5-Herzverstärker wurden aus der genomischen Datenbank von EnsEMBL abgerufen und mit Hi-C-Daten in der 4DNucleome-Datenbank verglichen (Abbildung 4). Dies geschah, um mögliche Wechselwirkungen zwischen potenziellen Enhancern und dem TBX5-Herzpromotor abzuschätzen. Gemäß dem hier beschriebenen Protokoll wurde bestätigt, dass 21 von 22 genomischen Regionen mit dem TBX5-Promotor (chr12: 114400143-114410103) in den Herzmuskelzellen interagieren (Ergänzungsdatei 4). Es gab eine Region, die keine physische Interaktion mit dem Promotor aufwies (Abbildung 4, Schritt 4.8). Schließlich verglichen wir dieses Protokoll mit diesen biologisch validierten Enhancern und der aktuellen Goldstandard-Datenbank für Herzverstärker, dem VISTA Cardiac Enhancers Browser, und zeigten zusätzliche Enhancer, die derzeit nicht in der Datenbank erfasst sind25.
Wir haben einen Quervergleich der 21 TBX5-Enhancer , die von dem hier vorgestellten Protokoll abgerufen wurden, mit vorhandenen Datenbanken durchgeführt. Wir haben 4 TBX5-Enhancer aus dem VISTA Cardiac Enhancer Browser (Supplementary File 5)25 abgerufen. Von den 4 VISTA-identifizierten Herzverstärkern überlappten sich 3 Enhancer, hs2329, mm1282 und m370, mit den Regionen, die durch dieses webbasierte Enhancer-Nachweisprotokoll identifiziert wurden (Abbildung 5). Jeder der vorhergesagten Enhancer teilte sich auch die genomischen Regionen mit zuvor experimentell validierten Enhancern von Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) und Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), während sie keine Überlappung mit Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38) zeigten. Einer der VISTA-identifizierten Enhancer, hs498 , überlappte sich nicht mit irgendwelchen Enhancern, die durch dieses Protokoll vorhergesagt wurden, oder mit den experimentell validierten Enhancern23 von Smemo et al. (Abbildung 5), obwohl die Region eine partielle Überlappung mit H34Kme1-Markierungen aufwies (Abbildung 5). In ähnlicher Weise überlappte sich Enhancer 9 nicht mit den vorhergesagten Enhancern dieser Pipeline, sondern war mit H3K4me1-Markierungen assoziiert (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Auffinden der indonesischen Regierung im EnsEMBL Genome Browser. Der Benutzer öffnet zunächst die EnsEMBL-Homepage (1.1), wählt die Spezies (Mensch) aus und gibt das Gen in die Suchleiste ein (1.2-1.3). Aus der Ergebnisliste wird die entsprechende Gen-ID ausgewählt (1.4), wodurch die Gen-Zusammenfassungsseite geöffnet wird. Der Benutzer klickt dann auf den Hyperlink Region in Detail (1.5), um die genomische Region um die indonesische Regierung herum zu visualisieren, einschließlich benachbarter Elemente und regulatorischer Merkmale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Definition der Enhancer-Nachweisregion um die injizierte Regierung mit dem EnsEMBL Genome Browser. Um den Enhancer-Nachweisbereich zu definieren, identifizieren Sie die beiden benachbarten Gene, die die GoI flankieren, mithilfe der Spur Basic Gene Annotations from GENCODE , wobei die Gene als dunkelgelbe Blöcke angezeigt werden, die mit zusammengeführten EnsEMBL/Havanna-Annotationen beschriftet sind. Die Transkriptionsrichtung jedes Gens wird durch Pfeilspitzen (&lt; oder &gt;) neben dem Gennamen (2.1) angezeigt. Um die intergene Region zwischen den benachbarten Genen auszuwählen, klicken und ziehen Sie über die Region von Interesse und wählen Sie dann im Popup-Fenster zum Vergrößern die Option Zur Region springen (2.2). Um regulatorische oder Enhancer-bezogene Anmerkungen hinzuzufügen, klicken Sie auf Spuren hinzufügen/entfernen (2.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig3v2.jpg"> 
Abbildung 3: Konfiguration von Histon-Modifikationsspuren in der Enhancer-Detektionsregion mit dem EnsEMBL Genome Browser. Klicken Sie in der linken Symbolleiste auf Diese Seite konfigurieren (3.1), um auf das Streckenkonfigurationsfenster zuzugreifen und zu "Aktivität nach Zelle/Gewebe" im Abschnitt "Vorschriften" (3.2) zu navigieren. Wählen Sie im geöffneten Tab den Abschnitt "Experimente" (3.3) und verwenden Sie die Zell-/Gewebe-Suchleiste, um das gewünschte Gewebe (Herzmuskelzelle) zu finden und auszuwählen (3.4). Aktivieren Sie im Histon-Markierungsfeld (3.5) H3K4me1 und H3K27ac als aktive Enhancer-Markierungen und H3K4me3 als Promotor-Markierung und klicken Sie dann auf "Track-Anzeige konfigurieren" (3.6). Nachdem Sie die Track-Auswahl bestätigt haben, klicken Sie auf "Tracks anzeigen" (3.7), um zum Genom-Viewer zurückzukehren. Histonmarkierungspeaks werden nun im Nachweisbereich (3.8) als farbige Blöcke unter der entsprechenden Gewebemarkierung dargestellt (gelb: H3K4me1, blau: H3K27ac und orange: H3K4me3). "Hists &amp; Pols"-Pop-up, das die genomischen Koordinaten der Region in Basenpaaren (chr:start-end) enthält, die kopiert und für die nachgelagerte Analyse gespeichert werden können. Ein "Hists &amp; Pols"-Pop-up erscheint, nachdem Sie auf die farbigen Elemente in der Spur geklickt haben. Das Pop-up enthält die genomischen Koordinaten der Region in Basenpaaren (z.B. chr12:11443450-114451611 für die Promotorregion), die kopiert und für die nachgelagerte Analyse gespeichert werden können (3.8). Um mögliche Enhancer zu extrahieren, priorisieren Sie ebenfalls Regionen, in denen sich die Peaks von H3K4me1 und H3K27ac überlappen, wie die vertikale Ausrichtung von Peaks und Boxen über die Spuren hinweg zeigt (3.9). Überlappende Regionen können direkt ausgewählt werden, indem Sie auf die entsprechenden Felder klicken oder manuell über die ausgerichteten Peaks ziehen und klicken, um eine Region zu definieren (z. B. chr12:114400143-114410103 für eine aktive Kandidatenregion). Die im Pop-up angezeigten Koordinaten sollten für die nachgelagerte Validierung oder Visualisierung im BED-Format gespeichert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig4v2.jpg"> 
Abbildung 4: Visualisierung von Promotor-Enhancer-Chromatin-Wechselwirkungen unter Verwendung von Hi-C-Heatmaps aus dem 4D Nucleome Data Portal. Die Startseite des 4D Nucleome Data Portals zeigt ein gestapeltes Balkendiagramm an, das die verfügbaren Experimenttypen nach Organismus zusammenfasst. Der Datensatz "in situ Hi-C" für humane Proben wird durch Anklicken des entsprechenden Abschnitts des Balkens (4.1) ausgewählt. Eine gefilterte Liste relevanter Datensätze wird angezeigt. Es wird ein Hi-C-Datensatz ausgewählt, der von H9-Zellen abgeleitet wurde, die zu kardialen Myoblasten differenziert wurden (4.2). Der ausgewählte Datensatz (4.3) wird im HiGlass-Browser über die Schaltfläche Daten erkunden (4.4) geöffnet. Die genomische Region of Interest wird in das Koordinatenfeld (4.5) eingegeben, und die Kontaktmatrix wird als farbskalierte Heatmap gerendert. Dunklere Farben (tiefrot bis schwarz) deuten auf eine stärkere Chromatinkontaktfrequenz hin, während hellere Farben (weiß bis orange) eine schwächere Wechselwirkung darstellen. Ein horizontales Lineal wird an der Promotorkoordinate platziert, und vertikale Linien werden an den Positionen von drei experimentell validierten Kontrollverstärkern gezeichnet (4.6). Diese Schnittpunkte werden verwendet, um eine strenge Wechselwirkungsschwelle zu definieren, die durch das stärkste sichtbare Signal (dunkelste Farbe) unter den Promotor-Enhancer-Kontakten festgelegt wird (4.7). Zusätzliche vertikale Regeln werden an den Stellen der mit H3K27ac und H3K4me1 markierten Enhancer gezeichnet (aus Schritt 3.8). Kandidaten, deren Promotor-Enhancer-Schnittpunkte gleich oder dunkler als der Schwellenwert sind, werden beibehalten, während Kandidaten mit schwächeren Signalen (hellere Farbquadrate) ausgeschlossen werden (4.8). Gespeicherte Koordinaten werden manuell extrahiert und im BED-Format für nachgelagerte Analysen gespeichert. (a. Enhancer 2, b. Enhancer 9 und c. Enhancer 16) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Genomische Browseransicht von vorhergesagten TBX5-Enhancern im Vergleich zu VISTA-validierten Herzverstärkern und Kontroll-Enhancern. Genom-Browser-Snapshots zeigen den Enhancer-Suchbereich (SCHRITT 2) an, der vorhergesagte Enhancer, die vom webbasierten Protokoll abgerufen wurden (unten), mit VISTA-validierten Enhancern (oben) und experimentell validierten Kontroll-Enhancern (Mitte) vergleicht. Das Hauptfeld zeigt den vollständigen genomischen Locus mit annotierten regulatorischen Elementen, einschließlich der kardialmuskelzellspezifischen H3K4me1 (gelb), H3K27ac (blau) und H3K4me3-Peaks (orange). Drei vergrößerte Abbildungen erfassen die Übereinstimmung zwischen den vom Protokoll abgerufenen VISTA- und Kontrollverstärkern. Die Überlappung mit Control Enhancern ist mit roten Kästchen umrandet. Die Koordinaten für jede Unterregion werden in den unteren Browser-Fenstern angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: In der Studie verwendete Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: In der Studie verwendete webbasierte Tools. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Anweisungen zur Fehlerbehebung für den EnsEMBL Genome Browser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Eine BED-Datei im GRCh38-Format, die experimentell validierten TBX5-Enhancer zur Herzkontrolle23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%202.bed" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3: Eine BED-Datei im GRCh38-Format, TBX5-Herzverstärker, die von STEP3 von EnsEMBL abgerufen wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%203.bed" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 4: Eine BED-Datei im GRCh38-Format, TBX5-Herzverstärker, die von STEP4 von EnsEMBL abgerufen wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%204.bed" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 5: Eine BED-Datei im GRCh38-Format, TBX5-Herzverstärker, abgerufen vom VISTA-Herzverstärker-Browser25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%205.bed" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Ein webbasierter Workflow zur Auswahl gen- und gewebespezifischer Enhancer

Enhancers are DNA regions that regulate gene expression. Mutations within enhancers can result in abnormal gene regulation leading to disease. Therefore, ...

a-web-based-workflow-for-selecting-gene-and-tissue-specific-enhancers

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

In dieser Arbeit stellen wir einen experimentellen Workflow zur Verfügung, wie aktive Enhancer identifiziert und experimentell validiert werden können.

Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

Im Gegensatz zu DNA Reihenfolge Daten epigenomischen Daten nicht ohne weiteres Text-basierte Suche unterliegen. Hier sind die Verfahren, die eine verbesserte Version des GeNemo, eine Web-basierte Bioinformatik-Tool verwenden, um Muster-basierte Suche nach Gemeinsamkeiten im Vergleich zur Verfügung Online-Datenbanken, einschließlich der Enzyklopädie der DNA-Elemente mit epigenomischen-Daten durchzuführen Daten des Benutzers.

Pattern-basierte Suche nach epigenomischen Daten mit GeNemo

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zum Entwerfen und ausführen gemultiplexten Ausrichtung der Enhancer mit deaktivieren Fusionsproteins SID4X-dCas9-KRABBE, auch bekannt als Enhancer Störungen (Enhancer-i). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Enhancer, die Genexpression regulieren und erleichtert das Sezieren von Beziehungen zwischen Enhancer Regulierung ein gemeinsames Zielgen.

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Wir berichten über die Anwendung der quantitativen Chromosomenkonformationsaufnahme, gefolgt von einer Hochdurchsatzsequenzierung in embryonalen Körpern, die aus embryonalen Stammzellen erzeugt werden. Diese Technik ermöglicht es, die Kontakte zwischen vermeintlichen Enhancern und Promotorregionen eines bestimmten Gens während der embryonalen Stammzelldifferenzierung zu identifizieren und zu quantitieren.

Identifizierung von Enhancer-Promoter-Kontakten in embryoiden Körpern durch quantitative Chromosomenkonformationserfassung (4C)

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen rAAV-basierten transienten Enhancer-Reporter-Assay. Dieser Assay kann verwendet werden, um eine enhancergesteuerte Expression in vivo im Gehirn der Maus zu induzieren.

AAV-Einsatz von Enhancer-basierten Expressionskonstrukten in vivo im Gehirn von Mäusen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Wir beschreiben eine Methode, um einzelne Säugetierzellen zu sortieren und die Expression von bis zu 96 Zielgenen von Interesse in jeder Zelle zu quantifizieren. Diese Methode beinhaltet die Verwendung interner qPCR-Standards, um die Schätzung der absoluten Transkriptzahlen zu ermöglichen.

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Erfahren Sie einen webbasierten Workflow zur Identifizierung gen- und gewebespezifischer Enhancer ohne Programmierkenntnisse. Diese Methode nutzt öffentliche Histon-Markierungen und Hi-C-Daten für die Genomforschung.

Ein webbasierter Workflow zur Auswahl gen- und gewebespezifischer Enhancer

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