Name: Tricolor-transgenes Mausmodell zur Untersuchung von Wachstumsfugenverletzungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie ein verbessertes Mausmodell mit dreifarbigen fluoreszierenden Reportern kennen, um Wachstumsfugenverletzungen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht präzise Zellabbildungen während der Heilung und unterstützt die Entwicklung neuer Therapien für pädiatrische Knochenverletzungen.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health, des National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) 1R21AR079153 und einen Zuschuss des University of Connecticut Research Enhancement Program (REP) unterstützt. Die Autoren danken Renata Rydzik von der MicroCT Imaging Core Facility der University of Connecticut für die Unterstützung.

Präzise Studie zur Verletzung von Wachstumsfugen mit fluoreszierenden Mäusen mit Trilineage

<ol><li>Iannotti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Growth plate physiology and pathology.</a> Orthop Clin North Am. 21 (1), 1-17 (1990).</li>
<li>Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+responses+and+repair+mechanisms+of+the+injured+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).</li>
<li>Salter, R. B., Harris, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injuries+involving+the+epiphyseal+plate%5BTitle%5D)+AND+%22JBJS%22%5BJournal%5D)">Injuries involving the epiphyseal plate.</a> JBJS. 45 (3), 587-622 (1963).</li>
<li>Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classifications+in+brief%3A+Salter-harris+classification+of+pediatric+physeal+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Classifications in brief: Salter-harris classification of pediatric physeal fractures.</a> Clin Orthop Relat Res. 474 (11), 2531-2537 (2016).</li>
<li>Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+analyses+of+bone+bridge+formation+within+the+growth+plate+injury+site+and+cartilage+degeneration+at+the+adjacent+uninjured+area%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area.</a> Bone. 49 (4), 904-912 (2011).</li>
<li>Shaw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+approaches+for+the+treatment+of+pediatric+physeal+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries.</a> Tissue Eng Part B Rev. 24 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Xian, C. J., Zhou, F. H., Mccarty, R. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembranous+ossification+mechanism+for+bone+bridge+formation+at+the+growth+plate+cartilage+injury+site%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site.</a> J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).</li>
<li>Muruganandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+foxa2%2B+long-term+stem+cell+population+is+necessary+for+growth+plate+cartilage+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A foxa2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury.</a> Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).</li>
<li>Coleman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+small+animal+growth+plate+injury+model+using+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography.</a> Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).</li>
<li>Lee, E. H., Gao, G. X., Bose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+partial+growth+arrest%3A+Physis%2C+fat%2C+or+silastic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Orthop%22%5BJournal%5D)">Management of partial growth arrest: Physis, fat, or silastic.</a> J Pediatr Orthop. 13 (3), 368-372 (1993).</li>
<li>Planka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+mesenchymal+stem+cells+with+chondrocytes+in+prevention+of+partial+growth+plate+arrest+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pap+Med+Fac+Univ+Palacky+Olomouc+Czech+Repub%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs.</a> Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).</li>
<li>Foster, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimplantation+of+growth+plate+chondrocytes+into+growth+plate+defects+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Reimplantation of growth plate chondrocytes into growth plate defects in sheep.</a> J Orthop Res. 8 (4), 555-564 (1990).</li>
<li>Erickson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+tibial+growth+plate+injury+model+to+characterize+repair+mechanisms+and+evaluate+growth+plate+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies.</a> J Vis Exp. (125), e55571(2017).</li>
<li>Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+effect+of+bone+marrow-derived+stem+cell+implantation+after+epiphyseal+plate+injury+is+abrogated+by+chondrogenic+predifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation.</a> Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).</li>
<li>Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+autologous+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+an+ovine+model+of+growth+plate+cartilage+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Orthop+J%22%5BJournal%5D)">Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury.</a> Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+mandibular+condylar+cartilage+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations.</a> Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).</li>
<li>Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+differentiation+of+fluorescent+multireporter+cells+on+zonally-organized+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+type+i+collagen+green+fluorescent+protein+transgenes+to+identify+subpopulations+of+cells+at+different+stages+of+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Use of type i collagen green fluorescent protein transgenes to identify subpopulations of cells at different stages of the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 17 (1), 15-25 (2002).</li>
<li>Maye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+col10a1-mcherry+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice.</a> Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).</li>
<li>Chokalingam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+effects+of+compression+and+time+in+culture+on+aggregate+modulus+and+on+gene+expression+and+protein+content+of+collagen+type+ii+in+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes.</a> Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).</li>
<li>Dutta, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Men+and+mice%3A+Relating+their+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Men and mice: Relating their ages.</a> Life Sci. 152, 244-248 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multi-image+cryohistology+of+mineralized+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">multi-image cryohistology of mineralized tissues.</a> J Vis Exp. (115), e54468(2016).</li>
<li>Chavez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+micro-computed+tomography+analysis+of+rodent+dentoalveolar+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22JBMR+Plus%22%5BJournal%5D)">Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues.</a> JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).</li>
<li>Chung, R., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+research+on+the+growth+plate%3A+Mechanisms+for+growth+plate+injury+repair+and+potential+cell-based+therapies+for+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Recent research on the growth plate: Mechanisms for growth plate injury repair and potential cell-based therapies for regeneration.</a> J Mol Endocrinol. 53 (1), T45-T61 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Der innovative Einsatz von dreifarbigen Kollagen-Reportermäusen ermöglicht die Erzeugung von Wachstumsplattendefekten mit einer vorgegebenen Größe und Lokalisation, wodurch die Genauigkeit von experimentellen Mausmodellen für Wachstumsplattenverletzungen erheblich verbessert wird. Angesichts der geringen Größe der 2 Wochen alten Mäuse ist es wichtig, einen kleinen 0,5-mm-Bohrer zu verwenden, um die Verletzung zu erzeugen, um eine Schwächung der Extremität und eine Fraktur in voller Dicke zu vermeiden. Der Chirurg muss auch bei der Erstellung des Defekts gerade genug Druck ausüben, um zu vermeiden, dass sich aus dem gleichen Grund zu tief in den Knochen bohrt. Die Verwendung der Perioprobe ist entscheidend für die Bestätigung einer konstanten Verletzungstiefe.
Wie bei jeder Operation ist es wichtig, eine ausreichende Narkosetiefe zu bestätigen, die durch ein gelegentliches Einklemmen der Zehen bestätigt wird, und die Sterilität bleibt durchgehend erhalten. Ein weiterer chirurgischer Punkt von Bedeutung ist, dass die stumpfe Dissektion mit einem Schnitzer beschrieben wurde, da sie eine Beschädigung des Weichgewebes vermeidet und dazu beiträgt, dass die Mäuse sofort nach der Genesung aus der Narkose gehfähig sind, um die Muttermaus für Ernährung und Komfort zu erreichen. Nach unserer Erfahrung sind die mit Nähten verschlossenen Wunden erfolgreich verschlossen geblieben und Wundclips sind nicht erforderlich. Eine Operation an Mäusen im Alter von 2 Wochen wird empfohlen, um das kleine Kind, bei dem Wachstumsfugenfrakturen auftreten, am besten nachzuahmen. Ein Nachteil dieses Protokolls besteht darin, dass die Verwendung dieses Mausmodells angesichts der Unvorhersehbarkeit der Geburt die kurzfristige Verfügbarkeit des Chirurgen erfordert.
In Bezug auf die Positionierung des Bohrers zur Erzeugung des Defekts beschreibt das Protokoll die Erzeugung der Verletzung unter Verwendung eines mCherry/Texas-Rotfiltersets, das die hypertrophe Zone innerhalb der Wachstumsfuge aufgrund der Helligkeit der Kollagen-X-Fluoreszenz beleuchtet. Um sicherzustellen, dass die Verletzung innerhalb der Tibia-Wachstumsfuge entsteht, ist es von Vorteil, die Weichteilöffnung leicht nach links und rechts zu bewegen, um zu bestätigen, dass die proximale Tibia-Wachstumsfuge und nicht der Femur sichtbar ist. Das Umschalten zwischen den Filtersetkanälen zur Beleuchtung der proliferativen Chondrozytenzone oder der angrenzenden Knochenabschnitte ist nützlich, um die genaue Platzierung relativ zur Position der proliferativen Zone und der angrenzenden Knochenabschnitte zu bestätigen.
Während bei den lebenden Mäusen die proliferative Chondrozytenzone sowie der epiphysäre und metaphysäre Knochen unter Fluoreszenzmikroskopie unterschieden werden können, wird der reale Wert der Kollagenreporter Typ II und Typ I bei der histologischen Analyse der Wachstumsfuge erkannt. Angesichts der wässrigen Natur kryohistologischer Prozesse sind herkömmliche chromogene Farbstofffällungsprotokolle ungeeignet, da die Farbe mit der Fluoreszenzbildgebung möglicherweise durch Dehydratisierungsschritte fehlausgerichtet wird. Obwohl das wässrige Protokoll Färbemuster liefert, die denen in Paraffinschnitten ähneln, ist eine schnelle Bildgebung nach der Färbung unerlässlich, um eine Farbstoffdiffusion aus dem Gewebe zu verhindern. Die Verwendung von 30 % Glycerin in destilliertem Wasser als Einbettmedium kann diese Diffusion verlangsamen und ermöglicht eine mehrfache chromogene Färbung auf demselben Abschnitt, einschließlich Knorpel mit Safranin O/Fast Green.
Der endochondrale Ossifikationsprozess ist deutlich sichtbar, wobei rote Chondrozyten die sich entwickelnde knöcherne Brücke auskleiden (Abbildung 6). Der zusätzliche Einsatz immunhistochemischer Techniken, für die viele murine Antikörper zur Verfügung stehen, könnte die mechanistischen Studien, die an diesen transgenen Mäusen durchgeführt werden, weiter verbessern. Insgesamt bietet die Kombination von Faxitron-, MikroCT- und kryo-histologischen Bildgebungsverfahren in diesem transgenen Mausmodell ein umfassendes Verständnis der makroskopischen und mikroskopischen Veränderungen, die als Reaktion auf Wachstumsfugenverletzungen auftreten, und ebnet den Weg für zukünftige therapeutische Interventionen zur Milderung solcher unerwünschten Ergebnisse. Weitere genetische Manipulationen an diesen transgenen Mäusen könnten durchgeführt werden, um die Herkunft der Zellen zu verstehen, die zeitlich und räumlich an der Heilung beteiligt sind. Experimente an Mäusen mit zusätzlichen Modifikationen würden die Untersuchung von Knorpelerkrankungen wie dem Osteochondrom ermöglichen - einer Überwucherung von Knorpel und Knochen in der Nähe der Wachstumsfuge.
Die Konsistenz unseres Modells zeigt sich in der reproduzierbaren Bildung von knöchernen Brücken bei allen Mäusen, ohne dass Mäuse aus der Gruppe aufgrund einer Gelenkknorpelverletzung verworfen werden mussten. Dies ist eine Verbesserung gegenüber früheren Modellen, die sich der Wachstumsfuge von einem kortikalen Fenster unterhalb der Wachstumsfuge näherten und ein scharfes Werkzeug oder einen Bohrer nach oben in Richtung der Wachstumsfuge abwinkelten und gelegentlich in den Gelenkknorpel hineinragten. Eine zusätzliche Verletzung des Gelenkknorpels ahmt die bei Kindern häufig auftretenden Verletzungen der Wachstumsfuge nicht nach. Die präzisere Schädigung dieses Tiermodells reduziert die Anzahl der pro Versuch benötigten Mäuse, was eine weitere Verbesserung darstellt. Die Verwendung transgener Mäuse ermöglicht es dem Forscher, die Verletzung auf Teilabschnitte der Wachstumsfuge zu fokussieren, wie z. B. den hypertrophen/provisorisch verkalkten Bereich oder den Bereich der Epiphyse/Ruhezone/proliferativen Zone, ohne den Gelenkknorpel zu beeinträchtigen. Eine Einschränkung dieses Modells ist jedoch die Variabilität des Knochenbrückenvolumens, die sich bei verletzten Tieren um bis zu 30% unterscheiden kann. Um einen klinisch signifikanten Effekt auf die Knochenbrückenbildung nachweisen zu können, ist daher immer noch eine große Anzahl von Tieren erforderlich, um eine statistische Relevanz zu erreichen.
Zu den Vorteilen eines Mausmodells, wie es hier beschrieben wird, im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Ratten- oder Kaninchen-Wachstumsfugen-Verletzungsmodellen 7,9,10,14 gehören eine geringere Anzahl verwendeter Tiere, Kostenreduzierung, eine effiziente Replikatgröße aufgrund reproduzierbarer Knochenbalkenbildung, ein kürzerer Studienzeitraum und eine präzisere Verletzungsplatzierung aufgrund der Live-Bildgebung der dreifach transgenen Mäuse. Obwohl nicht im Detail diskutiert, kann dieses Mausmodell verwendet werden, um Tissue-Engineering-Implantate oder Biomaterialien zu testen, die Wachstumsfaktoren liefern. Eine bemerkenswerte Einschränkung dieser murinen Methode besteht darin, dass die Größe eines Implantats, das zur Verabreichung von therapeutischen Medikamenten oder Zellen verwendet wird, auf das Defektvolumen von etwa einer Kugel mit einem Durchmesser von 0,5 mm begrenzt ist. Nur größere Tiermodelle können das Volumen an Testmaterial aufnehmen, das bei menschlichen Patienten verwendet würde. Der Bohrerdefekt, der in diesem Protokoll erzeugt wird, hat nicht die gleiche Geometrie wie eine dünne Fraktur und unterscheidet sich daher von tatsächlichen menschlichen Verletzungen. Nichtsdestotrotz sind die Vorteile dieses Mausmodells vielfältig, und der laterale Zugang vermeidet eine Beschädigung des Gelenkknorpels, die auftreten würde, wenn man sich blind über oder unter der Wachstumsfuge in einer Linie mit der Tibia-Längsachse nähert. Diese Methodik stellt einen wesentlichen Sprung in der Erforschung von Wachstumsfugenverletzungen dar und bietet eine detaillierte und reproduzierbare Methode zur Untersuchung der Pathologie und zur Evaluierung neuer therapeutischer Strategien.

Knochenwachstumsfugen spielen eine zentrale Rolle beim Längswachstum langer Knochen im Kindes- und Jugendalter1. Die Wachstumsfuge befindet sich an den Enden langer Knochen und besteht aus mehreren Zonen, wobei Chondrozyten die wichtigsten zellulären Komponenten sind, die für die Produktion und Aufrechterhaltung dieses dynamischen Wachstumsbereichs verantwortlich sind. Die endochondrale Ossifikation der Wachstumsfuge tritt auf, um die Knochen durch eine sequentielle Progression der Chondrozytenproliferation, Hypertrophie, Apoptose, Invasion durch Blutgefäße, Rekrutierung von Osteoprogenitorzellen und schließlich Knochenbildung zu verlängern und zu erweitern2. Da die Wachstumsfuge relativ weicher ist als der Knochen, ist sie sehr anfällig für Frakturen, wenn die Knochen beim Sport oder anderen Aktivitäten überlastet werden. Die Salter-Harris-Klassifikation beschreibt fünf verschiedene Arten von Verletzungen der Wachstumsfugen3. Die Typ-II-Fraktur durch die hypertrophe Zone der Wachstumsfuge und des angrenzenden unteren Knochengewebes ist die häufigste4. Eine knöcherne Brücke bildet sich häufig als Reaktion auf Verletzungen der hypertrophen Zone oder des angrenzenden Knochens und führt zu einer vorzeitigen Versteifung der angrenzenden langen Knochenabschnitte5. Knöcherne Brücken behindern die normale Ausdehnung der Wachstumsfuge. Derzeit gibt es keine vorbeugenden Behandlungen für die Bildung der knöchernen Brücken, und einige bleiben unbehandelt, abhängig vom Alter des Patienten und der Größe und Lage der knöchernen Brücke6. Wenn die Fehlbildungen der Gliedmaßen schwerwiegend sind, umfassen die chirurgischen Optionen die Entfernung, gefolgt von der Implantation von Interpositionalmaterialien wie Fett oder Silikonkautschuk oder korrigierende Osteotomien und Knochenverlängerungsverfahren. Dennoch kann sich eine knöcherne Brücke immer noch neu bilden6. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Bildung von Knochenbrücken zu verhindern und die Ergebnisse von Kindern mit Verletzungen der Knochenwachstumsfugen zu verbessern.
Es wurden mehrere Tiermodelle etabliert, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu erforschen und neue Strategien zu entwickeln, um eine Beeinträchtigung der Knochenbrücken der Wachstumsfugen nach Verletzungenzu verhindern 7,8,9,10,11,12. Diese Tiermodelle konzentrieren sich häufig auf die proximale tibiale Wachstumsfuge und die distale Femurwachstumsfuge als primäre Verletzungsstelle, da dies typischerweise der Ort ist, an dem menschliche Verletzungen auftreten. Die tierischen Knochendefekte entstehen entweder durch einen lateralen Zugang, der einem tatsächlichen Frakturweg ähnelt, oder durch einen Zugang von oben oder unterhalb der Wachstumsfuge, der zu einer zentralen Bohrung in der Wachstumsfuge führt. In einem zuvor berichteten Rattenmodell wird ein Wachstumsplattendefekt erzeugt, indem ein Zahnbohrer durch ein kortikales Fenster im tibialen Mittelschaft eingeführt und durch das Knochenmark nach oben in Richtung des Kniegelenks gebohrt wird, um die Wachstumsfuge zentral zu verletzen 7,13. Alternativ verwendet ein rezentes Mausmodell einen lateralen Zugang mit einer Nadel mit kleiner Bohrung, um eine planare Nadelbahn durch die Wachstumsfuge8 zu erzeugen. In einem weit verbreiteten Rattenmodell wird der Defekt in der Wachstumsfuge des distalen Femurs erzeugt, indem der Gelenkknorpel zwischen den Kondylendurchbohrt wird 9,14. Bei größeren Tieren wie Kaninchen und Schafen wurden Wachstumsplattendefekte sowohl direkt in der proximalen Tibia als auch im distalen Femur durch Bohren oder Schneiden in die Wachstumsfuge oder durch Annäherung von unten und Schaffung eines zentralen Defekts induziert, wobei die Ränder der Wachstumsfuge unverändert blieben 10,11,12,15.
Mausmodelle für Verletzungen der Wachstumsfugen sind vorteilhaft für mechanistische Studien, die mit genetisch veränderten Mäusen durchgeführt werden können, wie z. B. Studien zur Rückverfolgung von Stammzelllinien8. Eine große Herausforderung in Maus- oder Rattentiermodellen besteht jedoch darin, eine konsistente und präzise Schädigung einer bestimmten Unterregion der Wachstumsfuge zu erreichen. Die Verletzung bestimmter Zonen der Wachstumsfuge und des angrenzenden Knochens ist erforderlich, um einen der klinisch relevanten Frakturpfade nachzuahmen, die durch die Salter-Harris-Klassifikationen beschrieben werden. Die bisherigen Herausforderungen in Nagetiermodellen sind vor allem auf das Fehlen eines visuellen Mittels zur Identifizierung des Substrats der Wachstumsfuge während der chirurgischen Entstehung der Verletzung zurückzuführen. Dieses Protokoll beschreibt eine verfeinerte Technik zur Erzeugung von Wachstumsplattendefekten in gezielten Substraten der murinen Wachstumsfuge unter Verwendung von dreifach transgenen Mäusen, die Kollagen I, II und X Fluoreszenzreporter exprimieren 16,17,18. Die verschiedenfarbige Fluoreszenz dieser Kollagene in jeder der primären Zonen der Wachstumsfuge ermöglicht die visuelle Unterscheidung der verschiedenen Abschnitte der Wachstumsfuge unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop während der chirurgischen Entstehung der Wachstumsfugenverletzung. Die Verwendung dieser transgenen Mäuse ermöglicht eine beispiellose Verletzungsgenauigkeit bei einer jungen Maus in einem vergleichbaren Entwicklungsstadium wie bei den verletzten Kindern.

<table><tbody><tr><td>2-Methyl-Butan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol Antiseptika</td><td>Pads Acme United Corporation</td><td>H305-200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision Software</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine Lösung (10% Povidon-Jod)</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>67618-150-01</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td></td></tr><tr><td>CFP Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Kryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Kryoformen</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td></td></tr><tr><td>Kryostaten</td><td>Klingen Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td></td></tr><tr><td>Kryoband</td><td>Schnitt Labor</td><td>Kryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen fein Schere&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene hämostatische Mückenzange</td><td>HuFriedyGroup</td><td>H3</td><td></td></tr><tr><td>cy5 Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>Zahnbohrer (0,5 mm Durchmesser)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zahnkleoid-Scheibenschnitzer</td><td>ACE Surgical Supply Inc.</td><td>6200097A-EA</td><td></td></tr><tr><td>Trockener Glasperlensterilisator (Inotech Steri 350)</td><td>Inotech Bioscience, LLC</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>Ohrloch</td><td>Fine Science Tools</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>Elektrisches Heizkissen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Fußsteuerung</td><td>Nouvag AG</td><td>1866nou</td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Motoren 31 ESS</td><td>Nouvag AG</td><td>2063nou</td><td></td></tr><tr><td>Umweltbarriere (3 x 12 Zoll Rohr Sox)</td><td>Patterson Companies, Inc.</td><td>BB-0312H</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR (Buprenorphin injizierbare Suspension mit verlängerter Freisetzung) 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>86084-100-30</td><td></td></tr><tr><td>Faxitron Röntgenschrank</td><td>Kubtech Scientific</td><td>Parameter</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Handstück (Winkelstück 32:1 Druckknopf)</td><td>Nouvag AG</td><td>5201</td><td></td></tr><tr><td>Systemsteuerung für Implantologie/Oralchirurgie (Straumann)</td><td>Nouvag AG</td><td>SEM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sofortversiegelnder Sterilisationsbeutel mit zwei internen/externen Prozessindikatoren (3 1/2 x 5 1/4&nbsp; Zoll)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-50</td><td></td></tr><tr><td>Sofort versiegelnder Sterilisationsbeutel mit zwei internen/externen Prozessindikatoren (5 4/1 x 10 Zoll)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze (29 g)</td><td>Exel International</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran& nbsp;</td><td>Dechra Pharmaceuticals plc</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Anästhesiesystem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>39010</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Nadel (20 G)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>HuFriedyGroup</td><td>NHCW</td><td></td></tr><tr><td>Neutral gepuffertes Formalin (10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Unsterile Applikatortupfer</td><td>Allegro Industries</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>Vliesgaze (3 x 3 Zoll)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028560</td><td></td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td>Norland Optical</td><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe (Optixcare Augenschmiermittel)</td><td>CLC Medica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Parodontalsonde</td><td>HuFriedyGroup</td><td>PQW</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 (1x)</td><td>Gibco, von Life Technologies</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger aus Kunststoff</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71890-01</td><td></td></tr><tr><td>Professioneller Clipper/Trimmer (Wahl Classic Peanut)</td><td>Wahl Clipper Corporation</td><td>8685</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>62800-46</td><td></td></tr><tr><td>Scanco Medical Software</td><td>SCANCO Medical</td><td>Scanco &mu; CT 50</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat wasserfrei</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitrit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtartrat zweibasisches Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td></td></tr><tr><td>Probenscheibe</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl #15 chirurgische Klinge&nbsp;</td><td>Aspen Chirurgische Produkte, Inc.</td><td></td><td></td>371615</tr><tr><td>Sterile OP-Handschuhe</td><td>Cardinal Health, Inc.</td><td>2D72PT65X</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Handtuchtuch (18 x 26 Zoll)</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (1 mL)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Ungefärbtes geflochtenes beschichtetes Vicryl-Nahtmaterial (5-0)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>J490G</td><td></td></tr><tr><td>UV-Schwarzlicht</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr></tbody></table>

tricolor-transgenes mausmodell zur untersuchung von wachstumsfugenverletzungen

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

Die Knorpelwachstumsfugen in den Knochen von Kindern ermöglichen die Verlängerung der Gliedmaßen, sind aber im Verhältnis zum Knochen schwach, was sie anfällig für Frakturen macht, wenn die Knochen überlastet werden. Bessere Behandlungen für stark frakturierte Wachstumsfugen sind erforderlich, da die Reaktion auf eine Verletzung eine knöcherne Brücke ist, die die Wachstumsfuge vorzeitig verschmilzt, was zu verkümmerten und/oder krummen Gliedmaßen führt. Mausmodelle der Wachstumsfugenverletzung sind vorteilhaft für mechanistische Studien, stellen aber eine Herausforderung dar, da es schwierig ist, die kleinen Wachstumsfugen bei jungen Mäusen sichtbar zu machen und präzise zu verletzen. Wir beschreiben hier ein verbessertes Wachstumsfugen-Verletzungsmodell unter Verwendung transgener Mäuse mit tri-lineage fluoreszierenden Reportern für die Kollagentypen I, II und X.
Diese Mäuse zeigen eine native Fluoreszenz, die mit den drei primären Substraten der Wachstumsfuge assoziiert ist. Eine Wachstumsfugenverletzung, die einer Salter-Harris-Typ-II-Verletzung ähnelt, wird reproduzierbar mit einem Bohrer erzeugt, wobei der hypertrophe Abschnitt der Wachstumsfuge als Referenz während der Live-Bildgebung unter Fluoreszenz-Stereomikroskopie-Führung verwendet wird. Die gefrorene histologische Analyse der nativen Fluoreszenz vereinfacht die Beurteilung der zellulären Reaktion auf Verletzungen. Diese Methodik stellt einen wesentlichen Sprung in der Erforschung von Wachstumsfugenverletzungen dar und bietet eine detaillierte und reproduzierbare Methode zur Untersuchung der Pathologie und zur Evaluierung neuer therapeutischer Strategien.

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reportermäuse mit Trilineage, um einen Defekt der lateralen Wachstumsfuge in der proximalen Tibia präzise zu induzieren, indem die inhärente rote Fluoreszenz, die von Typ-X-Kollagen emittiert wird, für die chirurgische Führung genutzt wird. Die Sicht, die der Chirurg hat, wenn er mit dem mCherry-Filterset durch das Stereomikroskop-Okular schaut, ist in Abbildung 2D dargestellt. Die native Typ-X-Fluoreszenz ermöglicht es dem Chirurgen, den Bohrer in der hypertrophen Zone zu platzieren und eine Verletzung zu erzeugen, die eine häufige Art von Wachstumsfugenverletzung nachahmt, die zu einer knöchernen Brücke führt (Abbildung 2F). Die Fluoreszenz unter dem roten Kanal ist am hellsten und wird daher für die Verwendung während der Bohrerplatzierung empfohlen. Alternativ könnte die Defektentstehung durch die Verwendung anderer Farben der nativen Fluoreszenz der dreifach transgenen Mäuse gesteuert werden, wenn das Ziel des Experiments darin besteht, Verletzungen in anderen Zonen der Wachstumsfuge als der hypertrophen Zone und der angrenzenden verkalkten Region zu untersuchen.
Die Bildung eines Salter-Harris-Typ-II-ähnlichen Defekts in der hypertrophen Zone der Wachstumsfuge und des angrenzenden unteren Knochengewebes unter Verwendung eines Zahnbohrers mit einem Durchmesser von 0,5 mm wurde durch MikroCT und kryohistologische Bildgebung der verletzten (Zeit 0) proximalen Tibias im Vergleich zu den unverletzten lateralen Kontrollen bei N = 3 Mäusen validiert (Abbildung 4). Die Defekte waren in den 3D-MikroCT-Bildern schwer zu erkennen, waren aber in den 2D-Querschnitten erkennbar (Abbildung 3A,B,E,F). Abbildung 3G zeigt die Verteilung von kollagenproduzierenden Knochenzellen vom Typ I (grüne Fluoreszenz), kollagenproduzierenden proliferativen Chondrozyten vom Typ II (Cyan-Fluoreszenz) und kollagenproduzierenden hypertrophen Chondrozyten vom Typ X. Auf dem Bild der verletzten Maus (Abbildung 4G) ist eine Störung der hypertrophen Zone, der provisorisch verkalkten Schicht und eines Teils des neu gebildeten Knochens relativ zur Kontrolle zu sehen, wobei die proliferative Zone nur leicht gestört ist. Die Safranin O/Fast Green-Färbung (Abbildung 4H) veranschaulicht am besten die Position des Defekts innerhalb der verletzten Wachstumsfuge, da alle Zellen deutlich sichtbar sind.
Die Röntgenanalyse gibt an lebenden Mäusen Aufschluss über die Auswirkungen dieser Art von Wachstumsfugenverletzung auf die Tibialänge und die Knochenbrückenbildung im Laufe der Zeit (Abbildung 3). Die vergleichende Bildgebung zwischen unverletzten (Abbildung 3A) und verletzten (Abbildung 3B) Tibien, die vor der Operation und 3 Wochen nach der Operation aufgenommen wurde, zeigt eine große Menge an Gliedmaßenwachstum, eine Ausdünnung der Wachstumsfugen und eine ausgeprägte undurchsichtige Region, die sich nach 3 Wochen im Bereich der verletzten Wachstumsfuge entwickelt hat. Diese Trübung innerhalb der Wachstumsfuge ist weder beim unverletzten Gegenstück noch bei den Mäusen vor der Operation vorhanden. Faxitron ist somit eine Möglichkeit, pathologische Veränderungen zu beobachten, die durch die Verletzung bei lebenden Mäusen hervorgerufen werden, wie z. B. die Bildung einer knöchernen Brücke und Veränderungen der Gliedmaßenlänge.
Die MikroCT-Bildgebung von präparierten Knochen bietet eine detaillierte Visualisierung der Knochenbrückenbildung innerhalb der verletzten Wachstumsfugen drei Wochen nach der Operation (Abbildung 5). Wie auf den Bildern von sechs verschiedenen verletzten Mäusen zu sehen ist, die in Abbildung 5 gezeigt sind, gibt es bei allen Mäusen eine konsistente Entwicklung der knöchernen Brücken. Unter Verwendung der Scanco Medical Software wurde das Volumen der knöchernen Brücke berechnet, indem jeder Abschnitt der proximalen tibialen Wachstumsfuge überprüft, der Bereich der knöchernen Brücke (Abbildung 5B) mit dem Auswahlwerkzeug abgegrenzt und dann jeder Schnittbereich über das gesamte Volumen der Wachstumsfuge integriert wurde, um das Gesamtvolumen24 zu erhalten. Das auf diese Weise berechnete knöcherne Brückenvolumen betrug 0,0761 mm3 ± 0,0246 (mittlere ± Standardabweichung, N = 6). Der Großteil der knöchernen Brücken bildet sich trotz des lateralen Zugangs nahe der Mitte der Wachstumsfuge aus, wodurch sowohl der äußere Rand als auch die Mitte der Wachstumsfuge verletzt werden. Dieses Phänomen ist darauf zurückzuführen, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus dem Knochenmark und nicht aus dem Perichondrium für die Bildung von Knochenbrücken verantwortlich sind25.
Bei diesen dreifarbigen transgenen Mäusen wird die kryohistologische Analyse der verletzten Wachstumsfuge durch die native Kollagenfluoreszenz angereichert (Abbildung 6). Sie zeigt das komplexe Zusammenspiel von Knochenzellen und Chondrozyten an der Verletzungsstelle. Die in Abbildung 6J,K gezeigten MicroCT-Bilder wurden dem Histologietechniker zur Verfügung gestellt, um die Einbettung und Schnittbestimmung zu leiten. Die kollagenproduzierenden Knochenzellen vom Typ I sind in Abbildung 6L,O,P (grüne Fluoreszenz) zu sehen, während die kollagenproduzierenden proliferativen Chondrozyten vom Typ II in Abbildung 6L,O,Q (cyanfarbene Fluoreszenz) zu sehen sind. Kollagen-produzierende hypertrophe Chondrozyten vom Typ X sind in Abbildung 6L,O,R (rote Fluoreszenz) zu sehen. Dieser mehrfarbige Fluoreszenzansatz ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der postoperativen Chondrozytendifferenzierung im Bereich der knöchernen Brücke vor dem Hintergrund von mineralisiertem Gewebe. Die DAPI-Färbung wurde verwendet, um die Verteilung aller Zelltypen innerhalb des Wachstumsplattenbereichs zu bestätigen (Abbildung 6M). Die Safranin O/Fast Green-Färbung zeigt die kompositorische und strukturelle Organisation von Knorpel und Knochen innerhalb der verletzten Wachstumsfuge (Abbildung 6N). Die Bildgebung dieser gefärbten Schnitte unter einem Cy5-Filterset hellt die Ruhezonenzellen an der Grenzfläche zwischen Epiphysenknochen und Knorpel deutlich auf.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig03.jpg"> Abbildung 3: Röntgenbilder der kontralateralen Kontrolle und der verletzten Tibien der Maus. (A) Röntgenbilder der kontralateralen Kontrolltibia werden kurz vor der Verletzung aufgenommen, wenn die Mäuse 2 Wochen alt sind, und 3 Wochen nach der Operation, wenn die Mäuse 5 Wochen alt sind, um das Ausmaß des Wachstums zu zeigen, das in diesem Zeitraum stattfindet. (B) Verletzte Tibia von derselben Maus zu gleichen Zeitpunkten wie in (A). Die für die Messung der Tibialänge verwendeten Orientierungspunkte sind die Spitze des proximalen Tibiakopfes bis zum Ende der Tibia am Sprunggelenk (rote Doppelpfeile). Die undurchsichtige knöcherne Brücke ist nach 5 Wochen in der verletzten proximalen Tibia-Wachstumsfuge sichtbar. Maßstabsstäbe = 5,00 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig04.jpg"> Abbildung 4: MicroCT und histologische Bilder der kontralateralen Kontrolle zum Zeitpunkt Null und der verletzten proximalen Tibiae der Maus. (A,E) und (B,F) zeigen 3D- und transversale 2D-MikroCT-Ansichten, wobei der Defekt durch rote Pfeile in (E) und (F) gekennzeichnet ist. (C,G) Komposit-zusammengeführte kryohistologische Bilder, die drei angeborene Fluoreszenzschichten mit einer mineralisierten Gewebeschicht verschmelzen. Grüne Blutkörperchen (Col3.6GFPtpz) sind die kollagenproduzierenden Knochenzellen vom Typ I, cyanblau gefärbte Zellen (Col2A1GFPcyan) sind kollagenproduzierende proliferative Chondrozyten vom Typ II und rote Blutkörperchen (Col10A1RFPchry) sind kollagenproduzierende hypertrophe Chondrozyten vom Typ X. (D,H) Safranin O/Fast Green-Färbung aus der gleichen Region wie (C) und (G). Maßstabsstäbe = 1,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig05.jpg"> Abbildung 5: MicroCT-Bilder von knöchernen Brücken, die nach diesem Protokoll gebildet wurden. (A,C,E,G,I,K) Querschnitte der proximalen tibialen Wachstumsfuge von sechs verschiedenen Mäusen 3 Wochen nach der Entstehung des Bohrerdefekts. Knöcherne Brücke, die durch eine rot gestrichelte Linie in (A) umrandet ist. (B,D,F,H,J,L) 3D-Rekonstruktionen mit weggeschnittener Längsebene. Knöcherne Brücke, die in (B) durch eine rot gestrichelte Linie umrandet ist. Maßstabsstäbe = 1,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig06.jpg"> Abbildung 6: MikroCT und histologische Bilder der kontralateralen Kontrolle und der verletzten proximalen Tibia der Maus mit Knochenbrückenbildung. (A,J) und (B,K) zeigen 3D- und transversale 2D-MikroCT-Ansichten, wobei die knöcherne Brücke durch gelbe Pfeile in (J) und (K) gekennzeichnet ist. (C,L) Komposit-zusammengeführte kryohistologische Bilder, die drei angeborene Fluoreszenzschichten mit einer mineralisierten Gewebeschicht verschmelzen. Grüne Blutkörperchen (Col3.6GFPtpz) sind die kollagenproduzierenden Knochenzellen vom Typ I, cyanblau gefärbte Zellen (Col2A1GFPcyan) sind kollagenproduzierende proliferative Chondrozyten vom Typ II und rote Blutkörperchen (Col10A1RFPchry) sind kollagenproduzierende hypertrophe Chondrozyten vom Typ X. Das weiße Feld zeigt die höhere Vergrößerung an, die in den Feldern F und O angezeigt wird. (D,M) Das mineralisierte Gewebe und die DAPI-Färbung im Bereich der Wachstumsfuge der Panels C und L. (E,N) Safranin O/Fast Green-Färbung der gleichen Region wie (D) und (M), gescannt mit cy5-Fluoreszenz. (F,O) Eine höhere Vergrößerung des Bereichs der Wachstumsfuge im zusammengeführten Bild der Tafeln C und L. (G-I,P-R) Einzelne Kanäle der nativen Fluoreszenz sind mit einem mineralisierten Gewebehintergrund dargestellt. Maßstabsleisten = 1,0 mm (A-E) und (J-N), = 250 μm in (F-I) und (O-R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Mausmodell für Verletzungen der Knochenwachstumsfugen bei Jugendlichen. Unter Verwendung transgener Mäuse mit Fluoreszenzreportern der Tri-Linie für die Kollagentypen I, II und X, den primären Matrices, die mit drei verschiedenen Substraten der Wachstumsfuge assoziiert sind, wird die Platzierung von Verletzungen durch native Fluoreszenz unter dem Mikroskop gesteuert.

Tricolor-transgenes Mausmodell zur Untersuchung von Wachstumsfugenverletzungen

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

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Forschung

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