Name: Mitochondriale Transformation bei Baker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Erfahren Sie die mitochondriale Transformation in Saccharomyces cerevisiae zur Untersuchung der Proteinbiosynthese-Regulation und Atmungskomplex-Assemblierung. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in molekulare Mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Veröffentlichung wurde unterstützt von Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 zu XP-M]. Die UPD ist ein CONAHCYT Fellow (CVU:883299). Wir danken Dr. Ariann Mendoza-Martínez für die technische Hilfe bei den lichtmikroskopischen Bildern. Biorender-Lizenzen: DU26OMVLUU (Abbildung 2); BK26TH9GXH (Abbildung 3); GD26TH80R5 (Abbildung 4); PU26THARYD (Abbildung 7); ML26THAIFG (Abbildung 9).

HINWEIS: Wir empfehlen, für jedes Konstrukt sechs Transformationen durchzuführen, da die Effizienz der mitochondrialen Transformation in der Regel gering ist. Die Zusammensetzung der verschiedenen Wachstumsmedien ist in Tabelle 2 dargestellt.
1. Vorbereitung von Wolframpartikeln
<ol><li>Wiegen Sie 30 mg 0,7 μm Wolframpartikel (WPs, Microcarrier) in einem Mikroröhrchen. Fügen Sie 1,5 ml 70%iges Ethanol (EtOH) zum Sterilisieren hinzu. Die WPs vernetzen und 10 min bei Raumtemperatur ruhen lassen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 13.200 x g für 15 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die WPs, indem Sie den Partikeln 1,5 ml steriles Wasser hinzufügen, sie vortexen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13.200 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 500 μl steriles 50%iges Glycerin hinzu (die Endkonzentration beträgt 60 μg WPs/μl). HINWEIS: WPs können mindestens 6 Monate bei -20 °C gelagert werden. Entnehmen Sie aus diesem Vorrat die benötigte Menge für sechs Transformationen (100 μL).</li>
</ol>2. WPs DNA-Beschichtung
<ol><li>5 μg des 2 μ Plasmids und 15 μg des bakteriellen Plasmids, das die mitochondriale Sequenz enthält, werden in ein Mikroröhrchen auf Eis gegeben. HINWEIS: Das Endvolumen darf 50 μl nicht überschreiten, um eine weitere Verdünnung der für die DNA-Beschichtung benötigten Reagenzien zu vermeiden.</li>
	<li>100 μl der WP-Suspension zugeben und 5 s lang (6 mg WP) vortexen.</li>
	<li>Fügen Sie 4 μl 1 M Spermidin hinzu. Kurz Wirbel.</li>
	<li>100 μL eiskalte 2,5 M CaCl2 zugeben, kurz vortexen. 10 Minuten auf Eis inkubieren; Alle 3 Min. die Mischung kurz aufwirbeln. HINWEIS: Die CaCl2-Lösung ist filtersterilisiert und darf nicht autoklaviert werden.</li>
	<li>Die WP werden 30 s lang bei 13.200 × g bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Waschen Sie die Partikel, indem Sie sie vorsichtig in 200 μl 100 % EtOH bei -20 °C resuspendieren.</li>
	<li>Die WP werden 30 s lang bei 13.200 × g bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die WPs in 60-70 μl Raumtemperatur 100 % EtOH mit einer Pipettenspitze; Nicht wirbeln. HINWEIS: Um die Qualität der Plasmide zu gewährleisten, sollte die DNA-Beschichtung am selben Tag wie die biolistische Transformation durchgeführt werden.</li>
</ol>3. Biolistische Materialaufbereitung
<ol><li>Vor dem Beschuss werden sechs Makroträgerhalter (Abbildung 5) in einem Autoklaven sterilisiert und gründlich getrocknet. Alternativ können Sie sie in EtOH einweichen und mit Hilfe einer Pinzette mit einer Flamme sterilisieren. Lege sie auf eine sterile Glasplatte.</li>
	<li>Bei der DNA-Präzipitation (10 min Inkubation auf Eis in Schritt 2.4) werden mit Hilfe einer sterilen Pinzette jeweils sechs Makrocarrier (oder fliegende Scheiben) in einen der sechs Makrocarrier-Halter eingeführt. HINWEIS: Sterilisieren Sie die Makrocarrier nicht.</li>
	<li>Mischen Sie die DNA-beschichteten WPs mit der Pipette. Geben Sie 10 μL der WPs auf jede Makroträgeroberfläche und verteilen Sie sie mit der Pipettenspitze über die gesamte Oberfläche. Geben Sie bei Bedarf einige zusätzliche Mikroliter 100 % EtOH auf die Makroträgeroberfläche, um eine gleichmäßige Verteilung der WPs zu erzielen. Lassen Sie die Suspension ~20 min bei Raumtemperatur trocknen.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Hefezellen und Bombardementplatten
<ol><li>Inokulieren Sie den rho 0-Rezeptorstamm auf 2 ml YPR-Medium (Tabelle 2). Anbau für eine Nacht bei 30 °C in einem rotierenden Rad.</li>
	<li>300 μl der Kultur in 30 ml frischem YPR-Medium verdünnen. Grow bei 30 °C und 200 U/min auf einem Rotationsschüttler für zwei Nächte, bis die Kultur gesättigt ist.</li>
	<li>Die Hefezellen bei 600 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Hefezellen in 600 μl YPD-Medium resuspendieren (Tabelle 2).</li>
	<li>Mit einem sterilen Glasgriff 100 μl der Hefezellsuspension auf eine feste Bombardement-Medium-Platte verteilen. HINWEIS: Dem Bombardement-Medium darf die Auswahlmarkierung des 2-μ Plasmids fehlen, das für die Transformation verwendet wird.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.4 für die anderen fünf Platten.</li>
	<li>Vor dem Beschuss 1-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um sicherzustellen, dass das flüssige Medium vollständig von der Oberfläche der Platte absorbiert wird.</li>
</ol>5. Erzeugung eines synthetischen Rho-Stammes durch biolistische Transformation
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, lesen Sie unbedingt die Bedienungsanleitung für das biolistische Gerät. Wir werden das Protokoll der referenzierten Geräte beschreiben (Materialtabelle und Abbildung 5).
<ol><li>Reinigen Sie die Kammer des biolistischen Partikelabgabesystems mit 70% Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden, und lassen Sie es mindestens 10 Minuten stehen. Wischen Sie die Oberfläche kurz vor dem Bombardement mit einem sauberen Papiertuch ab.</li>
	<li>Öffnen Sie die Ventile des Heliumtanks, um einen Wert von etwa 2.000 psi einzustellen.</li>
	<li>Schalten Sie das Gerät ein und schalten Sie die Vakuumquelle ein.</li>
	<li>Legen Sie den Makroträger mit einer Pinzette nach unten auf den Makroträgerhalter. HINWEIS: Verwenden Sie nicht das mit dem Gerät gelieferte Stoppsieb.</li>
	<li>Schrauben Sie den Deckel des Makroträgers auf den Makroträger. Alle Teile zusammen bilden das Microcarrier-Startsystem (Abbildung 5).</li>
	<li>Platzieren Sie das Microcarrier-Startsystem in der Vakuumkammer auf der fünften Ebene von unten.</li>
	<li>Platzieren Sie eine der Platten mit dem Rasen rho0 auf der zweiten Ebene vom Boden der Kammer aus. Stellen Sie sicher, dass die Platte nach oben zeigt und ohne Deckel ist.</li>
	<li>Legen Sie mit einer sterilen Pinzette eine Berstscheibe auf die Haltekappe. Schrauben Sie die Haltekappe auf das Beschleunigungsrohr; Stellen Sie sicher, dass die Haltekappe fest sitzt. HINWEIS: Behandeln Sie die gerissenen Bandscheiben nicht mit Isopropanol, wie in der Bedienungsanleitung empfohlen, da wir beobachtet haben, dass die Umwandlungseffizienz abnimmt.</li>
	<li>Schließen Sie die Tür der Vakuumkammer.</li>
	<li>Bringen Sie den VAC/VENT/ HOLD-Schalter in die VAC-Position . Wenn ein Vakuum von 25-28 inHg erreicht ist, stellen Sie den VAC/VENT/HOLD-Schalter in die Position HOLD . HINWEIS: Beachten Sie, dass das erreichbare Vakuum je nach Meereshöhe variieren kann. Wir hatten Erfolg, 25 inHg zu erreichen.</li>
	<li>Drücke den FIRE-Schalter , um die WPs abzuschießen. Warte, bis der Druck im Beschleunigungsrohr 1.300 psi erreicht, dann bricht die Berstscheibe und macht ein Knallgeräusch.</li>
	<li>Unmittelbar nach dem Bruch der Berstscheibe werden der FIRE-Schalter und das Vakuum freigegeben, indem der VAC/VENT/ HOLD-Schalter in die Position VENT gebracht wird.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pinzette alle Rückstände der Berstscheibe, die sich auf der Oberfläche der Platte befinden, und decken Sie die Platte mit ihrem Deckel ab.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen fünf Platten und setzen Sie in jeder Runde eine neue Berstscheibe und einen neuen Makroträger ein.</li>
	<li>Schließen Sie am Ende das Hauptventil des Heliumtanks.</li>
	<li>Schließen Sie die Kammer und bauen Sie ein Vakuum auf, indem Sie den VAC/VENT/ HOLD-Schalter in die VAC-Position bringen. Befreien Sie das System von jeglichem Heliumdruck, indem Sie den FIRE-Schalter einige Male drücken und wieder loslassen. Wiederholen Sie den Vorgang bei geöffneter Tür.</li>
	<li>Schalten Sie die Vakuumpumpe und die Bombardement-Ausrüstung aus.</li>
	<li>Reinigen Sie das Zuführsystem mit 70 % EtOH. Waschen Sie die Makroträgerstützen mit einer 0,1%igen SDS-Lösung; Mit sterilem destilliertem Wasser und 100% EtOH abspülen.</li>
</ol>6. Selektion synthetischer Rho-Kolonien
<ol><li>Die Bombardementplatten 5-7 Nächte bei 30 °C inkubieren. HINWEIS: Es ist wichtig, die Platten täglich auf Verschmutzungen zu überprüfen. Bei Bedarf kann der kontaminierte Bereich mit einem sterilen Spachtel ausgeschnitten werden, um eine weitere Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Beimpfen Sie den Testerstamm des entgegengesetzten Paarungstyps über Nacht in 2 mL YPD-Medium (siehe das spezifische Beispiel in Abbildung 2D,E).</li>
	<li>Beimpfen Sie 150 μl der Stammkultur des Testers auf einer YPD-Platte. Verteilen Sie den Tester mit einem sterilen Glasgriff gleichmäßig auf der Plattenoberfläche. Lass die Platte mindestens 5 min trocknen.</li>
	<li>Stelle Repliken der Bombardementplatten mit Samt-Replizierpads und einem Replikatorstempel her.<ol><li>Replizieren Sie auf einer Dropout-Mediumplatte, die dem transformierten 2-μ-Plasmid-Auxotrophiemarker entspricht. Das Wachstum dauert eine Inkubation über Nacht bei 30 °C. Danach bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C lagern. Diese Platte ist die Masterplatte.</li>
		<li>Replizieren Sie es auf der YPD-Platte, die den Rasen des Testers aus Schritt 6.3 enthält. Zwei Nächte lang bei 30 °C inkubieren. Anschließend repliziert man diese Platte auf dem selektiven Medium, um das Vorhandensein des mitochondrialen Gens von Interesse, beispielsweise eines Atemmediums oder eines Mediums, dem Arginin fehlt, nachzuweisen, und inkubiert über Nacht bei 30 °C. Nur die Zellen, die das synthetische bakterielle Plasmid in den Mitochondrien beherbergt haben, wachsen nach der Paarung mit dem Testerstamm auf dem Selektivmedium.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizieren Sie auf der Masterplatte (Schritt 6.4.1) die entsprechenden Völker, die in Schritt 6.4.2 gewachsen sind. HINWEIS: Da die Beschussplatte (und damit die Masterplatte) mit Transformantenkolonien überfüllt ist, kann es schwierig sein, die positiven Kolonien zu identifizieren, die auf der Gegenplatte des Testers beobachtet wurden. Aus diesem Grund ist es sehr empfehlenswert, auf jeder Seite aller Platten mit einem Permanentmarker ein paar kleine Linien zu zeichnen. Zeichnen Sie ähnliche Linien auf den Ring des replizierenden Stempels. Diese Linien sind hilfreich beim Ausrichten und Lokalisieren positiver Kolonien auf der Masterplatte (siehe Beispiel in Abbildung 2D).</li>
	<li>Reinigen Sie die positiven Kolonien, indem Sie sie von der Master-Platte auf eine zweite selektive Dropout-Platte streichen, wie in Schritt 6.4.1. Zwei Nächte bei 30 °C inkubieren. HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Schlieren das Wachstum einzelner Völker ermöglicht, um einen reinen Stamm zu gewährleisten.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Auswahlprozess (Schritte 6.2-6.5), um das Vorhandensein des bakteriellen Plasmids in den Mitochondrien zu bestätigen. HINWEIS: In der Regel kann dieser Vorgang zwei weitere Male wiederholt werden, um stabile synthetische Stämme auszuwählen.</li>
	<li>Sobald der synthetische Rho-Stamm die Plasmid-DNA in den Mitochondrien stabil hält, wählen Sie 3-5 verschiedene positive Kolonien aus und inokulieren Sie sie in 2 ml YPD. Verwenden Sie diese Kultur, um einen Kryovialfond herzustellen (durch Mischen von 600 μl Kultur und 600 μl 50 % Glycerin, um sie bei -70 °C zu konservieren) und um die Plasmidsequenz durch Zytoduktion in die gewünschte mtDNA einzufügen (Schritt 6.7). ANMERKUNG: Da kein Selektionsdruck besteht, um das transformierte Plasmid in den Mitochondrien aus dem synthetischen Rho-Stamm aufrechtzuerhalten, kann das Plasmid leicht verloren gehen. Daher empfehlen wir, die Zytoduktion so schnell wie möglich durchzuführen.</li>
</ol>7. Integration der im synthetischen Rho-Stamm vorhandenen Konstruktion in die Zielstelle im mitochondrialen Genom durch Zytoduktion
<ol><li>Beimpfen Sie zwei Röhrchen mit 3 mL YPD-Medien , eines mit den Spenderzellen (synthetische Rho-Zellen) und eines mit den Akzeptorzellen (Hefezelle, bei der die endgültige Konstruktion erwartet wird). Über Nacht bei 30 °C inkubieren.</li>
	<li>Mischen Sie 750 μl des Spenderstamms und 250 μl des Rezeptorstamms in einem sterilen Mikroröhrchen (Verhältnis 3:1).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Mischung 1 Minute lang bei 13.200 × g; Entsorgen Sie den Überstand. Nehmen Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze, bei der das Ende abgeschnitten ist, einen Tropfen des Zellpellets und geben Sie es auf eine YPD-Platte. Bei 30 °C für 2-4 h inkubieren. HINWEIS: Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, geben Sie nicht mehr als zwei Zellsuspensionen in eine einzige Platte (siehe Beispiel in Abbildung 4A).</li>
	<li>Nehmen Sie eine kleine Menge der Zellmischung, resuspendieren Sie sie in 15 μl sterilem Wasser auf einem Objektträger und legen Sie ein Deckglas auf. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop mit einem 40x- oder 100x-Objektiv auf das Vorhandensein von Schmoosen; Diese charakteristische Form zeigt sich, wenn zwei Gegenstücktypen vorhanden sind (Abbildung 3B).</li>
	<li>Wenn shmoos vorhanden sind, resuspendieren Sie eine kleine Menge (~0,5 mm3) der Zellmasse in 2 mL YPD-Medium. 2 h bei 30 °C in einem rotierenden Rad inkubieren, damit sich die zweikernigen Zygoten erholen können.</li>
	<li>Mischen Sie die Mischung und verdünnen Sie 10 μl der Zellsuspension in 990 μl sterilem Wasser (1:100 Verdünnung). Verwenden Sie Glasperlen oder einen sterilen Glasgriff, um 100 μl der Zellverdünnung auf ein Dropout-Medium zu verteilen, in dem nur der Akzeptorstamm (und sporadische Diploide) wachsen. 2-3 Nächte bei 30 °C inkubieren.</li>
	<li>Replizieren Sie die resultierenden Kolonien auf den erforderlichen selektiven Medien, wie in der Einleitung erläutert (Stufe 4; siehe Abbildung 4C für ein spezifisches Beispiel).</li>
	<li>Nach der Identifizierung positiver Kolonien werden diese auf demselben selektiven Medium wiederhergestellt, um den haploiden Stamm zu reinigen, der die interessierende mtDNA trägt.</li>
	<li>Wählen Sie mindestens zwei positive Kolonien aus und züchten Sie sie über Nacht auf 2 ml YPD-Medium bei 30 °C. Erstellen Sie ein kryogenes Backup, indem Sie 600 μl 50 % Glycerin mit 600 μl der gesättigten YPD-Kultur mischen. Bei -70 °C lagern.</li>
	<li>Isolierung der DNA der resultierenden Stämme31,32. Amplifizieren Sie die gewünschte Region durch PCR und Sequenzierung, um das Vorhandensein der mitochondrialen Mutation zu bestätigen. HINWEIS: Jede positive Kolonie ist ein technisches Replikat, das unabhängig bestätigt werden muss, um die korrekte Sequenz im mitochondrialen Genom zu gewährleisten.</li>
</ol>

Biolistische Transformation von Hefe-Mitochondrien für die mutagenetische Analyse

<ol><li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+mutated+initiation+codons+in+the+mitochondrial+COX2+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae+fused+to+the+reporter+gene+ARG8m+reveals+lack+of+downstream+reinitiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation.</a> Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).</li>
<li>Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox2p+of+yeast+cytochrome+oxidase+assembles+as+a+stand-alone+subunit+with+the+Cox1p+and+Cox3p+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules.</a> J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).</li>
<li>Flores-Mireles, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochrome+b+carboxyl+terminal+region+is+necessary+for+mitochondrial+complex+III+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly.</a> Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).</li>
<li>Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+versus+nuclear+gene+expression+and+membrane+protein+assembly%3A+the+case+of+subunit+2+of+yeast+cytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome.</a> Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).</li>
<li>García-Villegas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cox1+C-terminal+domain+is+a+central+regulator+of+cytochrome+c+oxidase+biogenesis+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria.</a> J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).</li>
<li>Rak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+lacking+the+mitochondrial+gene+encoding+the+ATP+synthase+subunit+6+exhibit+a+selective+loss+of+complex+IV+and+unusual+mitochondrial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology.</a> J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).</li>
<li>Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mss51p+promotes+mitochondrial+Cox1p+synthesis+and+interacts+with+newly+synthesized+Cox1p%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p.</a> EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).</li>
<li>Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrially+synthesized+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+and+Cox3p+depends+on+targeting+information+in+untranslated+portions+of+their+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs.</a> EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).</li>
<li>Saracco, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox18p+is+required+for+export+of+the+mitochondrially+encoded+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+C-tail+and+interacts+with+Pnt1p+and+Mss2p+in+the+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane.</a> Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).</li>
<li>McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+assembly+intermediates+containing+subunit+1+of+yeast+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase.</a> J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).</li>
<li>Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rieske+FeS+protein+encoded+and+synthesized+within+mitochondria+complements+a+deficiency+in+the+nuclear+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).</li>
<li>Franco, L. V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allotopic+expression+of+COX6+elucidates+Atco-driven+co-assembly+of+cytochrome+oxidase+and+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).</li>
<li>Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Barstar+as+a+selectable+marker+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria.</a> Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).</li>
<li>Cohen, J. S., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+green+fluorescent+protein+from+a+recoded+gene+inserted+into+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA.</a> Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
<li>Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+reporter+genes+into+mitochondrial+DNA+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).</li>
<li>Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recoded+nuclear+gene+inserted+into+yeast+mitochondrial+DNA+is+limited+by+mRNA-specific+translational+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).</li>
<li>Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARG8m+reporter+for+the+study+of+yeast+mitochondrial+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation.</a> Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).</li>
<li>Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+functions+of+Mss51+couple+synthesis+of+Cox1+to+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).</li>
<li>Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+Chlamydomonas+reinhardtii+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).</li>
<li>Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transformation+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA.</a> IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).</li>
<li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+alteration+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA+by+biolistic+transformation+and+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination.</a> Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).</li>
<li>Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria+using+the+biolistic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun.</a> Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).</li>
<li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).</li>
<li>Shingú-Vázquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+end+of+Cox1+is+required+for+feedback+assembly+regulation+of+Cox1+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).</li>
<li>Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+COX2+mRNA+is+controlled+by+the+nucleotide+sequence+specifying+the+pre-Cox2p+leader+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide.</a> Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).</li>
<li>Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screening+in+Saccharomyces+cerevisiae+for+large+numbers+of+mitochondrial+point+mutations+which+affect+structure+and+function+of+catalytic+subunits+of+cytochrome-c+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase.</a> Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).</li>
<li>Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoduction+and+plasmiduction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cytoduction and plasmiduction in yeast.</a> Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).</li>
<li>Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoduction+as+a+new+tool+in+studying+the+cytoplasmic+heredity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast.</a> Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).</li>
<li>Conde, J., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae+defective+for+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).</li>
<li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+D+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory.+Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+manual.+2000+ed%22">Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunham%2C+MJ+%22Methods+in+yeast+genetics+and+genomics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual.+2015+edition%22">Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).</li>
<li>Ding, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27+An+improved+method+for+introducing+point+mutations+into+the+mitochondrial+cytochrome+B+gene+to+facilitate+studying+the+role+of+cytochrome+B+in+the+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species.</a> Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).</li>
<li>Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+control+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+the+role+of+Mig1+in+metabolic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions.</a> Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).</li>
<li>Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+and+-signalling+mechanisms+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast.</a> FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).</li>
<li>Gruschke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cbp3-Cbp6+complex+coordinates+cytochrome+b+synthesis+with+bc%281%29+complex+assembly+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria.</a> J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).</li>
<li>Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+activator+Sov1+coordinates+mitochondrial+gene+expression+with+mitoribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis.</a> Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).</li>
<li>Rak, M., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F1-dependent+translation+of+mitochondrially+encoded+Atp6p+and+Atp8p+subunits+of+yeast+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).</li>
<li>He, S., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+a+yeast+mitochondrial+inner+membrane+protein%2C+pnt1p%2C+block+export+of+a+mitochondrially+synthesized+fusion+protein+from+the+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix.</a> Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).</li>
<li>Rak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+translation+of+the+ATP8%2FATP6+mRNA+by+Smt1p%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p.</a> Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).</li>
<li>Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+engineering+coming-of-age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome engineering coming-of-age.</a> Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In der vorliegenden Arbeit wurde beschrieben, wie Mitochondrien aus der Hefe S. cerevisiae erfolgreich transformiert werden können. Der Prozess, vom Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss bis zur Reinigung des beabsichtigten Hefestammes, dauert ~8-12 Wochen, je nachdem, wie viele Reinigungsrunden des synthetischen Rho- Stammes notwendig sind. Einige der kritischen Schritte der Methode sind wie folgt. Erstens: Je größer die flankierenden Regionen, die um die Mutationsstelle im mitochondrialen Genk...

<table><tbody><tr><td>1 mL Pipettenspitzen</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikroröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L Pipettenspitzen</td><td>Axygen</td><td>T-10-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen mit konischem Boden&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>SCT-25ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettenspitzen</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konischer Boden &nbsp; Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>AfiII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Analytische Waage</td><td>OHAUS</td><td>ARA520</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>TOMY</td><td>ES-315</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Biolisitic Macrocarrier Halter&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td>VWR</td><td>89038-528</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0049</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ARG</td><td>Formedium</td><td>DCS0059</td><td></td></tr><tr><td>CSM -LEU</td><td>Formedium</td><td>DCS0099</td><td></td></tr><tr><td>CSM -URA</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DCS0169</tr><tr><td>Kulturglaskolben</td><td>KIMAX KIMBLE</td><td>25615</td><td></td></tr><tr><td>Kulturglasröhrchen</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>BD</td><td>215520</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>JT Baker&nbsp;</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Millipore</td><td>620006</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Sigma</td><td>Z265926</td><td></td></tr><tr><td>Glasgriff</td><td>Sigma</td><td>S4647</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>JT BAKER</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Heliumtank Grad 5 (99,99 %)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSTaq&nbsp; Kit</td><td>PCR BIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugue</td><td>Eppendorf</td><td>022620100</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>NB-G25</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He TM Biolistisches Partikelabgabesystem</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (100X10)</td><td>BD</td><td>252777</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Formedium</td><td>RAF03</td><td></td></tr><tr><td>Replica Plater</td><td>Scienceware</td><td>Z363391</td><td></td></tr><tr><td>Berstscheiben 1350 Psi</td><td>BIO-RAD</td><td>1652330</td><td></td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Sigma</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td></td><td>Sigma S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur-Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882015</td><td></td></tr><tr><td>Wolfram-Microcarrier M10</td><td>BIO-RAD</td><td>1652266</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe mit einer Kapazität von 100 l/min</td><td></td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Samt-Pads</td><td>Bel-Art</td><td>H37848-0002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex&nbsp;</td><td>Scientifc Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Holz-Applikator-Stick</td><td>PROMA</td><td>1820060</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondriale transformation bei baker

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

Die Backhefe Saccharomyces cerevisiae wird seit Jahrzehnten häufig zum Verständnis der mitochondrialen Biologie verwendet. Dieses Modell hat Erkenntnisse über essentielle, konservierte mitochondriale Signalwege zwischen Eukaryoten und Pilz- oder Hefe-spezifischen Signalwegen geliefert. Eine der vielen Fähigkeiten von S. cerevisiae ist die Fähigkeit, das mitochondriale Genom zu manipulieren, was bisher nur bei S. cerevisiae und der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii möglich ist. Die biolistische Transformation der Hefe-Mitochondrien ermöglicht es uns, ortsgerichtete Mutationen einzuführen, Genumlagerungen vorzunehmen und Reporter einzuführen. Diese Ansätze werden hauptsächlich verwendet, um die Mechanismen von zwei hochgradig koordinierten Prozessen in Mitochondrien zu verstehen: die Translation durch Mitoribosomen und die Assemblierung von respiratorischen Komplexen und ATP-Synthase. Die mitochondriale Transformation kann jedoch möglicherweise zur Untersuchung anderer Signalwege verwendet werden. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, wie Hefemitochondrien durch Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbeschuss transformiert, das beabsichtigte Transformanten ausgewählt und gereinigt und die gewünschte Mutation in das mitochondriale Genom eingeführt werden kann.

In diesem Abschnitt werden einige repräsentative Ergebnisse aus den verschiedenen Stadien der mitochondrialen Transformation vorgestellt. Abbildung 6 zeigt ein Bombardement-Verfahren. Die synthetischen rho-Zellen trugen ein bakterielles Plasmid mit dem Reportergen ARG8m, das die kodierende Sequenz eines mitochondrialen Gens ersetzen wird (Abbildung 6A). Nach dem Bombardement wurde die Platte auf einem Medium repliziert, dem Uracil ...

In dieser Arbeit wird erklärt, wie Hefe-Mitochondrien mit einer biolistischen Methode transformiert werden können. Wir zeigen auch, wie die Transformanten ausgewählt und gereinigt werden und wie die gewünschte Mutation an der Zielposition innerhalb des mitochondrialen Genoms eingeführt wird.

Mitochondriale Transformation bei Baker

Baker&#180;s yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used to understand mitochondrial biology for decades. This model has provided knowledge about ...

mitochondrial-transformation-baker-s-yeast-to-study-translation

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Die mitochondriale Atmung in ganzen Hefezellen ist ein wertvoller Indikator für die Bioenergetik der Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um diesen Phänotyp zu quantifizieren, das auf verschiedene Hefearten anwendbar ist.

Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in ganzen Hefezellen

Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe entwickelt sich zu einem attraktiven Modell für die Untersuchung von Mitochondrien. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Häufigkeit und des Aufbaus der mitochondrialen Atmungskomplexe in S. pombe. Dies ermöglicht die Charakterisierung der neuen Funktionen konservierter Gene in der mitochondrialen Atmungskette.

Analyse der Expression und der Assemblierung der Komplexe der mitochondrialen Atmungskettenproteine in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen - Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein - Tag kodiert.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Eine Strategie zur Erzeugung von Mutationen in Histon-Genen an ihrer endogenen Stelle in Saccharomyces cerevisiae wird vorgestellt.

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie Laser Microirradiation verwenden, um verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich der relativ einfachen Strangbrüche und komplexen Schäden an DNA-Schäden Signal- und Reparatur Faktor Montage an Schaden Standorten in-vivo Studie zu induzieren .

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Erfahren Sie die mitochondriale Transformation in Saccharomyces cerevisiae zur Untersuchung der Proteinbiosynthese-Regulation und Atmungskomplex-Assemblierung. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in molekulare Mechanismen.

Mitochondriale Transformation bei Baker

Weitere Videos entdecken