Name: Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Kollagenase-Leberperfusion zur Isolierung primärer Hepatozyten aus Ratten. Diese Methode ermöglicht die Kultur funktionaler 3D-Organoide für Langzeitstudien der Leberbiologie.

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<ol><li>Heslop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+evaluation+of+primary+human+hepatocyte+culture+using+global+proteomic+analysis+reveals+a+selective+dedifferentiation+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile.</a> Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).</li>
<li>Ietto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+liver+organoids%3A+Generation+and+importance+of+diverse+specialized+cellular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components.</a> Cells. 12 (10), 1429(2023).</li>
<li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+in+collagen+sandwich%3A+evidence+for+transcriptional+and+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation.</a> J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).</li>
<li>Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Hepatocytes+in+sandwich+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Primary Hepatocytes in sandwich culture.</a> Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hepatocyte+isolation+and+cultures%3A+Technical+aspects%2C+challenges+and+advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements.</a> Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).</li>
<li>Thompson, W. L., Takebe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+model+systems+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Human liver model systems in a dish.</a> Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+organoids+are+a+powerful+tool+for+the+study+of+liver+disease+and+personalized+treatment+design+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).</li>
<li>Raju, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pluripotent+stem+cell+differentiation+to+hepatocyte+ceases+further+maturation+at+an+equivalent+stage+of+e15+in+mouse+embryonic+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development.</a> Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).</li>
<li>Peng, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokine+TNFalpha+promotes+the+long-term+expansion+of+primary+hepatocytes+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3d+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+undergo+phenotypic+transformation+to+biliary+epithelium+in+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures.</a> Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).</li>
<li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGF%CE%B2-mediated+hepatocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLancaster%2C+MA+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+hepatocytes+with+multiparameter+perfusion+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control.</a> J Vis Exp. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), e3917(2012).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> J Vis Exp. (132), e56993(2018).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PREPARE%3A+Guidelines+for+planning+animal+research+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing.</a> Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).</li>
<li>Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+murine+primary+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+coculture+of+primary+rat+and+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).</li>
<li>Knobeloch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes%3A+isolation%2C+culture%2C+and+quality+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).</li>
<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01- ALK5-Inhibitor IV</td><td>Zwillingshelix</td><td>&nbsp; T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Echtzeit-PCR-Nachweissystem&nbsp;</td><td>&nbsp; Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488 Imaging Kit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen, Typ I, Lösung aus Rattenschwanz</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason&nbsp;</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck</td><td>&nbsp; E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium 25000 IE/5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td> 100-39H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen-Lösung 100x&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific 41400045</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin Lösung</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Leber Digest Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Wissenschaftlich</td><td>&nbsp; 17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Leberperfusionsmedium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>N2-Ergänzung</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Merck</td><td>&nbsp; N-0636</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS-Puffer 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td>Ismatec&trade; &nbsp;</td><td>MS-4/12 Reglo Digital Pumpe</td><td></td></tr><tr><td>TNFa</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 300-01A</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagenz</td><td>Merck</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch &nbsp;</td><td>Ismatec&trade; &nbsp;</td><td>&nbsp; ID.2,79mm</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E Medium, ohne Glutamin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Twin Helix</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion der rattenleber und isolierung primärer hepatozyten: ein altes verfahren, das für die hochmoderne 3d-organoidkultur entscheidend ist

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

Am Ende der Setup-Verfahren (Schritt 6.13) erhielten wir eine Zellausbeute von bis zu 1 x 108 Zellen pro Isolation aus der Leber von etwa 300 g einer Ratte. Eine Zellviabilität zwischen 78 % und 97 % wurde durch Trypanblau-Zählung festgestellt.
Wie bereits in früheren Studienbeschrieben 1,18,19, verlieren primäre Hepatozyten in Kultur ihre Morphologie, leberspezifische Funktionen, und sterben innerhalb weniger Tage ab.
In der Literatur ist bekannt23,24, dass primäre adulte Hepatozyten schnell die quaderförmig-hexagonale Morphologie verlieren, sich innerhalb weniger Tage in eine "fibroblastenähnliche" Form verwandeln und absterben. Abbildung 1 zeigt die verschiedenen Phasen: 4 h nach dem Plattieren auf einer kollagenbeschichteten Platte haften die Hepatozyten an der Oberfläche, verteilt in einer typischen Monoschicht mit quaderförmiger Morphologie, die Ränder der Zellen sind definiert, die Verbindungen zwischen den Zellen sind linear und die Oberfläche der Zellen sieht glatt aus (Abbildung 1A). An Tag 1 erhalten die primären Hepatozyten ihre typische hexagonale Form und Lipidtröpfchen werden sichtbar (Abbildung 1B). An den Tagen 2-3 nehmen die Lipidtröpfchen zu (Abbildung 1C-1D), während die Zellen an den Tagen 4-5 Aktin-Stressfasern ansammeln (Abbildung 1E-F). Wir untersuchten auch den Prozentsatz lebensfähiger Zellen in der primären 2D-Kultur von Tag 1 bis Tag 5 und verglichen ihn mit der Lebensfähigkeit vor der Beschichtung an Tag 0 (Abbildung 2). Es ist möglich, bereits in den ersten Tagen der Kultur eine drastische Verringerung der Lebensfähigkeit zu beobachten, die an Tag 1 49,5 % (SD 12,7) erreicht, an Tag 2 auf 45,2 % (SD 18,2) und an Tag 3 auf 33,5 % (SD 0,77) sinkt. Der Anteil lebensfähiger Zellen liegt an Tag 4 bereits bei 16,9 % (SD 5,4), während er an Tag 5 9,1 % (SD 0,38) erreicht. Daher ist es offensichtlich, dass der Verlust der Morphologie mit einem schnell fortschreitenden Zelltod von adulten Hepatozyten in 2D-Kultur einhergeht.
Isolierte Hepatozyten zeigten vor der Plattierung (Tag 0) eine hohe mRNA-Expression von hepatischen Markergenen (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2), die mittels RT-qPCR ausgewertet wurden (Abbildung 3). Alle analysierten Gene zeigen eine kulturzeitabhängige Abnahme der Expression bereits am Tag 1 in der Kultur. Die mRNA-Expressionsniveaus verdeutlichen den Funktions- und Lebensfähigkeitsverlust der primären Hepatozyten im Laufe der Zeit.
Isolierte Hepatozyten wurden in 3D-Matrixtröpfchen plattiert und 3D-Organoid-Zellstrukturen im Laufe der Zeit verfolgt. An Tag 1 der Kultur werden einzelne Hepatozyten in den Matrixtröpfchen suspendiert (Abbildung 4A). Die Zellkonzentration wird absichtlich niedrig gehalten, um den Hepatozyten ausreichend Platz zum Wachsen zu geben. Dies ermöglicht es uns auch, das Wachstum der Organoide visuell zu verfolgen. Primäre Hepatozyten zeigten in den ersten Tagen der Kultur eine zelluläre Teilung (Abbildung 4C). Während an Tag 0 Hep-Orgs mit einer Größe von 30 μm gemessen wurden, verdoppelten sich die Hep-Orgs an Tag 2 fast mit ihren Abmessungen, was das Größenwachstum unterstreicht, das bis Tag 15 anhielt (33,08 μm an Tag 1; 64,86 μm an Tag 2; 45,06 μm an Tag 5; 55,19 μm an Tag 7; 51,93 μm an Tag 10; 62,90 μm an Fay 15). Was die Form der Hep-Orgs betrifft, so erreichten sie, während sie an Tag 1 noch rundförmig waren, an den folgenden Tagen die "Traubenform" (typisch für Leberorganoide).
Hepatozyten, die in einer 3D-Matrix plattiert sind, bleiben in Kultur wochenlang am Leben und zeigen eine Lebensfähigkeit von 23 % ±10 % nach 15 Tagen unter Verwendung des Trypanblau-Assays (Abbildung 4B, erste Reihe). Um die Proliferation von Ratten-Hep-Orgs zu validieren, wurde an Tag 15 ein EdU-Test durchgeführt (Abbildung 4D). Nichtsdestotrotz zeigte die Hoechst-Färbung eine hohe Anzahl von Einzelzellen anstelle von Hep-Orgs, eine proliferative Aktivität von Hepatozyten (grünen Zellen) war vorhanden, auch wenn der EdU-Inkorporation gering war (9% ± 7%) (Abbildung 4B, zweite Reihe).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig01.jpg"> Abbildung 1: 2D-Kultur der primären Hepatozyten auf kollagenbeschichteten Platten im Laufe der Zeit. Die Bilder wurden bei 20-facher Vergrößerung mit (A) Phasenkontrastmikroskopie 4 Stunden nach der Beschichtung, (B) Tag 1, (C) Tag 2, (D) Tag 3, (E) Tag 4, (F) Tag 5 aufgenommen. In jedem Bild wird ein Maßstabsbalken von 50 μm angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig02.jpg"> Abbildung 2: Lebensfähige Primärzellen in 2D-Kultur auf kollagenbeschichteten Platten. Die Grafik zeigt den Prozentsatz lebensfähiger Zellen von Tag 1 bis Tag 5 im Vergleich zu lebensfähigen Zellen, die an Tag 0 plattiert wurden und als 100 % angesehen werden. Die Ergebnisse werden als Einzelreplikate, Durchschnitt und SD von 3 verschiedenen Experimenten angegeben (* p-Wert ≤ 0,05; ** p-Wert ≤ 0,005). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig03.jpg"> Abbildung 3: mRNA-Expression von hepatischen Markern, gemessen mittels RT-qPCR in primären Hepatozyten. Die Ergebnisse wurden auf β-Aktin und/oder GAPDH (Housekeeping-Gene) normalisiert und werden im Verhältnis zu primären Hepatozyten exprimiert, die vor der Plattierung an Tag 0 gesammelt wurden, was als 1 betrachtet wird. Die Ergebnisse werden als Durchschnitt ± SD von mindestens 3 verschiedenen Experimenten angegeben (**+ p-Wert ≤ 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig04.jpg"> Abbildung 4: 3D-Hepatozytenkultur in Matrixtröpfchen im Laufe der Zeit. (A) Isolierte Hepatozyten, die in Matrixtröpfchen für Langzeit-Hep-Orgs plattiert sind: Im Bild sind die Matrixtröpfchen auf der Oberfläche der Vertiefung sichtbar (roter Kreis = ein Tröpfchen). (B) Prozentsatz lebensfähiger Zellen durch Trypanblau und proliferativer Zellen durch EdU am Tag 15 vor der Passage. Die Quantifizierung der EdU-positiven Zellen wurde mit der ImageJ2-Software durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Prozent als Durchschnitt±SD von mindestens 3 verschiedenen Experimenten angegeben. (C) Phasenkontrastbilder der 3D-Kultur von Ratten-Hep-Orgs an verschiedenen Tagen des Wachstums in der 3D-Kultur: Tag 1, 2, 5, 7, 10, 15. Bildvergrößerung 20X. In jedem Bild wird ein Maßstabsbalken von 50 μm angegeben. (D) EdU-Inkorporationsassay von Hep-Orgs der Ratte an Tag 15. Bildvergrößerung 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Puffer und Medienzusammensetzung. Die Tabelle enthält den Namen und die Komponenten (mit ihrer endgültigen Konzentration) aller Puffer und der Zellmedien, die im Protokoll verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08_Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Liste der Rattenprimer. Die Tabelle enthält eine Liste der Primer, die für RT-qPCR-Experimente verwendet wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08%20Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

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Forschung

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Biology

Biologie

Eine neuartige Methode, um Makrophagen aus primären Kultur von Leberzellen zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode nutzt die Proliferation von Makrophagen in der Kultur, durch Schütteln der Kulturflaschen und Reinigung durch selektive Bindung an Plastikschalen gefolgt. Diese Technik bietet effiziente Leber Makrophagen ohne komplexe Anlagen und Fähigkeiten.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

Primäre Hepatozyten ein wertvolles Instrument, um biochemische, molekulare und metabolische Funktionen in einem physiologisch relevanten experimentellen Systems zu evaluieren. Wir beschreiben ein zuverlässiges Protokoll für Ratte in situ Leberperfusion, die konsequent erzeugt lebensfähigen Hepatozyten bis bis 1,0 ×...

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Eine modifizierte Zwei-Schritt-Kollagenase-Perfusion Verfahren zur Isolierung von humanen Hepatozyten beschrieben. Dieses Verfahren kann auch auf andere Säugetierlebern, angewendet werden. Die isolierten Hepatozyten sind in hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit, so dass sie ein geeignetes Modell für die wissenschaftliche Forschung in Bereichen wie der Leberregeneration, Pharmakokinetik und Toxikologie.

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, hohe Wirtschaftlichkeit und hohe Ausbeute von Hepatozyten und sinusförmigen endothelial Zellen von Leber zu erhalten. Dies geschieht durch die Vorrichtung der Leber mit einer Typ IV Kollagenase Lösung über die Pfortader, gefolgt von differentielle Zentrifugation, Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen zu erhalten.

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von Maushepatozyten aus erwachsenen Mauslebern mit einer modifizierten Kollagenase-Perfusionstechnik vorgestellt. Ebenfalls beschrieben ist die Langzeitkultur von Hepatozyten in einer 3D-Kollagen-Sandwich-Einstellung sowie die Immunkennzeichnung der zytoskelettalen Komponenten zur Untersuchung der Gallenkanalbildung und deren Reaktion auf die Behandlung.

Isolation und 3D Kollagen Sandwich Kultur der primären Maus Hepatozyten, um die Rolle des Zytoskeletts in Bile Canalicular Formation In Vitro zu studieren

Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziellen intravenösen Katalysators, eines standardisierten sterilen Einwegschlauchs, einer Temperaturregelung, die durch Echtzeitüberwachung ergänzt wird, und eines Alarmsystems für ein zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren, um die Konsistenz der Lebensfähigkeit, Ausbeute und Funktionalität isolierter primärer Rattenhepatozyten zu verbessern.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Methode für die in situ Perfusion der Mausleber vor, um die akute und direkte Regulation des Leberstoffwechsels zu untersuchen, ohne die Leberarchitektur zu stören, aber in Abwesenheit von extrahepatischen Faktoren.

Glukoseproduktion, Harnstoffgenese und Lipolyse in der Leber quantifiziert mit dem perfundierten Mauslebermodell

Erfahren Sie die optimierte Kollagenase-Leberperfusion zur Isolierung primärer Hepatozyten aus Ratten. Diese Methode ermöglicht die Kultur funktionaler 3D-Organoide für Langzeitstudien der Leberbiologie.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist (Video) | JoVE Journal

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

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