Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen
11. Oktober 2024
Wir haben einen Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay etabliert, um die Kontakte zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen zu überwachen. Mit diesem Assay beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Messung des Ausmaßes dieser Interorganellenkopplungen in HEK293T Zellen unter den Bedingungen einer chemischen Behandlung.
In meinem Labor untersuchen wir die interorganale Kommunikation, die eine Form des Membrankontakts annimmt, und ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellgesundheit sowie bei der Pathogenese von Krankheiten. Wir interessieren uns besonders für die Membrankontakte zwischen Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum und versuchen zu verstehen, wie sie reguliert werden und wie ihre Fehlregulation zu Neurodegeneration führen kann. Obwohl wir wissen, dass ER-Mitochondrienkontakte wichtig für die Zellgesundheit sind und ihre Fehlregulation mit vielen Krankheiten in Verbindung gebracht wird, wissen wir nicht viel darüber, wie ihr Spiegel reguliert wird.
Der erste Schritt, um dieses Problem anzugehen, besteht darin, ein einfaches, zuverlässiges Protokoll zur Messung des Niveaus der ER-Mitochondrienkontakte in Zellen zu etablieren. Unser Split-Luciferase-Assay bietet im Vergleich zu den meisten Assays eine einfachere und schnellere Möglichkeit, ER-Mitochondrienkontakte in lebenden Zellen zu quantifizieren. Wir nutzen zwei geteilte Hälften von Renilla-Luciferase, eine Hälfte für ER und die andere für Mitochondrien.
Sie können nur dort wieder zusammengesetzt werden, wo die ER- und die Mitochondrienmembran engen Kontakt haben, was zu einer rekonstituierten Luciferase mit voller Enzymaktivität führt. Diese Methode ist einfach, eignet sich für Screenings mit hohem Durchsatz und ist für viele Labore leicht zugänglich. Wir hoffen, dass es das Feld der neurodegenerativen Erkrankungen voranbringen wird, indem molekulare und genetische Modulatoren von ER-Mitochondrienkontakten identifiziert werden, die zu therapeutischen Wirkstoffen weiterentwickelt werden können.
Unsere Ergebnisse haben den Weg für wichtige Fragen geebnet, wie z.B. wie sich verschiedene Medikamente oder Medikamentenkombinationen auf ER-Mitochondrien-Kontakte auswirken und welche molekularen Akteure hinter diesen Kontakten stehen. Aus diesen Fragen können wir ein besseres Verständnis des Mechanismus der ER-Mitochondrien-Kontakte gewinnen und Wege finden, verwandte Krankheiten zu bekämpfen.
Übersicht
Diese Studie etabliert einen Split-Luciferase-Reassembly-Assay zur Überwachung von Endoplasmatischem-Retikulum-Mitochondrien-Kontakten in lebenden Zellen. Das Protokoll misst quantitativ diese Inter-Organellen-Kopplungen in HEK293T-Zellen unter chemischer Behandlung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Interorganellen-Kommunikation
Hintergrund
- Interorganellen-Kommunikation ist lebenswichtig für die zelluläre Gesundheit.
- Membrankontakte zwischen Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum sind entscheidend.
- Dysregulation dieser Kontakte ist mit Neurodegeneration verbunden.
- Aktuelle Methoden zur Messung dieser Kontakte sind komplex und zeitaufwendig.
Zweck der Studie
- Ein zuverlässiges Protokoll zur Messung von ER-Mitochondrien-Kontakten zu etablieren.
- Die Quantifizierung dieser Kontakte in lebenden Zellen zu vereinfachen.
- Das Verständnis darüber zu verbessern, wie diese Kontakte reguliert werden.
Verwendete Methoden
- Split-Luciferase-Reassembly-Assay.
- Zielen einer Hälfte der Renilla-Luciferase auf das ER und der anderen auf Mitochondrien.
- Quantitative Messung von Inter-Organellen-Kopplungen.
- Verwendung von HEK293T-Zellen unter chemischen Behandlungsbedingungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Etablierung eines Split-Luciferase-Assays.
- Quantitative Daten zu ER-Mitochondrien-Kontakten erhalten.
- Effizienz des Assays im Vergleich zu traditionellen Methoden demonstriert.
- Einblicke in die Regulation der Inter-Organellen-Kommunikation.
Schlussfolgerungen
- Der Split-Luciferase-Assay ist ein zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung von ER-Mitochondrien-Kontakten.
- Diese Methode kann weitere Forschungen zur zellulären Gesundheit und Krankheit erleichtern.
- Das Verständnis dieser Kontakte kann zu Erkenntnissen über neurodegenerative Erkrankungen führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of endoplasmic reticulum-mitochondria contacts is critical for de-risking neurodegenerative disease targets and clarifying cellular mechanisms underlying pathogenesis. The split-luciferase reassembly assay enables high-throughput, live-cell assessment of these contacts, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. This capability strengthens portfolio decisions by enabling systematic evaluation of modulators affecting inter-organelle communication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of ER-mitochondria contact dynamics in live cells.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying contact modulation in response to candidate compounds.
- Facilitates identification of molecular players regulating inter-organelle coupling relevant to neurodegeneration.
- Provides a quantitative readout for functional target validation and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers a scalable, high-throughput assay format for screening chemical or genetic modulators of ER-mitochondria contacts.
- Standardizes measurement of contact-dependent luciferase activity for reproducible assay outputs.
- Enables robust comparison of compound effects across multiple conditions and time points.
- Prepares validated biological systems for downstream mechanistic or phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling contact dysregulation implicated in neurodegenerative disorders.
- Supports translational biomarker development by linking contact modulation to cellular health outcomes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of therapeutic hypotheses targeting inter-organelle communication.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early hypothesis testing, lead identification, and mechanistic validation of ER-mitochondria contact modulators.
- Discovery Biology: Quantifies contact-dependent luciferase reassembly to clarify pathway regulation and biological risk.
- Screening: Offers high-throughput, reproducible outputs for compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative luminescence measurements for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects contact modulation to disease-relevant phenotypes in neurodegeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing target validation and mechanistic studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines assay standardization, reproducibility, and scalability for cross-team adoption.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by enabling robust, quantitative readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and therapeutic strategies addressing inter-organelle dysfunction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell transfection and luminescence assay setup.
- Needs access to luminescence plate readers and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data analysis protocols.
- Adaptable to various cell models but may require optimization for different systems.
- Dependent on validated reagents and controls to ensure assay specificity and reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:55
Maintaining and Seeding HEK293T Cells for Split‐Rluc Plasmid Transfection
3:38
Polyethyleneimine (PEI)‐Mediated HEK293T Cell Transfection and Post‐Transfection Cell Seeding
5:55
Chemical Treatment and Luciferase Assay to Measure the Level of ER‐Mitochondria Contacts in Live Cells
