Name: Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Erfahren Sie den Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur quantitativen Messung von ER-Mitochondrien-Kontakten in lebenden HEK293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung interorganellärer Kommunikation.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ein einfacher Assay zur Messung von ER-Mitochondrien-Kontakten für Hochdurchsatz-Screenings

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
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<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
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<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
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<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
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<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,7 mL SafeSeal Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sorenson</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte TC Treated</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipettenspitzen OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L Pipettenspitzen OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu; L Abgeschrägte Spitzen OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisches Röhrchen aus Polypropylen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Flipper-Mikroröhrchen-Racks</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte TC behandelt&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm TC-behandelte Schale</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 &mu; L Spitzen OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5910&nbsp; Ri - Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid, wasserfrei, &ge; 99,9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>In DMSO auflösen; lagern bei -70 &Grad; C</td></tr><tr><td>EnduRen Lebendzellsubstrat</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>Aliquots bei -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Eppendorf 2-20 &mu; L-Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 100-1000 &mu; L Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 &micro; L-Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 12-Kanal</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu; L Pipette</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>3123000055</tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp; Inkubator, 184 L, Edelstahl poliert</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>Handstrichzähler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer - Neubauer Bright Line, Doppelzählkammer</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen TE Puffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Zentrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Röhrchen-Rack für 50 ml konische, 15 ml konische und Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Transfektionsqualität Lineares Polyethyleniminhydrochlorid (MW 40.000)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP USA</td><td>Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhosinhydrochlorid</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>5003</td><td>In DMSO auflösen; lagern bei -70 & Grad; C</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX Multimode-Mikroplatten-Reader</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2215365</td><td>Level 8</td></tr><tr><td>VWR Vakuum-Aspirationssystem</td><td>VWR</td><td>75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>In DMSO auflösen; bei -70 Grad lagern; C</td></tr></tbody></table>

split-luciferase-reassemblierungs-assay zur messung von kontakten zwischen endoplasmatischem retikulum und mitochondrien in lebenden zellen

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

Wir haben das oben beschriebene Protokoll verwendet, um das Niveau der ER-Mitochondrien-Kontakte nach Zugabe von drei Verbindungen zu messen, von denen bekannt ist, dass sie spezifische GTPasen hemmen. CDC42, RHO und RAC sind GTPasen, die bei Aktivierung die Aktinpolymerisation28 fördern und durch ZCL278, Rhosin bzw. Ehop-016 gehemmt werden24. HEK293T Zellen, die mit split-Rluc transfiziert wurden, wurden mit DMSO (Kontrolle), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) oder Ehop-016 (25 μM) behandelt und für 1 h, 2 h und 5 h inkubiert. Mit einem Plattenleser haben wir die Split-Rluc-Aktivität zu definierten Zeitpunkten gemessen (Abbildung 2).
Mit Rhosin (RHO GTPase-Inhibitor) behandelte Zellen zeigten nach 1 h, 2 h und 5 h der Behandlung keine signifikanten Veränderungen der Luciferase-Aktivität im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Kontrollzellen (p &gt; 0,9999, p = 0,6956, p &gt; 0,9999) (Abbildung 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass Rhosin die Kontakte zwischen ER und Mitochondrien nicht beeinflusst, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der RFO-GTPase nicht an der Regulierung der Kontakte zwischen den beiden Organellen beteiligt ist.
Im Gegensatz dazu zeigte der RAC-GTPase-Inhibitor Ehop-016 nach 1 h, 2 h und 5 h der Behandlung eine signifikant geringere Luciferase-Aktivität als DMSO (p = 0,0106, p = 0,0009, p = 0,0024) (Abbildung 2). Diese Daten deuten darauf hin, dass die RAC-GTPase-Aktivität für die Aufrechterhaltung einer normalen ER-Mitochondrien-Interaktion in der Zelle erforderlich ist.
Schließlich zeigte der CDC42-Inhibitor ZCL278 die drastischsten Veränderungen der Luciferase-Aktivität (Abbildung 2). ZCL278-behandelte Zellen zeigten eine signifikante Abnahme der Luziferase-Aktivität im Vergleich zum Kontroll-DMSO und wiesen über alle drei Zeitpunkte hinweg die niedrigsten p-Werte auf, wobei sie durchgehend einen p-&lt; 0,0001 beibehielten. Unsere Daten zeigen eine starke Hemmung der ER-Mitochondrien-Kopplung, wenn die CDC42-GTPase-Aktivität durch ZCL278 blockiert wird, was mit unserem vorherigen Bericht übereinstimmt, in dem der ursprüngliche split-R luc-Assayverwendet wurde, der in Zellen durchgeführt wurde, die mit zwei Vektoren co-transfiziert wurden, die jede Hälfte der Split-Luciferase separat kodieren24.
Angesichts der bemerkenswerten Ergebnisse mit ZCL278, insbesondere im Vergleich zu den anderen GTPase-Inhibitoren, wurde die Aktivität von ZCL278 in verschiedenen Konzentrationen [0,5 μM, 5 μM, 50 μM] gegen eine DMSO-Kontrolle weiter getestet. Die Luziferase-Aktivitäten, die 1 h, 2 h und 5 h nach der Behandlung gemessen wurden, zeigten eine dosisabhängige Reaktion; 0,5 μM ZCL278 zeigten die schwächste Wirkung auf die Luciferase-Aktivität, während 5 μM eine stärkere und 50 μM die stärkste Verringerung der rekonstituierten Enzymaktivität zeigten (Abbildung 3). Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass ZCL278 die Split-R-luc-Aktivitätdosisabhängig herunterreguliert und im Laufe der Zeit höhere Konzentrationen von ZCL278 (CDC42-Inhibitor) im Vergleich zu niedrigeren Konzentrationen immer noch eine signifikante Veränderung im Vergleich zum Kontroll-DMSO zeigen.
Um unseren split-R luc-Assayzu validieren, können etablierte unabhängige Assays wie der Proximity-Ligation-Assay (PLA), die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und die Überwachung der mitochondrialen Kalziumaufnahme durchgeführt werden (Abbildung 4 und Daten nicht gezeigt)24. Isoproterenol, ein β2-adrenerger Rezeptoragonist, der eine der Verbindungen ist, die in unserem Screening für ER-Mitochondrien-Kontaktpromotoren (Abbildung 4A) identifiziert wurden, wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Luciferase-Aktivität des Split-Rluc nach der Behandlung mit Isoproterenol aufgrund erhöhter ER-Mitochondrien-Kontakte erhöht war, was sich in Veränderungen der PLA-Signalintensität sowie der mitochondrialen Kalziumaufnahme zeigte (Abbildung 4B-E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg"> Abbildung 1: Der Split-RLuc-Reassemblierungs-Assay. (A) Schematische Darstellung des Split-R Luc-Assays. Wo es keine Membrankontakte zwischen den Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum gibt, interagieren das Mito-RlucN und das RlucC-ER nicht und es gibt keine Rluc8-Aktivität. Die Wechselwirkung zwischen dem Mito-R lucN und dem RlucC-ER, bei der das ER und die Mitochondrienmembranen in Kontakt kommen, führt jedoch zu einer vollen enzymatischen Aktivität, die durch die Umwandlung des Substrats in Lumineszenz nachgewiesen wird. (B) Schematische Karte des gespaltenen Rluc DNA-Konstrukts (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) Diagramm des Arbeitsablaufs für den Split-Rluc-Assay in HEK293T Zellen. Abkürzungen: Mito = Mitochondrien; ER = endoplasmatisches Retikulum; IRES, interne ribosomale Eintrittsstelle; rb_glob pA, Beta-Globin-Polyadenylierungssignal des Kaninchens; T2A, eine selbstspaltende Peptid-2A-Sequenz aus dem Thosea asigna-Virus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg"> Abbildung 2: Die Split-R-luc-Aktivitätenentsprechen den ER-Mito-Kontakten in den mit GTPase-Inhibitoren behandelten Zellen. (A-C) Rekonstituierte Luciferase-Aktivitäten bei (A) 1 h, (B) 2 h oder (C) 5 h nach Behandlung mit DMSO (Kontrolle), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM] oder ZCL278 [50 μM] (n = 12 für jede Gruppe). Alle Daten wurden mittels unidirektionaler ANOVA mit mehreren Vergleichen analysiert. p-Werte werden als p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****) angegeben. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± Standardmessfehler an. Abkürzungen: Mito = Mitochondrien; ER = endoplasmatisches Retikulum; RLU = relative Lichteinheit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg"> Abbildung 3: Die split-Rluc-Aktivitäten zur Messung des Niveaus der ER-Mito-Kontakte in den mit ZCL278 behandelten Zellen. (A-C) Rekonstituierte Luciferase-Aktivitäten bei (A) 1 h, (B) 2 h oder (C) 5 h nach DMSO (Kontrolle) oder ZCL278 bei [0,5 μM], [5 μM] oder [50 μM] Konzentration (n = 12 für jede Gruppe). Alle Daten wurden mittels unidirektionaler ANOVA mit mehreren Vergleichen analysiert. p-Werte werden als p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****) angegeben. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± Standardmessfehler an. Abkürzungen: Mito = Mitochondrien; ER = endoplasmatisches Retikulum; RLU = relative Lichteinheit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg"> Abbildung 4: Validierung des split-Rluc Assays. (A) Ein Beispiel für die Quantifizierung der Split-R-luc-Aktivitätnach Behandlung HEK293T Zellen mit 11 Arzneimitteln, einschließlich Isoproterenol, das in einem Wirkstoff-Screening auf ER-Mitochondrien-Kontaktpromotoren identifiziert wurde. (B) Ein Beispiel für einen Proximity-Ligationsassay in HeLa-Zellen, die mit DMSO oder Isoproterenol (1 μM) behandelt wurden. Das PLA-Signal (rot) zeigt einen engen Kontakt zwischen ER und Mito an. Sec61-GFP (grün): zur Kennzeichnung von ER; DAPI (blau): Zellkern. (C) Quantifizierung des PLA-Signals in A (n = 4 Experimente mit je 77-97 Zellen; Mann-Whitney-Test). (D) Mitochondriale Kalziumaufnahme als Reaktion auf Histamin (100 μM). Änderung der Fluoreszenzintensität von Mito-R-GECO1 (der Durchschnitt wurde über mehrere HeLa-Zellen gemessen), aufgetragen alle 2,5 s in DMSO- oder Isoproterenol-behandelten Zellen. Der Pfeil zeigt die Histaminzugabe an. (E) Links: Maximaler Peak der mitochondrialen Kalziumaufnahme in A. Unpaariger zweiseitiger t-Test (n = 10, DMOS; 14, Isoproterenol). Rechts: Mitochondriale Kalziumaufnahmerate (wie in A; 7,5 bis 12,5 s). Mann-Whitney-Test (n = 12, DMSO; 11, Isoproterenol). Diese Abbildung wurde von Lim et al.24 modifiziert. Abkürzungen: RLU = relative Lichteinheit; PLA = Proximity-Ligations-Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Zusammenfassung der aktuellen Techniken für ER-Mitochondrien-Kontakte. Liste der Vorteile und Einschränkungen für jede Methode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Zip-Datei mit DNA-Sequenz (PDF- und GBK-Format) von pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Karte von pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschreiben wir Verfahren für die Untersuchung von Veränderungen in Phagozytose-induzierte Genexpression mit einem Luciferase-basierten Reportergen-Ansatz mit dem Dual-GloTM Luciferase Assay System von Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Dieses Video zeigt den Split-Luciferase-Komplementationsassay zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Assay werden die Proteine von Interesse an kleine und große Fragmente des Luciferase-Enzyms getaggt. Wenn die Proteine interagieren, verbinden sich die großen und kleinen Fragmente zu einem aktiven Enzymkomplex, der in Gegenwart eines bestimmten Substrats eine helle Lumineszenz freisetzt, die gemessen werden kann.

Split-Luciferase-Komplementationsassay zur Identifizierung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

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Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind von grundlegender Bedeutung für alle zellulären Prozesse. Verwendung Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer, kann die Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen in lebenden Zellen und in Echtzeit überwacht werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen von potentiell pathogenen Mutationen zu beurteilen.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Das hier vorgestellte Protokoll soll das Auftreten heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen mit zytoplasmatisch exponierten N- und/oder C-Termini in lebenden Säugetierzellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays demonstrieren.

Nachweis heterologer Komplexe, die von Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen gebildet werden, mittels Split-Luciferase-Komplementierungsassay

Der Bedarf an neuen Ansätzen zur Untersuchung von Membrankontaktstellen (MCS) ist aufgrund des zunehmenden Interesses an der Untersuchung dieser zellulären Strukturen und ihrer Komponenten gestiegen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das bisher verfügbare Mikroskopietechnologien integriert, um intra- und interorganelle Proteinkomplexe, die sich an MCS befinden, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endogener intraorganeller Proteininteraktionen an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen durch Proximity-Ligation-Assays

Dieses Protokoll beschreibt einen BRET-basierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen der CRAF-Kinase mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Zellen, zum Ablesen der BRET-Emissionen und zur Datenanalyse. Ein Beispielergebnis mit der Identifizierung geeigneter Kontrollen und der Fehlerbehebung für die Assay-Optimierung wird ebenfalls vorgestellt.

Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-basierter Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen

Erfahren Sie den Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur quantitativen Messung von ER-Mitochondrien-Kontakten in lebenden HEK293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung interorganellärer Kommunikation.

Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal

Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen

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