Name: Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Lernen Sie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung von gastrulierenden Mausembryonen zur Analyse früher Zellfate-Entscheidungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Embryonen mit Linienmutationen.

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Wir danken dem Genomics Core am Fox Chase Cancer Center und den Labormitgliedern von Dr. Johnathan Whetstine, Zach Gray, Madison Honer und Benjamin Ferman, für die technische Unterstützung der Sequenzierungsexperimente. Wir danken den Labormitgliedern von Dr. Estaras und Alex Morris, einem Rotationsdoktoranden, der zur ersten Analyse der Einzelzellstudien beigetragen hat. Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse R01HD106969 und R56HL163146 an Conchi Estaras finanziert. Darüber hinaus wurde Elizabeth Abraham durch das T32-Ausbildungsstipendium 5T32HL091804-12 unterstützt.

Isolierung und Genotypisierung von gastrulierenden Mausembryonen für die Einzelzellsequenzierung

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024).</li>
<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In dieser Arbeit wird eine robuste Pipeline zur Gewinnung hochwertiger Einzelzell- und Zellkernsuspensionen aus gastrulierenden Mausembryonen vorgestellt, die speziell entwickelt wurde, um Studien zu den Mechanismen der Zellschicksalsspezifikation in der frühen Entwicklung zu erleichtern. Diese Methode schließt eine entscheidende Lücke im Bereich der Gastrulation, indem sie die Analyse von Embryonen optimiert, die Genotypen wie Geschlecht oder somatische Gene erfordern. Durch die Verwendung genetischer Mutations-Mausmodelle und den Einsatz hochauflösender Einzelzellsequenzierung an ganzen Mausembryonen kann diese Pipeline das Verständnis der Genexpressionsprofile der frühen Mausgastrula weiter verbessern. Diese Methode demonstriert die Machbarkeit der Verwendung eines Mausmodells mit genetischer Mutation durch ein Cre-Rekombinase-System, um hochwertige Zellen und Zellkerne zu frühen Entwicklungszeitpunkten für die Einzelzell-Omics zu erhalten. Diese Methode entwickelte sich durch mehrere Versuche, bei denen die Proben nicht den Qualitätsstandards entsprachen, die für die Vorbereitung und Sequenzierung von Bibliotheken erforderlich sind. Die erläuterte Methodik erzeugt ausreichend Zellen/Zellkerne aus Embryonen, die jünger als E8 sind, durch die Optimierung von drei kritischen Schritten: (1) synchronisierte zeitgesteuerte Schwangerschaften, um die Anzahl der Embryonen zu erhöhen, (2) Genotypisierung am selben Tag, um ein Einfrieren/Auftauen zu vermeiden, und (3) Beurteilung der Lebensfähigkeit von Zellen/Zellkernen, um eine Sequenzierung sterbender Zellen zu vermeiden. Dieses Protokoll liefert erfolgreiche Ergebnisse mit Einzelzell-RNASeq, aber die in diesem Protokoll erhaltenen Zell- oder Zellkernsuspensionen können in anderen Sequenzierungsplattformen verarbeitet werden, bei denen die Zellviabilität der limitierende Faktor ist, wie z. B. Smart-Seq, Drop-Seq und Cel-Seq16.
Beim E7-Embryo kann die Anzahl der Zellen je nach Stamm und mutiertem Genotyp variieren. In der Regel kann ein E7-Embryo zwischen Hunderten und einigen tausend Zellen liegen, und die Gewinnung von Embryonen mit dem gewünschten Genotyp ist eine Herausforderung, da nur 1 oder 2 Embryonen pro trächtiger Hündin die Kriterien erfüllen. Dieses Protokoll ermöglicht die Entnahme von etwa 300 lebensfähigen Zellen pro E7-Embryo für die Einzelzellanalyse. Versuche, die Größe des Embryopools durch Einfrieren von Embryonen von trächtigen Muttertieren an verschiedenen Tagen zu erhöhen, erwiesen sich als erfolglos, da die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Auftauen stark beeinträchtigt war, selbst bei Zugabe von Kryokonservierungsmitteln. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurde die Zuchtstrategie und die Synchronisation der trächtigen Hündinnen optimiert. Um die Chancen auf Mehrfachisolierungen zu erhöhen, wird empfohlen, weibliche Mäuse, die 1-2 Mal geboren haben, vor der Zucht für die Isolierung zu verwenden, da sie mit größerer Wahrscheinlichkeit größere Würfe haben. Die Überwachung des Östruszyklus der Frau ist von entscheidender Bedeutung. Die Paarung findet eher während der Prostrus- und Brunstphase statt. Kommt es zu Brutschwierigkeiten, hilft auch ein Wechsel der Zuchtpartner nach vier Tagen, wenn kein Plug produziert wird.
Es ist wichtig zu beachten, dass diese Methode eine Einschränkung hat: Sie stützt sich auf beobachtete Plugs, und selbst wenn ein Plug beobachtet wird, garantiert sie keine Schwangerschaft, sondern zeigt nur sexuelle Aktivität an. Daher erhöht eine Erhöhung der Anzahl der beobachteten Pfropfen an einem Tag die Wahrscheinlichkeit, mehr als eine trächtige Hündin an einem Tag und mehr positive Genotypen zu haben. Dieses Protokoll demonstrierte die Machbarkeit der Verwendung von embryonalen Stadien im Bereich von E7 bis E7.75 als Wirksamkeitsnachweis während der Gastrulation. Diese Pipeline kann jedoch von E6,5- bis E8-Embryonen angewendet werden. Für E6.5-Embryonen wird empfohlen, die Anzahl der synchronisierten Schwangerschaften zu erhöhen, um mindestens 7 Embryonen mit dem gewünschten Genotyp zu erhalten. Erhöhen Sie stattdessen für die E8-Embryonen die Menge an Trypsin, die zur Dissoziation jedes Embryos verwendet wird, auf ~ 40 μl anstelle von 20 μl. Ziel ist es, eine Zell-/Zellkernsuspension in einem Konzentrationsbereich von 700-1200 Zellen pro μl zu erhalten, bevor mit der Partitionierung fortgefahren wird.
Eine gute Zellviabilität ist essentiell für den Erfolg der Einzelzellsequenzierung. In dem von den Herstellern bereitgestellten mikrofluidischen Chipdesign werden einzelne Zellen innerhalb eines Chips, der bekannte barcodierte Gelkügelchen11 enthält, in Gelkügelchen (GEMs) unterteilt. Eine bemerkenswerte Einschränkung dieses Prozesses besteht jedoch darin, dass sowohl hochwertige als auch minderwertige Einzelzellen partitioniert werden können. Selbst bei einer ausreichenden Anzahl lebender Zellen (d. h. 1000 Zellen/μl) wird das Sequenzierungsexperiment wahrscheinlich fehlschlagen, wenn die Lebensfähigkeit der Suspension gering ist (d. h. 1000 lebende Zellen und 1000 tote Zellen, was zu einer Lebensfähigkeit von 50 % führt). Für optimale Ergebnisse wird empfohlen, eine Rentabilität von etwa 90 % anzustreben. Liegt die Zellviabilität zwischen etwa 60 % und 89 %, können spezifische Maßnahmen ergriffen werden, um die Lebensfähigkeit des Experiments zu verbessern. Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen jedoch weniger als 60 % beträgt, wird dringend davon abgeraten, das Experiment fortzusetzen. Der Grund dafür ist, dass die sterbenden Zellen im Partitionierungsgel "eingefangen" werden und die nachfolgenden Bibliotheksvorbereitungen und Qualitätskontrollen ohne nennenswerte Probleme verlaufen. Das eigentliche Sequenzierungsexperiment kann jedoch vollständig fehlschlagen, da die meisten Sequenzierungs-Reads mitochondriale, ribosomale oder Apoptose-Gene abbilden, was von Anfang an auf Anzeichen einer schlechten Zelllebensfähigkeit hinweist. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen eine Pipeline für die Einzelzellsequenzierung von gastrulierenden Mausembryonen mit hochwertigen Zellen. Diese Methodik kann für das Verständnis vieler verschiedener genetischer Mutations-Mausmodelle während der Entwicklung angewendet werden.

Die Gastrulation ist ein grundlegender Prozess, der für die normale Entwicklung erforderlich ist. Dieser schnelle und dynamische Prozess tritt auf, wenn pluripotente Zellen in linienspezifische Vorläufer übergehen, die die Organbildung definieren. Jahrelang wurde Gastrulation lange Zeit als die Bildung von drei weitgehend homogenen Populationen definiert: Mesoderm, Ektoderm und Endoderm. Hochauflösende Technologien und eine neue Anzahl embryonaler Stammzellmodelle 1,2 offenbaren jedoch eine noch nie dagewesene Heterogenität unter den frühen Keimblättern 3,4. Dies deutet darauf hin, dass über die Mechanismen, die die unterschiedlichen Zellpopulationen der Gastrula regulieren, noch viel mehr geklärt werden muss. Die Embryonalentwicklung von Mäusen war eines der besten Modelle, um frühe Entscheidungen über das Schicksal von Zellen während der Gastrulationzu untersuchen 3,5. Die Gastrulation bei Mäusen ist schnell, da der gesamte Prozess der Gastrulation innerhalb von 48 Stunden vom Embryonaltag E6.5 bis E85 stattfindet.
Jüngste Fortschritte in der Einzelzelltechnologie haben eine detaillierte Kartierung der Embryonalentwicklung von Wildtyp-Mäusen ermöglicht und einen umfassenden Überblick über die zellulären und molekularen Landschaften von Embryonen während der Gastrulation gegeben 3,4,6,7,8. Die Analyse mutierter Embryonen in diesen Stadien ist jedoch weniger verbreitet und oft auf FACS-sortierte Populationen beschränkt 9,10. Die spärliche Literatur spiegelt die technischen Herausforderungen wider, die mit der Manipulation und Einzelzellpräparation von gastrulierenden Embryonen verbunden sind, die eine Genotypisierung erfordern. Die Erfassung des dynamischen Prozesses der Gastrulation kann aufgrund seiner Schnelligkeit eine Herausforderung darstellen, insbesondere für das Verständnis mutierter Embryonen. Der Zeitpunkt und die Synchronisation von Schwangerschaften sind von entscheidender Bedeutung, da bereits geringe Unterschiede zwischen zeitlich begrenzten Schwangerschaften als Entwicklungsphänotyp fehlinterpretiert werden können, der aus dem mutierten Gen resultiert. Dies ist besonders wichtig, wenn das mutierte Gen den Prozess der Gastrulation beeinflusst13,14. In dieser Studie werden Richtlinien aufgestellt, um synchronisierte Schwangerschaften durch Visualisierung von Vaginalplugs (d.h. der Masse der geronnenen Samenflüssigkeit, die sich nach der Paarung in der Vagina des Weibchens bildet) zu erhalten. Darüber hinaus wird eine Strategie entwickelt, um robuste Einzelzelldaten von mutierten gastrulierenden Embryonen von E6.5 bis E8 zu erhalten. Diese Strategie wurde entwickelt, um die Einschränkungen zu überwinden, die mit der geringen Anzahl von Embryonen mit dem gewünschten Genotyp pro Schwangerschaft und der Abnahme der Lebensfähigkeit durch das Einfrieren und Auftauen von Embryonen oder Zellen verbunden sind.
In dieser Arbeit wird eine optimierte Methodik von der Etablierung zeitgesteuerter Schwangerschaften über Vaginalplugs bis hin zur abschließenden Sequenzierung einzelner Zellen/Zellkerne beschrieben. Diese Methode erklärt, wie die Anzahl der synchronisierten Schwangerschaften erhöht werden kann, um eine höhere Anzahl von Embryonen mit dem gewünschten Genotyp zu erhalten, Zell-/Zellkernisolierungen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern, und ein Genotypisierungsprotokoll am selben Tag. Dieses Manuskript beschreibt auch den Prozess der Embryoisolierung zu verschiedenen Gastrulationszeitpunkten. Die Methodik trägt dazu bei, die Anzahl der endgültigen lebensfähigen embryonalen Zellen/Zellkerne für die Sequenzierung zu erhöhen und so qualitativ hochwertige Sequenzierungsdaten zu gewährleisten. Daher wird diese Methode die Türen für Einzelzellstudien an gastrulierenden Embryonen öffnen, die eine Genotypisierung erfordern.

<table><tbody><tr><td>10 cm Petrischale</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Reach Barrierespitze</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 & micro; L Reach Barrierespitze</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 & micro; L Reichweite Barrierespitze</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; m Reversibles Sieb, kleine</td><td>Stammzelle</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petrischale</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>8-Streifen-PCR-Röhrchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Bioresearch Produkt</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Trockenbad</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle gekühlte Mikrozentrifuge</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chrom Controller</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chrom Next GEM Single Cell 3' Reagenzien-Kits v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Countess Cell Couning Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagenzien</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR Dottersack</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol ( DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Röhrchen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 Imaging System</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Feinschere - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermocycler</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 Reagenzien (100 Zyklen) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 1000 Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Optischer Tubus 8x Streifen (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Optischer Tubusdeckel 8x Streifen (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Poseidon 31-511, HS24 Mikrozentrifuge, mit 24 x 1,5/2,0 mL Rotor, 1 Zentrifuge/Einheit</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Quantifizierung Assay Kits</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Standard Pattern Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Tape Station Ladespitzen</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td><td>Qualität Biologisch</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0,4</td>%<td>Theromo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer IKA MS3 mit 96-Well-Probenplattenadapter</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

einzelzell-rna-sequenzierung von mutierten ganzen mausembryonen: vom epiblasten bis zum ende der gastrulation

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

In den letzten zehn Jahren haben sich Einzelzellansätze zum Goldstandard für die Untersuchung der Genexpressionsdynamik, der Zellheterogenität und des Zellzustands in Proben entwickelt. Vor der Weiterentwicklung von Einzelzellen war die Machbarkeit, die dynamische zelluläre Landschaft und schnelle Zellübergänge während der frühen Entwicklung zu erfassen, begrenzt. In dieser Arbeit wurde eine robuste Pipeline entwickelt, um Einzelzell- und Zellkernanalysen an Mausembryonen vom Embryonaltag E6,5 bis E8 durchzuführen, was dem Beginn und Abschluss der Gastrulation entspricht. Die Gastrulation ist ein grundlegender Prozess während der Entwicklung, bei dem die drei Keimblätter Mesoderm, Ektoderm und Endoderm etabliert werden, die für die Organogenese unerlässlich sind. Es gibt umfangreiche Literatur über Einzelzell-Omics, die auf perigastrulierende Wildtyp-Embryonen angewendet werden. Die Einzelzellanalyse mutierter Embryonen ist jedoch noch selten und oft auf FACS-sortierte Populationen beschränkt. Dies ist zum Teil auf die technischen Einschränkungen zurückzuführen, die mit der Notwendigkeit einer Genotypisierung, zeitlich begrenzten Schwangerschaften, der Anzahl der Embryonen mit den gewünschten Genotypen pro Schwangerschaft und der Anzahl der Zellen pro Embryo in diesen Stadien verbunden sind. Hier wird eine Methodik vorgestellt, die darauf ausgelegt ist, diese Einschränkungen zu überwinden. Diese Methode legt Zucht- und zeitlich begrenzte Trächtigkeitsrichtlinien fest, um eine höhere Chance auf synchronisierte Schwangerschaften mit den gewünschten Genotypen zu erreichen. Optimierungsschritte bei der Isolierung des Embryos in Verbindung mit einem Genotypisierungsprotokoll am selben Tag (3 Stunden) ermöglichen die Durchführung von Mikrotröpfchen-basierten Einzelzellen am selben Tag, wodurch die hohe Lebensfähigkeit der Zellen und robuste Ergebnisse gewährleistet werden. Diese Methode enthält auch Richtlinien für optimale Zellkernisolierungen aus Embryonen. Somit erhöhen diese Ansätze die Machbarkeit von Einzelzellansätzen von mutierten Embryonen im Gastrulationsstadium. Wir gehen davon aus, dass diese Methode die Analyse erleichtern wird, wie Mutationen die zelluläre Landschaft der Gastrula prägen.

Die in dieser Arbeit entwickelte Methodik zielt speziell darauf ab, die Vorbereitung von Embryoproben für die Einzelzell-Omics von E6.5 bis E8 zu verbessern. Diese robuste Pipeline besteht aus fünf Hauptschritten: synchronisierte zeitgesteuerte Schwangerschaften, Embryoisolierung, Genotypisierung am selben Tag, Zelldissoziation und Beurteilung der Zellviabilität (Abbildung 1A). Während sich die vorgestellten Daten auf Zeitpunkte von E7 bis E7,5 konzentrieren, können sie auf Embryonen bis E8 (Abbildung 1B) mit geringen Abweichungen im Verfahren angewendet werden (siehe Hinweise im gesamten Protokoll). Synchronisierte zeitgesteuerte Schwangerschaften wurden erreicht, indem zwei weibliche Mäuse mit einer männlichen Maus in einen Käfig gesetzt wurden. Die Vaginalpfropfen wurden jeden Morgen vor 10 Uhr überprüft, und wenn ein Pfropfen beobachtet wurde, wurde er bis zum Mittag dieses Tages als E0,5 eingestuft (Abbildung 2A). In dieser Studie erforderten optimale Bedingungen für Plugs, dass eine weibliche Maus im Brunst- oder Proöstrusstadium mit einem Männchen gepaart wurde, das in der Vergangenheit mehrere Plugs während der vorherigen Zucht erfolgreich platziert hatte (Abbildung 2B). Für die Embryoisolierung wurden nur offensichtliche Pfropfen in Betracht gezogen (Abbildung 2C).
Der Zeitplan für die Entwicklung wurde nach dem Zeitplan in Abbildung 2A geschätzt. Bei E7.5 begann die Embryodissektion um 12 Uhr am 7. Tag nach dem Tag der Entdeckung eines Pfropfens. Abbildung 3 zeigt beispielhaft eine erfolgreiche Embryoisolierung bei E7,5. Nachdem die trächtige Hündin eingeschläfert worden war, wurde das Uterushorn präpariert, die Deziduschwellung einzeln durchtrennt, wodurch der Embryo zum Vorschein kam, und der Dottersack für die Genotypisierung isoliert (Abbildung 3).
Die Genotypisierung am selben Tag wurde innerhalb von 3 Stunden nach der Embryoisolierung gemäß den Schritten in Abbildung 4A durchgeführt. Die Embryonen wurden während des Prozesses der Genotypisierung auf Eis gehalten, um ihre Integrität zu erhalten. Frieren Sie die Embryonen nicht ein, da dies die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Embryo verringert. Abbildung 4B,C zeigt den viszeralen Dottersack, den parietalen endodermalen Sack und den ektoplazentären Kegel mit assoziiertem mütterlichem Blut. Der viszerale Dottersack wurde für die Genotypisierung verwendet (Abbildung 4C). Nach der Verdauung des Dottersacks wurde die PCR-Mischung hergestellt und die PCR-Reaktion durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde dann auf einem Agarosegel abgetrennt. Abbildung 4D zeigt die erwarteten Fragmentgrößen für das LoxP- und das Wildtyp-Allel (597 bp bzw. 498 bp) und das Cre-Allel (650 bp). In Abbildung 4E ist ein Beispiel für die Genotypisierung von Dottersack von 6 Embryonen dargestellt, die von Zuchtpaaren stammen, die Cre- und LoxP (flox)-Allele tragen. Die Gele zeigen die PCR-Produkte der Cre- und LoxP-Allele in den 6 analysierten Embryonen. Die Embryonen Nummer 2 und Nummer 5 tragen 2 Flox-Allele und 1 Cre-Allel; daher gelten sie als bedingte KO-Embryonen (Abbildung 4E, rote Punkte). Die Embryonen 1 und 3 haben 2 Flox-Allele, sind aber negativ für Cre; Daher gelten sie als FLOX-Kontrollen. Embryo 4 hat 2 Flax-Allele und eine schwache Bande für das Cre-Allel, was zu einem "unklaren" Genotyp führt. Dieser Embryo wurde nicht weiter verarbeitet (alternativ kann der Experimentator erwägen, die Genotypisierung zu wiederholen oder eine sekundäre Validierung des bedingten KO mit Cre-exprimierenden Zellen durchzuführen). Es ist wichtig zu beachten, dass der in diesem Experiment verwendete Cre-Treiber nicht im viszeralen Dottersack15 exprimiert wird; daher erscheinen die LoxP-Allele auf dem Gel von Cre-positiven Embryonen im Vergleich zu den Cre-negativen Embryonen nicht verschoben.
Die Zellzahl und eine gute Lebensfähigkeit sind für ein erfolgreiches Einzelzellexperiment erforderlich. Suspensionen mit geringer Zellviabilität, einem hohen Anteil an toten Zellen, Verklumpungen oder signifikanten Ablagerungen sind für die Weiterverarbeitung ungeeignet. Optimale Bedingungen sind 700-1200 lebende Zellen pro Mikroliter und eine Lebensfähigkeit von &gt;90 %. Abbildung 5A zeigt ein Panel, das sowohl eine gute als auch eine suboptimale Zellviabilität veranschaulicht. Die gleichen Kriterien können auch für die Kernisolierung angewendet werden, wie in Abbildung 5B gezeigt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass sich die Bewertung von Trypanblau von Zellen und Zellkernen unterscheidet: Lebensfähige Zellen enthalten kein Trypanblau, während lebensfähige Zellkerne dies tun. Wenn die Zell-/Zellkernsuspension optimal ist (&gt;90 % Lebensfähigkeit), fahren Sie mit der Einzelzellpartitionierung unter Verwendung eines mikrofluidischen Chips gemäß den Verfahren des Herstellersfort 11. Optionen zur Fehlerbehebung werden für Suspensionen bereitgestellt, bei denen die Lebensfähigkeit der Zellen/Zellkerne zwischen 60 % und 89 % liegt, wie in Abbildung 5C dargestellt. Wenn die Lebensfähigkeit, unabhängig von der Gesamtzahl der Zellen, unter 60 % fällt, sollten Sie das Experiment abbrechen.
Die gesamte Pipeline von der Keulung des schwangeren Damms bis zum Bibliotheksbau dauert insgesamt 8 Stunden am selben Tag (d.h. die Protokollschritte 2 bis 6 müssen am selben Tag durchgeführt werden). In Anlehnung an die Verfahren, die in den Verfahren der Einzelzellhersteller11 beschrieben wurden, wurden Bibliothekskonstruktionen für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung mit Zellen aus E7-Embryonen erstellt, wobei die Zellviabilität von suboptimalen bis zu optimalen Bedingungen reichte, mit dem Ziel, eine geschätzte Zielausbeute von 2000 Zellen zu erreichen (Abbildung 6). Abbildung 6A zeigt eine repräsentative Fragmentgrößenverteilung von scRNAseq-Bibliotheken sowohl für suboptimale als auch für optimale Bedingungen, was darauf hindeutet, dass die Zellviabilität den gesamten Einzelzellpartitionierungsprozess nicht signifikant beeinflusst. Die Fragmentgrößenverteilung lag zwischen 400 und 500 bp. Dies deutet darauf hin, dass suboptimale Bedingungen den Prozess der Bibliotheksvorbereitung nicht beeinflussen. Abbildung 6B zeigt die Ergebnisse sowohl erfolgreicher als auch suboptimaler Einzelzell-RNAseq-Experimente. Nach der Sequenzierung wurden Qualitätskontrollen an den Proben durchgeführt, bei denen festgestellt wurde, dass in Fällen, in denen die Lebensfähigkeit der Zellen suboptimal war, nur 10 % der Zellen erfolgreich sequenziert wurden. Im Gegensatz dazu wiesen optimale Proben einen höheren Prozentsatz auf, wobei 91 % der gesamten Zellen sequenziert wurden. Dies wird auch durch Barcode-Plots bewiesen, die darauf hindeuten, dass die suboptimalen Bedingungen im Vergleich zu optimalen Bedingungen ein größeres Hintergrundrauschen aufweisen. Die Clustering-Analyse wurde für beide Experimente durchgeführt und ergab 9 Cluster unter optimalen Bedingungen und 4 unter suboptimalen Bedingungen. Die Annotation der Cluster unter Verwendung bekannter Marker3 ergab erwartete Zelltypen in den E7-Embryonen, einschließlich Epiblasten und primitiver Streifen (Abbildung 6B). Cluster-Annotationen im suboptimalen Experiment waren aufgrund der fehlenden Anreicherung der bekannten Marker für jeden Cluster nicht möglich. Dies unterstreicht die Bedeutung hochwertiger Zellen, die für die korrekte Darstellung von Daten in diesen Entwicklungsphasen erforderlich sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Optimierung von gastrulierenden ganzen Mausembryonen für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. (A) Schema des Arbeitsablaufs für die Gewinnung hochwertiger Zellen und/oder Zellkerne aus gastrulierenden Embryonen. (B) Repräsentative Hellfeldbilder und angepasstes Schema3 von Mausembryonen während der Gastrulation von E7 bis E8. Maßstab: 125 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Strategie für effiziente, synchronisierte zeitgesteuerte Schwangerschaften für die Embryoisolierung während der Gastrulation. (A) Schematische Darstellung der Pipeline für zeitgesteuerte Schwangerschaften und ein Zeitplan, der die Zeiten von der Pfropfenerkennung bis zur Embryoisolierung zur Analyse spezifischer Gastrulationsphasen beschreibt. (B) Repräsentative Bilder der Phasen des Brunstzyklus bei weiblichen Mäusen. Angegeben sind die Phasen, die für die Zucht am empfänglichsten sind. (C) Schematische Darstellung, die zeigt, wie man nach Vaginalstopfen sucht, und Beispiele für Vaginalöffnungen ohne Stopfen, einen Teilstopfen oder einen guten Stopfen, die bei der Embryoisolierung in Betracht gezogen werden sollten. Die Vaginalöffnungen werden unter jedem Bild vergrößert. Der Plug (koaguliertes Sperma in der Scheidenöffnung) ist mit einem roten Pfeil hervorgehoben, der darauf zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> Abbildung 3: Dissektion und Genotypisierung von E7,5-Embryonen für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Schematische Darstellungen und Bilder des Prozesses der Isolierung von E7,5-Embryonen und des Präparierens des viszeralen Dottersacks. Der gelbe Pfeil zeigt die Gebärmutter der trächtigen Hündin an, und der gelbe gestrichelte Kreis umreißt die Position des Embryos. Gestrichelte Linien stellen die Bereiche dar, die beim Zerlegen geschnitten wurden. "M" bezeichnet das mesometriale Ende, während "AM" das anti-mesometriale Ende bezeichnet. Die Maßstabsbalken in Stereoskopbildern betragen 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> Abbildung 4: Genotypisierung von Dottersäcken aus gastrulierenden Mausembryonen am selben Tag. (A) Schema des Arbeitsablaufs für die Genotypisierung von Dottersäcken am selben Tag. (B) Repräsentatives Bild des parietalen endodermalen Sacks und des ektoplazentären Kegels mit assoziiertem mütterlichem Blut. (C) Viszeraler Dottersack in E7,5-Embryonen, hervorgehoben durch die gestrichelte Linie. Maßstabsbalken: 200 μm. (D) Repräsentative Gele des Wildtyps (+/+), des heterozygoten (Flox/+) und des homozygoten Flox (Flox/Flox) und der Cre-Genotypisierung (Mesp1cre15) mit beobachteten DNA-Fragmentgrößen. (E) Es werden am selben Tag Genotypisierungsergebnisse für Cre- und Flox-Allele aus Dottersäcken von 6 Embryonen (1-6) vorgelegt. Die beiden Embryonen mit flox/flox- und Cre-negativer (-) Genotypisierung sind flox-Kontrollen (blaue Punkte), während diejenigen mit flox/flox- und Cre-positiver (+) Genotypisierung bedingte KOs (rote Punkte) sind. Embryo 4 ist aufgrund der schwachen Cre-Bande (flox/flox und Cre-unklar) nicht optimal und wird daher von der weiteren Verarbeitung ausgeschlossen. Embryonen mit demselben Genotyp werden gepoolt und für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung verarbeitet. Beachten Sie, dass das Vorhandensein des Cre-Allels im Dottersack keinen Einfluss auf die Größe der Flox-Banden hat, da das verwendete Cre (Mesp1cre) nicht im Dottersack exprimiert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> Abbildung 5: Beurteilung der Zellqualität und der Lebensfähigkeit der Zellkerne. (A) Repräsentative Bilder optimaler und suboptimaler Zellviabilitätsbedingungen von E7.5-Embryonen. (B) Repräsentative Bilder optimaler und suboptimaler Lebensbedingungen für Zellkerne aus E8-Embryonen (C) Fehlerbehebungsschema, das mögliche Lösungen aufzeigt, um die Lebensfähigkeit von Zellen zu erhöhen, bevor mit der Einzelzellteilung begonnen wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> Abbildung 6: Einzelzell-RNA-Sequenzierung von E7-Mausembryonen. (A) Repräsentative Spur der Fragmentgrößenverteilung für Einzelzell-RNA-Sequenzierungsbibliotheken aus E7-Mausembryonen sowohl für suboptimale als auch für optimale Bedingungen der Zellviabilität, mit dem Hauptpeak bei 400-500 bp. Beachten Sie, dass die Ablaufverfolgungen zwischen diesen Bedingungen ähnlich sind, was darauf hinweist, dass die Lebensfähigkeit der Zelle keinen Einfluss auf die Qualitätskontrollen der Bibliothek hat. (B) Analyse der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsergebnisse für E7-Mausembryonen sowohl unter suboptimalen als auch unter optimalen Bedingungen, die die beobachtete Zielwiederherstellung, das Barcode-Ranking und die Clusterbildung von Zelltypen durch gleichmäßige Mannigfaltigkeitsapproximation und Projektionsverteilung (UMAP) zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Lyse-Puffer</td>
		</tr><tr><td>Name des Reagenzes</td>
			<td>Bestandskonzentration</td>
			<td>Endkonzentration</td>
			<td>Gesamtvolumen: 1 mL</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>1 Mio.</td>
			<td>ca. 10 mM</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 Mio.</td>
			<td>ca. 10 mM</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>0,1 Mio.</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr><tr><td>Tween-20</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Nondiedt P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Digitonin</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>DVB-T</td>
			<td>1 Mio.</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>RNase-Hemmer</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>ca. 25 μl</td>
		</tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Wasch-Puffer</td>
		</tr><tr><td>Name des Reagenzes</td>
			<td>Bestandskonzentration</td>
			<td>Endkonzentration</td>
			<td>Gesamtvolumen: 1 mL</td>
		</tr><tr><td>BSA in PBS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung des Zellkernisolations-Lysepuffers und des Waschpuffers.

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

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Research

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JoVE Journal

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