Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation
14. Juni 2024
In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.
Wir konzentrieren uns auf die Entschlüsselung der Mechanismen, die frühe Entscheidungen über das Zellschicksal während der Differenzierung embryonaler Stammzellen steuern, sowohl in vitro als auch in Mausmodellen. Komplexe regulatorische Netzwerke steuern die Differenzierung während der Entwicklung, und wir untersuchen, wie das Zusammenspiel von Signalwegen, Transkriptionsfaktoren und epigenetischen Regulatoren unterschiedliche Zellschicksale begünstigt. Die Untersuchung des dynamischen und schnellen Prozesses der Gastrulation bei Mäusen ist aufgrund der geringen Anzahl von Zellen pro Embryo und der begrenzten Anzahl von Embryonen mit dem gewünschten Genotyp pro Wurf technisch anspruchsvoll.
Während die Literatur die Untersuchung einzelner Zellen anhand von Wildtyp- oder fluoreszenzaktivierten zellsortierten Populationen von Embryonen ausführlich zeigt, ist eine umfassende Analyse von Embryonen mit Abstammungsmutationen noch begrenzt. Unser Protokoll bietet die Möglichkeit, einzellige omische Datensätze von gastrulierenden Embryonen zu generieren, die Mutationen der Abstammungslinie aufweisen. Es wird Wissenschaftlern helfen, die keine oder nur begrenzte Erfahrung im Umgang mit Mäusen haben oder die frühe Embryomanipulation oder Einzelzellansätze erlernen möchten.
Unser Protokoll wird dazu beitragen, neue wissenschaftliche Fragen zur Gastrulation und frühen Organogenese, einschließlich der Herzentwicklung, zu beantworten. Wir stellen eine Pipeline zur Verfügung, um linienspezifische mutierte Embryonen mit Einzelzellauflösung zu analysieren, was die Analyse der Rolle eines bestimmten Gens bei der Linienbindung erleichtern wird. Wir hoffen, diese Methodik nutzen zu können, um die regulatorischen Mechanismen von Zellschicksalsentscheidungen während des schnellen und dynamischen Prozesses der Gastrulation zu verstehen.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Erzeugung hochwertiger Einzelzell- und Zellkern-Suspensionen aus gastrulierenden Maus-Embryonen vor. Dieser Ansatz ermöglicht die Sequenzierung einzelner Zellen und Zellkerne und erlaubt dadurch eine umfassende Analyse der embryonalen Entwicklung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Die Gastrulation ist eine kritische Phase der embryonalen Entwicklung.
- Frühe Zellschicksensentscheidungen werden durch komplexe regulatorische Netzwerke beeinflusst.
- Es existieren nur begrenzte Studien an Embryonen mit Linienmutationen.
- Die Einzelzellanalyse ist aufgrund der geringen Anzahl von Zellen pro Embryo herausfordernd.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Protokolls für die Einzelzellanalyse gastrulierender Maus-Embryonen.
- Ermöglichung der Embryomanipulation für Forschende mit begrenzter Erfahrung in der Handhabung von Mäusen.
- Erleichterung der Generierung von Omics-Datensätzen aus Embryonen mit Linienmutationen.
Verwendete Methoden
- Isolierung einzelner Zellen und Zellkerne aus Maus-Embryonen.
- Sequenzierung von Einzelzell- und Zellkern-Suspensionen.
- Anwendung des Protokolls auf Embryonen mit bestimmten genetischen Hintergründen.
- Analyse von Signalwegen und Transkriptionsfaktoren während der Gastrulation.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll erzeugt erfolgreich hochwertige Einzelzell-Suspensionen.
- Es ermöglicht eine umfassende Analyse früher Zellschicksensentscheidungen.
- Erleichtert die Untersuchung von Embryonen mit Linienmutationen.
- Bietet eine wertvolle Ressource für Forschende, die neu in der Embryomanipulation sind.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung der Gastrulation bei Mäusen.
- Das etablierte Protokoll vertieft das Verständnis der embryonalen Entwicklung.
- Es eröffnet neue Forschungsansätze zu Linienmutationen in embryonalen Modellen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten Maus-Embryonen während der Gastrulation ermöglicht eine beispiellose Auflösung von Zellschicksalsentscheidungen und Linienbestimmung und liefert damit direkte Erkenntnisse für die frühe Entdeckung und Zielvalidierung in der Entwicklungsbiologie und der Modellierung von Erkrankungen. Diese robuste Pipeline überwindet technische Hürden bei der Genotypisierung und Zellviabilität und unterstützt so die Vorhersagegenauigkeit mechanistischer Studien zur Genfunktion. Der Ansatz steigert den Portfolio-Wert, indem er eine systematische Untersuchung genetischer Störungen an kritischen Entwicklungszeitpunkten ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die hochauflösende Kartierung der Genexpressionsdynamik während der Zellliniendifferenzierung.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung genetischer Zielstrukturen, die an der frühen Organogenese beteiligt sind.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem Mutationen mit zellulären Phänotypen in Einzelzellauflösung verknüpft werden.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Zielstrukturauswahl in Entwicklungs- und regenerativen Medizinansätzen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte Einzelzell- und Zellkern-Suspensionen für nachgeschaltete Omics-Analysen.
- Standardisiert die Probenvorbereitung und Genotypisierung für reproduzierbare quantitative Ergebnisse.
- Ermöglicht skalierbare Untersuchungen genetischer Störungen in synchronisierten embryonalen Populationen.
- Unterstützt die robuste Entwicklung von Assays zur Bewertung der Genfunktion in komplexen Geweben.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt zelluläre Phänotypen mit krankheitsrelevanten Entwicklungsstadien zur entdeckungsorientierten Biomarker-Identifizierung.
- Stellt eine lückenlose Übertragung von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung der Genfunktion sicher.
- Reduziert Risiken bei Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem mechanistische Einblicke in Entwicklungsstörungen bereitgestellt werden.
- Ermöglicht die Modellierung angeborener Krankheitsmechanismen auf Einzelzell-Ebene.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methodik reicht von der frühen Entdeckung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Forschung und ermöglicht eine systematische Analyse der Genfunktion während der Embryogenese.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Aufklärung von Zellzustandsübergängen in mutierten Embryonen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Einzelzell-Daten für den vergleichenden Nachweis genetischer Varianten.
- Analytik: Bietet inhaltsreiche Messgrößen für den statistischen Vergleich von Zellpopulationen und Genexpressionsprofilen.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckung und präklinische Phase, indem krankheitsrelevante Entwicklungsprozesse modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten, wiederverwendbaren Workflow für die Einzelzellanalyse diverser genetischer Modelle.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Einzelzell-Analysen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige Risikominderung genetischer Zielstrukturen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Entwicklungsbiologie-Programmen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Embryologie, Einzelzell-Genomik und Genotypisierungsprotokollen.
- Setzt Zugang zu mikrofluidischen Partitionierungsplattformen und Infrastruktur für Hochdurchsatzsequenzierung voraus.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung zwischen den Teams für die Probennahme und Datenanalyse.
- Möglicherweise ist eine Anpassung an verschiedene Entwicklungsstadien oder genetische Hintergründe notwendig.
- Die Zellausbeute und -viabilität sind durch das Embryonalstadium und die Genotypfrequenz begrenzt.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:50
Isolation of Murine Embryos During Gastrulation for Single‐Cell RNA Sequencing
5:30
Same‐Day Genotyping of Isolated Gastrulating Murine Embryos
7:22
Cell Dissociation of Isolated Gastrulating Murine Embryos for Single‐Cell Sequencing
