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</ol>

<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C Lagerung</td><td></td><td></td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>0,1% Gelatine in Wasser</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>0,2 &micro;m Filtereinheiten</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>0,5% Trypsin-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7,5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>Optional: zum Einfügen von FTA in ein endogenes ribosomales Protein-Locus</td></tr><tr><td>1,5 und 2 mL Mikrozentrifugenrohre, autoklaviert</td><td></td><td></td><td>Für Transfektion</td></tr><tr><td>1,5, 2 mL und 5 mL Protein-Low-Binding-Mikrozentrifugenrohre</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>10 cm Gewebekulturplatten</td><td></td><td></td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS-Laufpufferkonzentrat</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>37 &deg;C Gewebekulturinkubator x 2</td><td></td><td></td><td>Für Zellkultur. Einer dieser dient als Hauptinkubator für Zellkultur und Beleuchtung transfizierter Zellen. Am Tag der ALIBi-Aktivierung wird vorübergehend Platz in einem zweiten Inkubator benötigt, um transfizierte Zellen unterzubringen, während der Transilluminator im Hauptinkubator eingerichtet wird.</td></tr><tr><td>37 &deg;C Wasserbad</td><td></td><td></td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>50 mM Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>6x Laemmli-Puffer</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Für Desinfektion</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung</td></tr><tr><td>AcTEV Protease Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>ALIBi C-Fragment-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>Midi-Prep-Skala ist für die Transfektion erforderlich</td></tr><tr><td>ALIBi N-Fragment-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>Midi-Prep-Skala ist für die Transfektion erforderlich</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung</td></tr><tr><td>anti-FLAG-Antikörper</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>anti-GAPDH-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>anti-Maus-Sekundärantikörper</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>anti-Kaninchen-Sekundärantikörper</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>anti-Rpl12-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>anti-Rpl31-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>anti-Rpl5-Antikörper</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>anti-V5-Antikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>Blaulicht-Transilluminator</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (klein) oder DR196 (groß)</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>C18-Tips (OMIX C18-Tips)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung</td></tr><tr><td>Zellgefriercontainer</td><td></td><td></td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>Zentrifuge für 15 mL und/oder 50 mL Konusrohre</td><td></td><td></td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>Zentrifuge für 1,5-2 mL Mikrozentrifugenrohre</td><td></td><td></td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung. Sollte in der Lage sein, bis auf 4 °C gekühlt zu werden und Geschwindigkeiten bis zu 17.000 g. Idealerweise befindet es sich in einem Raum, der vorübergehend abgedunkelt werden kann, während Rohre hinein und heraus übertragen werden.</td></tr><tr><td>Clarity ECL Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>Criterion Geltank</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>Criterion TGX Fertiggele, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>Für Western Blot. Zusätzliche Wellsgrößen und Layouts verfügbar</td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>Desoxycholat</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>Für Lysis &amp; Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA39255</td><td>Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung</td></tr><tr><td>DPBS, ohne Calcium, ohne Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>ES-qualifiziertes FBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-009-B</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Gold Shield</td><td>412828</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>459828</td><td>Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung</td></tr><tr><td>Formicsäure</td><td>MilliporeSigma</td><td>A117</td><td>Optional: für Massenspektrometrie-Stichprobenvorbereitung</td></tr><tr><td>Fragmentgrößenanalysator und Verbrauchsmaterialien</td><td></td><td>Agilent</td><td>Optional: für RNA-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung. Agilent 2100 Bio

isolierung subzellulärer ribosom-subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter beleuchtungsverstärkter biotinylierung

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis buffer, and wash buffers. Using a pipette, mix buffers containing dense or viscous components to ensure even mixing. Chill the prepared buffers on ice before use.Re-suspend the stock bottle of streptavidin beads by gentle pipetting or rocking. Transfer 450 microliters of beads into a protein low binding tube for each 10 centimeter plate of cells. Place the re-suspended beads on the magnetic rack for one minute, or until the beads have fully migrated.Aspirate and discard the bead storage buffer without touching the bead pellet. Wash the beads two times with 900 microliters of RNAs removal buffer. Wash the beads once with 900 microliters of salt wash.Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer. Store the beads in the wash I buffer at four degrees Celsius while performing activation and cell lysis. Add biotin and CHX to the warmed aliquot of media and keep at 37 degrees Celsius until use.Add CHX to the cold DPBS aliquot and keep it chilled until use. Aspirate the media from the transfected plates. Immediately add 10 milliliters of warm media containing CHX with or without Biotin to each plate.Place negative control plates in a dark incubator. Place the remaining plates directly on top of the transilluminator. Turn on the transilluminator and incubate the plates for 15 minutes.Wash each plate two times with the 10 milliliters of cold DPBS containing CHX. Place the plates on ice between and after washes. After aspirating the second wash, tilt the plate and aspirate any residual DPBS.Keeping the plate flat on ice, add two milliliters of ice-cold lysis buffer and incubate the plate on ice for five minutes. Tap the plate two to three times during incubation to dislodge cells. Using a micropipette, pipette the lysate up and down across the plate surface to dislodge any remaining cells.Transfer the lysate to a chilled labeled protein low binding tube. In difficult to lyse organelles, sonicate all samples for 45 seconds at four degrees Celsius. And if required, transfer the lysate into a larger tube before sonication.Transfer the sonicated lysate into a two-milliliter tube. Incubate the lysate on ice for 15 minutes. Centrifuge the lysate at 17, 000 G for three minutes at four degrees Celsius.Transfer the supernatant into a chilled protein low binding tube without disturbing the pellet. Using a magnetic rack, pellet the washed strepped avident beads. Aspirate the wash one buffer.Transfer 1, 200 microliters of clarified lysate to the tube containing the washed beads. Pipette up and down gently to re-suspend the beads. Store the remaining clarified lysate at minus 80 degrees Celsius.Incubate the lysate with the beads at four degrees Celsius in the dark on a tube rotator for one hour. During the incubation, prepare the Tobacco Etch Virus, or TEV elution buffer. Pellet the beads on a magnetic rack.Transfer the supernatant to a chilled protein low binding tube. Store the supernatant at minus 80 degrees Celsius. Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer and once with 900 microliters of wash II buffer.Add 450 microliters of TEV elution buffer to the beads. Incubate the beads in TEV elution buffer for one hour at room temperature on a tube rotator. Pellet the beads on the magnetic rack.Transfer the elute to a protein low binding tube. Store the eluate at minus 80 degrees Celsius if proteomics analysis or Western blot is intended. Cells containing all system components showed a L31-FTA band, which was stronger with full length burray and faint or absent when components were omitted.Endogenous biotinilated carboxylase proteins were detected in all lysates at 70 to 80 kilodaltons and 120 to 130 kilodaltons. ANTV5 probing confirmed expression of the split bore fragments. Biotinillated L31FTA decreased in the flow through relative to the lysate.No biotinillated L31-FTA was present in the eluate following TEV-mediated elution. Anti-flag probing showed a cleaved L31-FTA band at a lower molecular weight than intact L31-FTA ribosomal protein. S12 probing demonstrated the presence of the small ribosomal subunit in the eluate.Anti-V5 probing showed that proteins that do not bind the ribosome were absent from the eluate. When 2.5 fold more lysate was used with the same 450 microliters of streptavidin coated beads, a substantial amount of biotinilated L31-FTA remained in the flow through. Endogenous biotinilated proteins were partially depleted in the flow through.Endogenous biotinillated proteins were absent from the eluet, but were recovered after heating post-dilution beads in lambly buffer. Anti-flag probing detected cleaved L31-FTA at a lower molecular weight than intact L31-FTA. Anti-V5 probing showed that the split burray fragments were absent from the eluate.ALIBi enables the identification of ribosome-bound proteins and mRNAs in specific subcellular regions, revealing differences in translation regulation. The key challenge is maintaining specific proximity labeling through careful control of targeting construct expression and illumination conditions. Following this protocol, affinity purified ribosomes and associated mRNAs can be analyzed using quantitative proteomic and transcriptomic approaches.

isolation-subcellular-ribosome-subpopulations-based-on-recombinant

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Eine Technik zur translationalen Pause Sites auf mRNA zu identifizieren beschrieben wird. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide ansammeln auf Ribosomen während der in vitro Translation einer Ziel-mRNA, durch die Größe Analyse der naszierenden Ketten mit Hilfe eines denaturierenden Gelelektrophorese gefolgt basiert.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

Wir beschreiben hier eine Technik, die inzwischen routinemäßig eingesetzt wird, um stabil gebundene Ribosomen entstehenden Kette Komplexen (RNC) zu isolieren. Diese Technik nutzt die Entdeckung, dass ein 17 Aminosäuren langes SecM "Verhaftung Sequenz" können Translationselongation in einem prokaryotischen aufzuhalten...

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Techniken, um die Mechanismen der Sekretion von HIV-1 Nef in exosomes zerlegen beschrieben. Spezifische kurze Peptide von Nef-Protein und Transfektion abgeleitet wurden genutzt, um die Struktur, Funktion und Bindungspartner von Nef die Sekretion Modification Region bestimmen. Diese Verfahren haben allgemeine Bedeutung in vielen mechanistischen Studien.

Peptid-basierte Identifizierung von Functional Motive und ihre Bindungspartner

Dieses Protokoll stellt wesentliche Änderungen Polyribosom Fraktionierung, um die translatome von in vivo ZNS-Proben zu untersuchen. Es ermöglicht umfassende Beurteilung der Übersetzung und der Transkriptionsregulation durch die Isolierung und der Vergleich der Gesamt-RNA gebunden Ribosomen-RNA-Fraktionen.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Hier beschreiben wir die Immunpräzipitation von Ribosomen und zugehöriger RNA aus ausgewählten Populationen erwachsener männlicher Mauskeimzellen mit dem RiboTag-System. Strategische Züchtung und sorgfältige Immunpräzipitation führen zu sauberen, reproduzierbaren Ergebnissen, die über das Keimzelltranslatom informieren und Einblicke in die Mechanismen mutierter Phänotypen geben.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energietransfer ist eine Methode, die die tRNA-Dynamik während der ribosomalen Proteinsynthese verfolgt. Durch die Verfolgung einzelner Ribosomen werden inhomogene Populationen identifiziert, die Aufschluss über Mechanismen geben. Diese Methode kann verwendet werden, um biologische Konformationsänderungen im Allgemeinen zu verfolgen, um dynamische Funktionsbeziehungen in vielen anderen komplexen Biosystemen aufzudecken. Einzelmolekülmethoden können...

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Wir präsentieren ein zweistufiges Protokoll für die qualitativ hochwertige Isolierung von Mitochondrien, das mit der Entdeckung und Quantifizierung von Proteinen auf Proteomebene kompatibel ist. Unser Protokoll kommt ohne Gentechnik aus und eignet sich daher für die Untersuchung von Mitochondrien aus allen primären Zellen und Geweben.

Zweistufige tag-freie Isolierung von Mitochondrien für eine verbesserte Proteinentdeckung und -quantifizierung

Stanford School of Medicine.  Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

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