Name: Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Pyroptose in aviären Zellen mittels Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit Antikörpern gegen chGSDME-NT und Propidiumiodid identifizieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Quantifizierung pyroptotischer Zellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. Jue Liu für seine freundliche Unterstützung. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (Nr. 2022YFD1800300), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32130105) und des Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (Nr. CARS-40), China.

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Probenzellen
<ol><li>Kultivieren Sie DF-1-Zellen (immortal chicken embryo fibroblasts) in Sechs-Well-Platten (5 x 10,5 Zellen pro Well) mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 38 °C.</li>
	<li>Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, entsorgen Sie das serumhaltige Zellkulturmedium, waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie dann 2 ml serumfreies Zellkulturmedium in jede Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie die IBDV-Viruslösung (mit dem berechneten MOI) zu jeder Vertiefung hinzu und richten Sie eine simulierte infizierte Kontrolle ein, indem Sie das DMEM-Volumen hinzufügen, das dem der Viruslösung entspricht.</li>
	<li>Nach 1 h Virusadsorption verwerfen Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, geben Sie 2 ml DMEM mit 2 % FBS in jede Vertiefung und setzen Sie die Zellkulturen 24 Stunden lang fort.</li>
	<li>24 h nach der IBDV-Infektion, führen Sie eine Trypsin-Behandlung (500 μl pro Well) für 1 min durch und neutralisieren Sie anschließend mit DMEM, ergänzt mit 10 % FBS (2 mL pro Well). Anschließend müssen die Zellen geerntet werden, um Einzelzellsuspensionen für die Durchflusszytometrie herzustellen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min bei 2-8 °C. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS und wirbeln Sie die Röhren vorsichtig 3 s lang.</li>
	<li>Die Zellen werden wie in Schritt 1.6 beschrieben zentrifugiert (400 x g für 5 min bei 2-8 °C).</li>
	<li>Wiederholen Sie das Waschen der Zellen wie in Schritt 1.7 und Schritt 1.8 beschrieben.</li>
	<li>Führen Sie die Zellzählung mit einem Hämozytometer unter einem Mikroskop durch. Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen Durchflusszytometrie-Färbepuffer (so dass die endgültige Zellkonzentration 1 x 107 Zellen/ml beträgt). Wirbeln Sie die Suspensionen vorsichtig ein.</li>
</ol>2. Zellfärbung für die Durchflusszytometrie
<ol><li>100 μl der einzelligen Suspensionen aus Schritt 1.10 werden in 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden (12 mm × 75 mm) gegeben. Bereiten Sie Schein- und IBDV-infizierte Zellen für die anti-chGSDME-NT/CT-Antikörperfärbung vor und verwenden Sie normales Maus-IgG als Isotypkontrolle. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Blindkontrolle und einzelne gefärbte Röhrchen mit IBDV-infizierten Zellen vor.</li>
	<li>Geben Sie 1 μg entweder Alexa Fluor 647-markiertes anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb oder normales Maus-IgG (als Isotypkontrolle) in IBDV-infizierte bzw. Mock-Control-Röhrchen. Anschließend die Röhren 3 s lang vorsichtig durchwirbeln.</li>
	<li>Inkubieren Sie die gefärbten Zellen bei 2-8 °C oder 30 min im Dunkeln auf Eis. Alle 10 min die Schläuche sanft vortexen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 1 mL Durchflusszytometrie-Färbepuffer durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 2-8 °C. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
	<li>Wiederholen Sie das Waschen der Zellen wie in Schritt 2.4 beschrieben.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl Durchflusszytometrie-Färbepuffer.</li>
	<li>Die Zellen der IBDV-infizierten Gruppe und der Schein-infizierten Gruppe sowie der PI-Einzelfärberöhrchen werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 μg/ml PI gefärbt, gefolgt von der Zugabe von 400 μl Durchflusszytometrie-Färbepuffer für den Durchflusszytometrie-Assay.</li>
</ol>3. Durchführung des Durchflusszytometrie-Assays
<ol><li>Schalten Sie das Durchflusszytometer ein, um das Gerät zu initialisieren und die Software zu starten.</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Ausführen des blinden Kontrollrohrs, gefolgt von den einzelnen gefärbten Röhrchen, um die Spannung und die Kompensationsparameter des Durchflusszytometers einzustellen. Verwenden Sie FL3- und FL4-Fluoreszenzkanäle, die bei 635 nm emittieren, zum Nachweis von PI- bzw. Alexa Fluor 647-Fluorophoren.</li>
	<li>Nachdem Sie alle Parameter konfiguriert haben, führen Sie alle Beispiele nacheinander aus.</li>
</ol>4. Analyse von Durchflusszytometrie-Daten
<ol><li>Analysieren Sie die Alexa Fluor 647-Färbung jeder Probe im FL4-Kanalhistogramm.</li>
	<li>Um den Anteil der doppelt positiven Zellen in jeder Probe zu bewerten, verwenden Sie das Vier-Quadranten-Punktdiagramm von FL3/FL4.</li>
	<li>Festlegung positiver Schwellenwerte auf der Grundlage von doppelt gefärbten IgG/PI-Proben der Isotypkontroll, um sicherzustellen, dass der Anteil der doppelt positiven Zellen unter 1 % bleibt. Dieser Ansatz ermöglicht es, den Anteil der doppelt positiven Zellen in allen Proben zu messen.</li>
</ol>

Quantifizierung der Pyroptose in mit dem Virus der infektiösen Schleimbeutelkrankheit infizierten DF-1-Zellen

<ol><li>He, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+D+is+an+executor+of+pyroptosis+and+is+required+for+interleukin-1%CE%B2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion.</a> Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+Gasdermin+D+for+non-canonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Angosto-Bazarra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+the+Dasdermin+family+suggest+conserved+roles+in+infection+response+despite+loss+of+pore-forming+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality.</a> BMC Biol. 20 (1), 9(2022).</li>
<li>De Schutter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punching+holes+in+cellular+membranes%3A+Biology+and+evolution+of+gasdermins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+gasdermin+E+is+cleaved+by+caspase+1%2C+3%2C+and+7+and+induces+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis.</a> J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+gasdermin+E+is+a+substrate+of+caspase-3%2F-7+and+an+executioner+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis.</a> Front Immunol. 13, 1078526(2022).</li>
<li>Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+infectious+bursal+disease-the+past%2C+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future.</a> Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).</li>
<li>Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+infectious+bursal+disease+virus+consists+of+two+segments+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA.</a> J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).</li>
<li>Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbated+apoptosis+of+cells+infected+with+infectious+bursal+disease+virus+upon+exposure+to+interferon+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha.</a> J Virol. 92 (11), (2018).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+chicken+microRNA-16-5p+expression+in+DF-1+cells+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+enhances+IBDV-induced+apoptosis+and+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication.</a> J Virol. 94 (2), e01724(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+voltage-dependent+anion+channel+2+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptosis+in+host+cells+via+interaction+with+VP5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5.</a> J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).</li>
<li>Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+induces+apoptosis+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).</li>
<li>Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+cancer+cell+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring cancer cell pyroptosis.</a> Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-d+pore+and+its+morphology+is+different+from+mlkl+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis.</a> Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieser Artikel beschreibt eine effektive Methode zur Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie, die durch duale Färbung infizierter Zellen mit Alexa Fluor 647-markiertem anti-chGSDME-NT McAb und PI erreicht wird. Dieser Ansatz kann auch auf verschiedene Zelltypen angewendet werden, um die Pyroptose von anderen Arten des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, zu unterscheiden.
Pyroptose, eine entzündliche Art des programmierten Zelltods, die in erster Linie auf der D-induzierten Porenbildung von Gasdermin (GSDM) beruht, wurde traditionell mit Methoden wie LDH-Freisetzung 6,15, morphologischen Merkmalen16 und dem Nachweis von GSDM-NT/GSDM-CT-Fragmenten mittels Western Blot oder IFA-Assays17 bewertet. Keine dieser Methoden quantifiziert jedoch den Prozentsatz der pyroptotischen Zellen genau. Diese Studie nutzt die charakteristischen Plasmamembranporen in pyroptotischen Zellen, die aus GSDM-NT-Fragmenten gebildet werden, um eine auf Durchflusszytometrie basierende Strategie für deren Bestimmung zu entwickeln.
Bei der dualen Färbung der Zellen mit chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 und PI und der anschließenden Analyse mittels Durchflusszytometrie in den FL3- und FL4-Fluoreszenzkanälen war die Pyroptose über zwei Parameter gleichzeitig erkennbar: die chGSDME-NT-Alexa Fluor 647-Färbung, die auf die Porenbildung der Plasmamembran durch das N-terminale Fragment des gespaltenen chGSDME hinweist, und die PI-Färbung, die auf einen Plasmamembranbruch hinweist. Die Daten zeigen, dass der Anteil der doppelt positiven chGSDME-NT/PI-Zellen in IBDV-infizierten Zellen (ca. 33%) signifikant höher war als in mock-infizierten Kontrollen (P < 0,001).
Die experimentelle Methode erfordert mehrere Überlegungen, um Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu gewährleisten. Erstens sollte jedes Probenröhrchen, das für die Durchflussanalyse verwendet wird, nicht weniger als 1 x 106 Zellen enthalten, um die Präzision der Durchflussanalyse zu erhalten. Angesichts der mehrfachen Waschschritte im Protokoll ist es ratsam, die anfängliche Anzahl der Zellen in jedem Röhrchen bei Schritt 2.1 entsprechend zu erhöhen, beispielsweise auf 2 x 106 Zellen. Es ist wichtig, das Waschen und Übertragen von Zellen mit äußerster Vorsicht zu handhaben, um eine unbeabsichtigte Störung der Zellintegrität zu vermeiden. Beachten Sie außerdem, dass die Zelldichte, die Antikörperkonzentration und die Dauer der Operation die optimalen Parametereinstellungen beeinflussen können. Daher ist es notwendig, die Parameter und Einstellungen des Durchflusszytometers auf der Grundlage der spezifischen Versuchsbedingungen anzupassen. In dieser Studie wurden folgende Parameter verwendet: FSC AmpGain wurde auf 1,40 und die SSC-Spannung auf 490 V eingestellt. Das Gate im FSC/SSC-Plot wurde so eingestellt, dass es alle Zellpopulationen für die anschließende FL3/4-Kanal-Analyse abdeckt. Die Fluoreszenzspannungen wurden auf 600 V für den FL3-Kanal (PI) und 600 V für den FL4-Kanal (Alexa Fluor 647) eingestellt. Die Kompensation wurde auf 38,0 % zwischen den Kanälen FL4 und FL3 festgelegt. Die Flussrate wurde auf 200 Ereignisse/s festgelegt, wobei der Ereignisschwellenwert auf 10.000 festgelegt wurde.
Mit Hilfe des neuartigen Ansatzes hat sich das Verständnis der Rolle der GSDME-vermittelten Pyroptose bei der Wirtsantwort auf pathogene Infektionen bei Hühnern und der zugrundeliegenden Mechanismen erheblich weiterentwickelt. Durch den Einsatz spezifischer Antikörper konnten wir porenbildende chGSDME-NT mittels Durchflusszytometrie untersuchen, pyroptotische Zellen von anderen unterscheiden und die Bestimmung des Anteils der Zellen, die einer Pyroptose unterzogen werden, erleichtern. Dadurch bietet diese Methode einen deutlichen Vorteil gegenüber Western-Blot- oder IFA-Assays beim Nachweis pyroptotischer Zellen.
Die Einschränkung dieses Protokolls liegt jedoch darin, dass das N-terminale Fragment von Hühner-GSDME in IBDV-infizierten Zellen als experimentelles Modell für die Untersuchung der Pyroptose verwendet wird. Nichtsdestotrotz stellt diese Studie den ersten erfolgreichen Einsatz der Durchflusszytometrie zur Bestimmung der Pyroptose dar.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Durchflusszytometrie-Methode zur Untersuchung der Pyroptose ein großes Potenzial für ein besseres Verständnis der Mechanismen der Pyroptose sowohl bei Säugetieren als auch bei Vögeln birgt. Diese Methode ist ein wirksames Instrument, das zur Erforschung des Zelltods in den Lebenswissenschaften beiträgt.

Die Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die bei Säugetieren hauptsächlich von der Bildung von Plasmamembranporen durch Gasdermin (GSDM) D abhängt 1,2,3. Aufgrund des genetischen Mangels an GSDMD bei Hühnern 4,5 bleibt der Mechanismus der Pyroptose bei Hühnern schwer fassbar. Die Gasdermin-Familie umfasst konservierte Proteine, darunter GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDMME und DFNB59 3,6. Studien haben gezeigt, dass GSDME aus Teleostfischen und Enten durch Caspase-1/3/7 oder Caspase-3/7 gespalten wird, um den pyroptotischen Zelltod zu induzieren 7,8. Die Rolle der GSDME-vermittelten Pyroptose bei der Wirtsreaktion auf pathogene Infektionen bei Hühnern muss jedoch noch geklärt werden.
Die Infektiöse Schleimbeutelkrankheit (CED) ist eine akute, hochansteckende und immunsuppressive Geflügelkrankheit, die durch IBDV9 verursacht wird. IBDV, ein unbehülltes bi-segmentiertes doppelsträngiges (ds) RNA-Virus, gehört zur Gattung Avibirnavirus in der Familie der Birnaviridae10. Frühere Studien anderer und unseres Labors haben gezeigt, dass eine IBDV-Infektion den Zelltod in Wirtszellen über verschiedene Wege induziert 11,12,13,14. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass eine IBDV-Infektion die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) auslöst, einem Indikator für den lytischen Zelltod 6,15, was darauf hindeutet, dass eine IBDV-Infektion den lytischen Zelltod in Wirtszellen induziert. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass IBDV-infizierte Zellen morphologische Merkmale des pyroptotischen Zelltods aufweisen, einschließlich einer Zellschwellung mit großen Blasen, die aus der Plasmamembran wehen, und einer positiven Propidiumiodid (PI)-Färbung, was darauf hindeutet, dass eine IBDV-Infektion Pyroptose in Zellen induziert.
In Anbetracht der Tatsache, dass die Bildung von Membranporen in pyroptotischen Zellen durch das N-terminale Fragment von gespaltenem GSDM (GSDM-NT) ein Kennzeichen der Pyroptose ist, könnten pyroptotische Zellen theoretisch durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, indem GSDM-NT auf der Zellmembran mit spezifischen Antikörpern untersucht wird. In pyroptotischen Zellen von Vögeln bildet das N-terminale Fragment von Hühnergasdermin E (chGSDME-NT) Membranporen, die es Propidiumiodid (PI) ermöglichen, die DNA zu durchdringen und zu binden. So kann der Anteil pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, wodurch die Pyroptose von anderen Formen des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, unterschieden wird. Über die Methode zur Untersuchung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie wurde jedoch nicht berichtet. In dieser Studie wurden DF-1-Zellen mit IBDV infiziert, und es wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um pyroptotische Zellen mit monoklonalen Antikörpern (McAb) gegen das chGSDME-NT-Fragment (membrangebunden) und PI-Färbung zu untersuchen. Überraschenderweise konnten pyroptotische Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie effektiv nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte der Anteil pyroptotischer Zellen quantifiziert werden. Diese Erkenntnisse stellen ein leistungsfähiges und effektives Mittel zur Bestimmung der Pyroptose dar.
In diesem Artikel wird eine Methode zur Untersuchung der Pyroptose in IBDV-infizierten Zellen mittels Durchflusszytometrie mittels anti-chGGME-NT, MCAB- und PI-Färbung beschrieben. Diese Methode kann auch auf andere erregerinfizierte Zellen ausgeweitet und angewendet werden, um verschiedene Zelltypen mit Pyroptose zu untersuchen und sie von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden.

<table><tbody><tr><td>5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden (12x 75 mm)</td><td>Corning Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Antikörper-Markierungskits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-CT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)</td><td>EU0228</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-NT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)</td><td>EU0227</td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Kryogene Gefrierzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0193-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie Färbepuffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Qiu-jing Biochemisches Reagenz & Instrument Company (Shanghai, China)</td><td>YX-JSB52</td><td></td></tr><tr><td>IBDV Lx Stamm</td><td></td><td></td><td>IBDV Lx Stamm wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Chongqing Photoelectric Instrument Company</td><td>XDS-1B</td><td></td></tr><tr><td>Normales Maus-IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>M& C&nbsp; Gentechnologie</td><td>CC017</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid(PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,25%</td><td>M& C&nbsp; Gentechnologie</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Oszillator</td><td>MIULAB</td><td>MIX-28+</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung der pyroptose mittels durchflusszytometrie

Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry

Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die hauptsächlich durch die Bildung von Plasmamembranporen durch den N-Terminus angetrieben wird, die aus den gespaltenen Proteinen der Gasdermin-Familie (GSDM) erzeugt werden. Die Untersuchung von membrangebundenem GSDM-NT mittels Western Blot ist die am häufigsten verwendete Methode zur Beurteilung der Pyroptose. Allerdings ist es mit dieser Methode schwierig, Zellen mit Pyroptose von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden. In dieser Studie wurden mit dem Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) infizierte DF-1-Zellen als Modell verwendet, um den Anteil der Zellen, die einer Pyroptose unterzogen werden, mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren, wobei spezifische Antikörper gegen das N-terminale Fragment der Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI)-Färbung verwendet wurden. Die chGSDME-NT-positiven Zellen waren mittels Durchflusszytometrie mit Alexa Fluor 647-markierten Anti-chGSDME-NT-Antikörpern leicht nachweisbar. Darüber hinaus war der Anteil der doppelt positiven chGSDME-NT/PI-Zellen in IBDV-infizierten Zellen (rund 33 %) signifikant höher als in scheininfizierten Kontrollen (P < 0,001). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Untersuchung von membrangebundenem chGSDME-NT mittels Durchflusszytometrie ein wirksamer Ansatz zur Bestimmung pyroptotischer Zellen bei Zellen im Zelltod ist.

chGSDME-NT auf der Membran von DF-1-Zellen mit IBDV-Infektion konnte mittels Durchflusszytometrie leicht nachgewiesen werden Eines der wichtigsten Merkmale pyroptotischer Zellen ist die Bildung von Membranporen durch GSDM-NT-Fragmente, die aus der Gasdermin-Spaltung erzeugt werden. Daher könnten pyroptotische Zellen theoretisch durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, indem GSDM-NT auf Zellmembranen mit spezifischen Antikörpern untersucht wird. So wurden DF-1-Zellen mit IBDV infiziert und die pyroptotischen Zellen mittels Durchflusszytometrie mit Alexa Fluor 647-markierter anti-chGSDME-NT McAb- und PI-Färbung untersucht. Eine beträchtliche Anzahl von chGSDME-NT-positiven Zellen wurde nach einer IBDV-Infektion durchflusszytometrisch nachgewiesen (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu zeigten scheininfizierte Kontrollen oder Zellen, die mit Isotyp-Kontroll-IgG gefärbt wurden, nur minimale Alexa Fluor 647-positive Zellen. Diese Ergebnisse zeigen den effektiven und spezifischen Nachweis von membrangebundenem chGSDME-NT mittels Durchflusszytometrie. Bemerkenswert ist, dass die C-terminalen Fragmente von gespaltenem chGSDME (chGSDME-CT) im Zytoplasma zurückgehalten und nicht wie chGSDME-NT in die Plasmamembran transloziert wurden, dass chGSDME-CT-Fragmente durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Membranoberflächenantigen-Färbung kaum nachweisbar waren, was mit der Tatsache übereinstimmte, dass Pyroptose mit membrangebundenen chGSDME-NT-Fragmenten assoziiert war.
Die Pyroptose in DF-1-Zellen kann durch Durchflusszytometrie bestimmt werden, indem Zellen mit Fluorescein-markierten anti-chGSDME-NT, MCAB und PI gefärbt werden Wenn Zellen doppelt mit Alexa Fluor 647-markiertem anti-chGSDME-NT MCAB und PI gefärbt wurden, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse in den FL3- und FL4-Fluoreszenzkanälen, konnten pyroptotische Zellen bestimmt werden, indem die chGSDME-NT- und PI-Färbung positiv war. Wie in Abbildung 2A,B gezeigt, wurde eine beträchtliche Anzahl von chGSDME-NT-positiven Zellen mit IBDV-Infektion durch Durchflusszytometrie-Assays nachgewiesen, und der Anteil von chGSDME-NT/PI-Doppel-positiven Zellen in IBDV-infizierten Zellen (etwa 33%) war signifikant größer als der von scheininfizierten Kontrollen (P &lt; 0,001), was darauf hindeutet, dass die Bildung von Membranporen durch das chGSDME-NT war synchron mit der Störung der Zellmembranen, wodurch diese IBDV-infizierten Zellen den pyroptotischen Zelltod erlitten. Diese Daten zeigen deutlich, dass eine IBDV-Infektion eine chGSDME-vermittelte Pyroptose in Wirtszellen induziert. Während PI-Single-positive Zellen andere Formen des Zelltods darstellen können, die durch eine IBDV-Infektion induziert werden. Daher stellt die Untersuchung von porenbildendem chGSDME-NT mittels Durchflusszytometrie eine wertvolle Methode dar, um pyroptotische Zellen von solchen zu unterscheiden, die andere Formen des Zelltods durchlaufen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig01.jpg"> Abbildung 1: Untersuchung von chGSDME-NT gebundenen Zellen mittels Durchflusszytometrie. DF-1-Zellen wurden bei einem MOI von 1 scheininfiziert oder mit IBDV infiziert. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet und mit Alexa Fluor 647-markiertem anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb oder Isotyp-Kontroll-IgG gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. chGSDME-NT-positive Färbung im Durchflusszytometrie-Assay zeigte die membrangebundenen chGSDME-NT-Zellen mit IBDV-induzierter Pyroptose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig02.jpg"> Abbildung 2: Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie mittels dualer Färbung mit chGSDME-NT und PI. (A) Dot-Plot-Analyse pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie. DF-1-Zellen wurden mit IBDV bei einem MOI von 1 infiziert. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet, mit Alexa Fluor 647-markiertem anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb und PI gefärbt und mit Durchflusszytometrie analysiert. (B) Der prozentuale Anteil pyroptotischer Zellen in jeder Gruppe in (A) wurde aufgetragen und statistisch analysiert. Zur Analyse der statistischen Signifikanz wurde eine bidirektionale ANOVA eingesetzt. Die Daten stellten drei unabhängige Experimente dar und wurden als Mittelwerte ± SD dargestellt. ***P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nach dualer Färbung mit Antikörpern gegen das N-terminale Fragment von Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI).

Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie

Pyroptosis is an inflammatory type of programmed cell death predominantly driven by the formation of plasma membrane pores by the N-terminus generated ...

examination-of-pyroptosis-by-flow-cytometry

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-basierte Methode zur T-Zell-Entwicklung zu...

Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

Dieses Video zeigt die Durchflusszytometrie zur Messung der Mikrogliaaufnahme von fluoreszierenden Biopartikeln nach intravitrealer Verabreichung in einem Mausauge. Die Durchflusszytometrie weist lebende Zellen nach, die CD11b exprimieren, und unterscheidet phagozytäre Mikrogliazellen mit grüner Fluoreszenz von anderen myeloischen Zellen, einschließlich Ly6C-exprimierender Monozyten und Ly6G-exprimierender Neutrophilen.

Messung der Mikrogliaaufnahme von intravitreal abgegebenen fluoreszierenden Partikeln mittels Durchflusszytometrie

Die Erzeugung eines orthotopischen Rattenmodell der pleuralen malignes Mesotheliom durch Implantation von II-45 Mesotheliomzellen in die Pleurahöhle von immunkompetenten Ratten dargestellt. Eine durchflusszytometrische Verfahren zu sieben Immunzelluntergruppen in diesen Tieren aus einem 25 &amp; mgr; l Blutprobe zu analysieren, wird ebenfalls beschrieben.

Orthotopen Implantation und der peripheren Immunzellenüberwachung in der II-45 Syngene Rat Mesotheliom Modell

Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Mikroglia Phagozytose ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und unzureichende phagozytischen Funktion hat in der Pathologie in Verbindung gebracht. Allerdings ist die Bewertung Mikroglia - Funktion in vivo technisch anspruchsvoll . Wir haben eine einfache, aber robuste Technik für die präzise Überwachung entwickelt und die phagozytische Potenzial von Mikroglia in einer physiologischen Umgebung zu quantifizieren.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Der Gesundheitszustand der Lunge spiegelt sich in der Art und Anzahl der Immunzellen, die in den Bronchiolen der Lunge vorhanden sind. Wir beschreiben eine bronchoalveoläre Lavagetechnik, die die Isolierung und Untersuchung von nichtadhärenten Zellen und löslichen Faktoren aus dem unteren Atemtrakt der Mäuse ermöglicht.

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Die Apoptose kann durch die durchflusszytometrische Analyse früher und später apoptotischer Biomarker charakterisiert werden. Die Zelllinie des Gebärmutterhalskrebses, SiHa, wurde nach Behandlung mit Actinomycin D mit einem Benchtop-Durchflusszytometer auf Apoptose-Biomarker untersucht.

Durchflusszytometrische Analyse von apoptotischen Biomarkern in Actinomycin-D-behandelten SiHa-Gebärmutterhalskrebszellen

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Dissoziation von Sputum in eine einzelne Zellsuspension und die anschließende Charakterisierung zellulärer Untergruppen auf Standard-Durchflusszytometrieplattformen.

Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie

Der Gehalt an Lipidhydroperoxid ist der am häufigsten verwendete Indikator für den feroptotischen Zelltod. Dieser Artikel zeigt die Schritt-für-Schritt-Durchflusszytometrie-Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in Zellen nach Ferroptose-Induktion.

Entschlüsselung des ferroptotischen Phänotyps des Medulloblastoms

Erfahren Sie, wie Sie Pyroptose in aviären Zellen mittels Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit Antikörpern gegen chGSDME-NT und Propidiumiodid identifizieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Quantifizierung pyroptotischer Zellen.

Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie

Weitere Videos entdecken