Name: In vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Lernen Sie die in vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus bei frei beweglichen Mäusen. Diese Methode kombiniert Virusinjektion und GRIN-Linsen-Implantation für präzise neuronale Aktivitätsstudien.

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Diese Arbeit wird unterstützt durch das Shanghai Pilot Program for Basic Research - Fudan University 21TQ1400100 (22TQ019), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project, das Lingang Laboratory (Förder-Nr. LG-QS-202203-09) und National Natural Science Foundation of China (32371036).

Echtzeit-Bildgebung der Neuronenaktivität in dentaten Gyruszellen von Mäusen 

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

In dieser Arbeit wurde ein Verfahren zur in vivo Calcium-Bildgebung in der DG von Mäusen beschrieben. Wir glauben, dass dieses Protokoll für Forscher nützlich sein wird, die DG-Funktionen in verschiedenen kognitiven Prozessen untersuchen wollen, insbesondere in Fällen, in denen eine genetisch identifizierte Subpopulation von Interesse ist. Hier erläutern wir die Vorteile unseres Protokolls, betonen einige wichtige Punkte in der Chirurgie und diskutieren die Grenzen dieser Methode.
Wir haben verschiedene Verfahren für die DG-Bildgebung aus der verfügbaren Literatur getestet und die experimentellen Verfahren, wie in diesem Protokoll beschrieben, optimiert. Unserer Meinung nach haben die folgenden drei wichtigen Änderungen die Erfolgsquote unseres Protokolls erheblich verbessert. Zunächst kombinierten wir alle chirurgischen Eingriffe in einer Sitzung, während viele Calcium-Bildgebungsstudien für subkortikale Regionen die Virusinjektion und die Linsenimplantation in zwei separaten Operationen durchführten. Ein wesentlicher Vorteil unseres Ansatzes besteht darin, dass die Virusexpression und die Wiederherstellung des Hirngewebes nun im gleichen Zeitraum stattfinden, wodurch die Wartezeit für die Vorbereitung der Maus, die normalerweise Monate dauert, um die Hälfte verkürztwird 21. Darüber hinaus erfordern separate Operationen eine genaue Neupositionierung der Maus, da leichte Neigungen mit einer Fehlanpassung im Bereich von 100 μm zum Scheitern des Eingriffs führen. Um ein Verlegen der Linse zu vermeiden, entwickelten einige Gruppen einen Ansatz, bei dem das Miniskop an der Linse befestigt wird, und versuchten, die neuronale Expression des Sensors während der Implantation zu betrachten. Diese Problemumgehung erfordert eine nicht triviale Entwicklung der häufig verwendeten stereotaktischen Apparatur und ist aufgrund der Unterdrückung der Neuronenaktivitäten während der Anästhesie komplex zu bedienen. Unsere Methode erfordert keine Neupositionierung der Maus, wodurch der mit dem Eingriff verbundene Zeit- und Stressaufwand erheblich reduziert wird.
Der zweite wichtige Punkt unseres Ansatzes ist, dass wir immer wieder kleine Mengen des Virus in den Zielbereichinjizieren 22. Dies führt dazu, dass mehr Zellen infiziert werden. Wichtig ist, dass dieser Ansatz im Vergleich zur Erhöhung der Viruslast an einer einzigen Injektionsstelle zu besseren Ergebnissen führte, da sich die Positionen der infizierten Zellen gleichmäßig über das Sichtfeld verteilten. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Verdünnung des Virustiters die Qualität der Kalziumbildgebung verbessert. Unserer Erfahrung nach ist eine übermäßige Menge an Viren mit dem Auftreten wellenartiger Häufungen von Aktivitäten verbunden, was mit einem früheren Berichtübereinstimmt 23. Während wir zunächst vermuteten, dass die Gewebeaspiration zu einer vorzeitigen Clearance des Virus an der Injektionsstelle und einer unzureichenden Expression führen könnte, beobachteten wir ein solches Phänomen nicht, und unser Protokoll ergab im Allgemeinen eine robuste Infektion der Zielregion. Im Vergleich zu transgenen Mäusen, die GCaMP exprimieren, ist der Virusansatz zwangsläufig weniger konsistent, bietet aber einen flexibleren Einsatz, da er keine komplizierte Zucht erfordert. Da die Expression des GCaMP jedoch in benachbarte Hirnstrukturen übergreifen oder in der Zielhirnregion ungleichmäßig verteilt werden kann, ist eine sorgfältige Untersuchung der anatomischen Positionen von Virus und Linse aus dem fixierten Gewebe entscheidend für die Interpretation der Ergebnisse. Die Kombination von regions- oder zelltypspezifischen Cre-Linien mit Cre-abhängiger GCaMP-Expression könnte die Spezifität der abgebildeten Signale verbessern.
Der dritte wichtige Punkt unseres Protokolls ist, dass wir während der Implantation der Linse das Einsetzen und Spülen der Linse mehrmals wiederholt haben, um sicherzustellen, dass sich keine Blutreste im Implantationsbereich befinden. Dies ist eine wichtige Operation, um die Gewebewiederherstellung zu erleichtern und die Erfolgsrate des Eingriffs zu verbessern. Obwohl der genaue Mechanismus nicht bekannt ist, spekulieren wir, dass das Einsetzen der Linse unweigerlich zu einer gewissen Schädigung des Gewebes führen wird, und der Spülschritt würde die mit dieser Schädigung verbundene Blutung beseitigen. Andernfalls kann es lange dauern, bis sich die insertionsassoziierte Blutung im Gehirn gebildet hat, was die Wahrscheinlichkeit einer lokalen Entzündung und einer Makrophageninfiltration erhöht, was beides die optische Qualität verringern würde. Darüber hinaus haben wir bei den Koordinaten, die wir in diesem Protokoll angegeben haben, festgestellt, dass das Platzieren der Linse etwas näher an der sagittalen Naht in der Regel zu einer erhöhten Anzahl sichtbarer Zellen führt, obwohl es wichtig ist, ein Durchstechen in den dritten Ventrikel zu vermeiden. Wir haben auch eine Liste häufiger Probleme zur besseren Fehlerbehebung dieses Schritts bereitgestellt (Tabelle 1).
Die Maus muss vor Verhaltensexperimenten darauf trainiert werden, das Dummy-Miniskop zu tragen, um die Auswirkungen des zusätzlichen Gewichts auf den Kopf zu minimieren. In der Regel findet dieses Training ~3 Tage statt, wobei jede Sitzung 20 Minuten dauert. Während der Verhaltensexperimente sollte der körperliche Zustand der Maus regelmäßig überwacht werden. Die Verhaltensleistung der Maus wird stark von ihrer Gesundheit beeinflusst.
Dieses Protokoll enthält mehrere Einschränkungen. Zunächst ist zu beachten, dass die Kalziumbildgebung ein Surrogat der neuronalen Aktivität ist, die durch die Expression der Sensoren beeinflusst werden kann. Die Ein-Photonen-Bildgebungsverfahren mit einem Miniskop können zu überlappenden Signalen aus benachbarten Zellen führen, die bei der anschließenden Analyse entmischt werden müssen. Darüber hinaus beinhaltet unser Protokoll invasive Operationen. Während des Schritts der GRIN-Linsenimplantation wird ein Stück Hirngewebe entfernt, das in der Regel einen Teil der CA1-Region, des retrosplenialen Kortex und des assoziativen visuellen Kortex umfasst. Dies ist aufgrund der Begrenzung der Abbildungstiefe durch die Ein-Photonen-Beleuchtung erforderlich. In unseren Beobachtungen konnten wir bei den Mäusen nach dem chirurgischen Eingriff keine offensichtlichen Verhaltensdefizite feststellen, weder in ihrem allgemeinen, uneingeschränkten Verhalten noch im Erlernen der linearen Bahnaufgaben (Ergänzende Abbildung S1). Alternativ kann die Verwendung automatisierter chirurgischer Instrumente zur Absaugung von Hirngewebe die mit der manuellen Bedienung verbundenen Fehler verringern und dadurch die Präzision des chirurgischen Eingriffserhöhen 24. Darüber hinaus ergaben unsere Calcium-Imaging-Daten im Allgemeinen eine normale Calciumdynamik. Die Wirkung auf komplexere kognitive Funktionen muss weiter charakterisiert werden. Eine alternative Methode zur Linseninsertion ohne Gewebeaspiration wurde vor25 beschrieben. Dies wird erreicht, indem ein Schnitt in das Hirngewebe entlang des vorgesehenen Insertionstrakts gemacht und die Linse direkt durch die Öffnung platziert wird. Unserer Erfahrung nach führt dieser Ansatz zu Falten oder anderen Verformungen des Hirngewebes entlang des Insertionstraktes, die dennoch invasiv sein können. Die hohe Variabilität der Verformung macht diesen Ansatz weniger zuverlässig als das von uns beschriebene Protokoll. Ein weiterer potenzieller Nachteil unseres Protokolls besteht darin, dass die Verhaltensleistung der Maus durch das Koaxialkabel, das das Miniskop und die Miniskop-Datenerfassungsbox verbindet, leicht beeinträchtigt wird. Das liegt nicht nur daran, dass sich die Drähte nach zahlreichen Umdrehungen zusammenwickeln, sondern auch daran, dass der Draht während der Aufgabe ein Ablenkungsfaktor für die Maus sein kann. Die Verwendung eines drahtlosen Miniskops26 würde dieses Problem effektiv lösen. 
Trotz der bestehenden Einschränkungen glauben wir, dass diese Methodik für Forscher, die an der In-vivo-Kalziumbildgebung zur Untersuchung neuronaler Aktivitätsmuster im Gyrus dentatus des Hippocampus interessiert sind, von großem Nutzen sein kann. Zum Beispiel kann dieser in vivo Calcium-Imaging-Ansatz angewendet werden, um Ortszellen spezifisch innerhalb der Region des Gyrus dentatus zu untersuchen. Dies würde es ermöglichen zu erforschen, wie Ortszellen Informationen über verschiedene Gehirnareale hinweg kodieren10,27. Unsere Validierung zeigt, dass dieses Protokoll einigermaßen reproduzierbar ist, hohe Erfolgsraten aufweist und auf verschiedene Gehirnregionen angewendet werden kann.

Frühere Studien haben gezeigt, dass der Hippocampus eine Gehirnstruktur ist, die für die Verarbeitung und den Abruf von Erinnerungen unerlässlich ist 1,2. Seit den 1950er Jahren stehen die neuronalen Schaltkreise des Hippocampus bei Nagetieren im Mittelpunkt der Erforschung der Gedächtnisbildung, -speicherung und -abfrage3. Zu den anatomischen Strukturen innerhalb des Hippocampus gehören die Subregionen Gyrus dentatus (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 und Subiculum4. Zwischen diesen Subregionen bestehen komplexe bidirektionale Verbindungen, von denen DG, CA1 und CA3 einen prominenten trisynaptischen Schaltkreis bilden, der aus Körnerzellen und Pyramidenzellenbesteht 5. Dieser Schaltkreis erhält seinen primären Input vom entorhinalen Kortex (EC) und ist ein klassisches Modell für die Untersuchung der synaptischen Plastizität. Frühere in vivo-Forschungen zur Funktion des Hippocampus konzentrierten sich aufgrund des leichteren Zugangs hauptsächlich auf das CA1 6,7. Während CA1-Neuronen eine wichtige Rolle bei der Gedächtnisbildung, -konsolidierung und -abfrage spielen, insbesondere in Ortszellen für das räumliche Gedächtnis, sind auch andere Subregionen des Hippocampus von entscheidender Bedeutung 8,9. Neuere Studien haben insbesondere die Funktionen von DG bei der Gedächtnisbildung hervorgehoben. Es wurde berichtet, dass Ortszellen in DG stabiler sind als solche in CA110, und ihre Aktivitäten spiegeln kontextspezifische Informationenwider 11. Darüber hinaus kann die aktivitätsabhängige Markierung von DG-Körnerzellen reaktiviert werden, um gedächtnisbezogene Verhaltensweisen zu induzieren12. Um ein tieferes Verständnis der Informationskodierung in DG zu erlangen, ist es daher von entscheidender Bedeutung, die Aktivitäten der DG-Subregion zu untersuchen, während das Tier gedächtnisabhängige Aufgaben ausführt.
Frühere Studien zu den Tätigkeiten der GD haben sich hauptsächlich auf die In-vivo-Elektrophysiologie gestützt13. Diese Technik hat jedoch einige Nachteile: Erstens kann es bei elektrischen Aufzeichnungen schwierig sein, die verschiedenen Zelltypen, die das Signal erzeugen, direkt zu identifizieren. Die aufgezeichneten Signale stammen sowohl von inhibitorischen als auch von exzitatorischen Zellen. Daher sind weitere Datenverarbeitungsmethoden erforderlich, um diese beiden Zelltypen zu trennen. Darüber hinaus ist es schwierig, andere Zelltypinformationen, wie z.B. projektionsspezifische Untergruppen oder aktivitätsabhängige Markierungen, mit elektrischen Aufzeichnungen zu kombinieren. Darüber hinaus werden die Aufzeichnungselektroden aufgrund der anatomischen Morphologie von DG oft in orthogonaler Richtung implantiert, was die Anzahl der Neuronen, die aufgezeichnet werden können, stark einschränkt. Daher ist es für elektrische Aufzeichnungen schwierig, Hunderte von einzelnen Neuronen aus der DG-Struktur im selben Tierzu überwachen 14.
Eine ergänzende Technik zur Aufzeichnung von Neuronenaktivitäten bei DG ist die Verwendung von In-vivo-Calcium-Bildgebung 15. Kalziumionen sind grundlegend für zelluläre Signalprozesse in Organismen und spielen eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen Funktionen, insbesondere im Nervensystem von Säugetieren. Wenn Neuronen aktiv sind, steigt die intrazelluläre Kalziumkonzentration schnell an, was die dynamische Natur der neuronalen Aktivität und Signalübertragung widerspiegelt. Daher liefert die Aufzeichnung der Echtzeit-Veränderungen des intrazellulären Kalziumspiegels in Neuronen wichtige Einblicke in die neuronalen Kodierungsmechanismen.
Die Calcium-Imaging-Technologie verwendet spezielle Fluoreszenzfarbstoffe oder gentechnisch hergestellte Calcium-Indikatoren (GECIs), um die Calciumionenkonzentrationen in Neuronen zu überwachen, indem Änderungen der Fluoreszenzintensität erkannt werden, die dann durch mikroskopische Bildgebung erfasst werden können16. Üblicherweise wird die GCaMP-Familie von Kalziumindikatorgenen verwendet, die grün fluoreszierendes Protein (GFP), Calmodulin und M13-Polypeptidsequenzen umfasst. GCaMP kann grüne Fluoreszenz emittieren, wenn es an Kalziumionenbindet 17, so dass die Fluktuationen der grünen Fluoreszenz mittels Bildgebungaufgezeichnet werden können 18. Um klare Bilder der Zielregion des Gehirns zu erhalten, wird in der Regel eine Gradientenindexlinse (GRIN-Linse) über der interessierenden Region implantiert. Die GRIN-Linse ermöglicht die Bildgebung der tiefen Hirnregion, die von der Oberfläche aus nicht direkt zugänglich ist.
Diese Technik lässt sich relativ einfach mit anderen genetischen Werkzeugen kombinieren, um verschiedene Zelltypen zu markieren. Da die Bildgebungsebene parallel zur Orientierung der Zellen in DG verläuft, sind bei jeder erfolgreichen Operation Hunderte von Neuronen für die Bildgebung zugänglich. In dieser Arbeit stellen wir ein vollständiges und detailliertes Operationsprotokoll für die in vivo Calciumbildgebung im Gyrus dentatus bei Mäusen vor (Abbildung 1). Das Verfahren umfasst zwei große Operationen. Die erste besteht darin, das AAV-CaMKIIα-GCaMP6f-Virus in die DG zu injizieren. Die zweite Operation besteht darin, eine GRIN-Linse über der Virusinjektionsstelle zu implantieren. Diese beiden Verfahren werden in derselben Sitzung durchgeführt. Nach der Genesung von diesen Operationen erfolgt im nächsten Schritt die Überprüfung der Bildqualität mit miniaturisierten Mikroskopen (Miniskopen). Wenn das Bildgebungsfeld Hunderte von aktiven Zellen aufweist, besteht das anschließende Verfahren darin, die Basisplatte des Miniskops mit Zahnzement auf dem Schädel der Maus zu befestigen. Die Maus kann dann für bildgebende Experimente verwendet werden. Wir stellen auch eine MATLAB-basierte Preprocessing-Pipeline vor, um die Analyse der gesammelten Kalziumdaten zu rationalisieren.

<table><tbody><tr><td>200 &mu; L Universal-Pipettenspitzen</td><td>Transcat Pipetten</td><td>1030-260-000-9</td><td>Zum Entfernen von Blut und Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>25 G Luer-Lock-Nadel stumpf (vorgeformte Dosierspitzen)</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Zum Entfernen des Gehirngewebes</td></tr><tr><td>3D-gedruckte Schutzkappe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zum Schutz der GRIN-Linse</td></tr><tr><td>75% Ethanol</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>Zur Desinfektion und Reinigung der GRIN-Linsenoberfläche</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&alpha;-GCaMP6f Virus</td><td>Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>Zur Virusinjektion</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 version 22.1</td><td>Zum Zeichnen von Figuren</td></tr><tr><td>Anästhesie-Luftpumpe</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-30</td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Kamerasteuerungssoftware</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>Zur Aufzeichnung der Verhaltensdaten</td></tr><tr><td>Kanülen-/Keramik-Ferrule-Halter (GRIN-Linsenhalter)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68214</td><td>Zur Aufnahme der GRIN-Linse</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>Zur Verringerung der postoperativen Schmerzen der Maus&nbsp;</td></tr><tr><td>Koaxialkabel</td><td>Open ephys</td><td>CW8251</td><td>Zum Verbinden des Miniskops und der Miniskop-Datenerfassungsbox</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus Life Science&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>Zur Betrachtung der Gehirnschnitte</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd</td><td>20202140438</td><td>Zur Desinfektion</td></tr><tr><td>Kundenspezifische Kopfplatte</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zum Halten der Maus auf dem</td></tr><tr><td>Laufrad Kundenspezifischer Kopfplattenhalter</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zum Halten der Kopfplatte der Maus</td></tr><tr><td>Prothesenbasis Materialien (selbsthärtend)</td><td>Neu Centry Dental</td><td>430205</td><td>Zum Anbringen des Miniskops</td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Veet</td><td>ASIN : B001DUUPQ0</td><td>Zum Entfernen der Haare der Maus</td></tr><tr><td>Desktop-Digital-Stereoinstrument, SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>Für die Virusinjektion und die Implantation von GRIN-Linsen</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Zur Vorbeugung von postoperativen Entzündungen der Maus</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Zur Beobachtung der Bedingungen bei Operationen</td></tr><tr><td>Gasfilterkanister, groß, 6er-Pack</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>GRIN-Linse</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>Für die Implantation von GRIN-Linse</td></tr><tr><td>GRIN-Linse</td><td>InFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>Für die Implantation von GRIN-Linsen</td></tr><tr><td>Induktionskammer-Maus (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>V100</td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Industriekamera</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Zur Erfassung der Verhaltensdaten</td></tr><tr><td>Iodophor Desinfektionsmittel</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Zur Desinfektion</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Flüssiges Probenentnahmeröhrchen (Glaskapillaren Mikropipette für Nanoject III)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Für die Virusinjektion</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Für die Analyse der Daten</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>78001</td><td>Für die Kraniotomie</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Zum Ziehen des flüssigen Probenentnahmeröhrchens</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Für die Virusinjektion</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Für die Aufzeichnung der Calcium-Bildgebungsdaten</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>Zur Erfassung der Calcium-Bildgebungsdaten</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>Für die In-vivo-Calcium-Bildgebung</td></tr><tr><td>Miniscope V4 Basisplatte (Variante 2)</td><td>Offene Ephys</td><td>Variante 2</td><td>Zum Halten des Miniskops</td></tr><tr><td>nanoject III Programmierbarer Nanoliter-Injektor</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Für die Virusinjektion</td></tr><tr><td>Ophthalmische Salbe</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., GmbH.</td><td>H37022025</td><td>Um die Augen feucht zu halten</td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Zur Isolierung des Virus</td></tr><tr><td>Personal Computer (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Zur Aufzeichnung von Calcium-Bildgebungsdaten und Verhaltensdaten</td></tr><tr><td>Laufrad</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Zum Halten der Maus beim Anbringen der Grundplatte</td></tr><tr><td>Schraubendreher (M1.6 Schrauben)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>60902</td><td>Zum Lösen der M1.6-Schrauben</td></tr><tr><td>Schraubendreher (Stellschrauben)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>S2</td><td>Zum Lösen der Stellschrauben Stellschraube</td></tr><tr><td></td><td>TBD</td><td>2-56 Konuspunkt-Stellschraube</td><td>Zum Befestigen des Miniskops an seiner Grundplatte</td></tr><tr><td>Anästhesiegerät für Kleintiere</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R500</td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Sterile Spritze</td><td>Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD</td><td>20163140236</td><td>Zum Spülen des Blutes</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>S14016-13</td><td>Zum Abschneiden von Haaren und Kopfhaut</td></tr><tr><td>ThermoStar Temperaturregler, 69025 Pad inkl.</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>69027</td><td>Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Tieres</td></tr><tr><td>Ultrafeine Pinzette</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>F11020-11</td><td>Zum Entfernen von Knochenresten und Dura</td></tr><tr><td>USB 3.0 Kabel</td><td>Offene Ephys</td><td>N/A</td><td>Zum Verbinden der Miniskop-Datenerfassungsbox und des Computers</td></tr><tr><td>UV-Licht</td><td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>Zur Befestigung der GRIN-Linse am Schädel</td></tr><tr><td>UV-Harz (lichthärtender Klebstoff)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>Zur Befestigung der GRIN-Linse am</td></tr><tr><td>Schädel Vakuumpumpe</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>Zur Entfernung von Blut, Kochsalzlösung und Hirngewebe</td></tr></tbody></table>

in vivo calcium-bildgebung von körnerzellen im gyrus dentatus des hippocampus bei mäusen 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Echtzeit-Ansätze werden in der Regel in Studien zu Lernen und Gedächtnis benötigt, und in vivo Calcium-Bildgebung bietet die Möglichkeit, die neuronale Aktivität bei wachen Tieren während Verhaltensaufgaben zu untersuchen. Da der Hippocampus eng mit dem episodischen und räumlichen Gedächtnis verbunden ist, ist er zu einer wesentlichen Hirnregion in der Forschung dieses Feldes geworden. In neueren Forschungen wurden Engrammzellen und Ortszellen untersucht, indem die neuronalen Aktivitäten in der hippokampalen CA1-Region mit dem Miniaturmikroskop bei Mäusen aufgezeichnet wurden, während sie Verhaltensaufgaben wie Open-Field- und Linear-Track durchführten. Obwohl der Gyrus dentatus eine weitere wichtige Region im Hippocampus ist, wurde er aufgrund seiner größeren Tiefe und Schwierigkeit der Bildgebung nur selten mit in vivo-Bildgebung untersucht. In diesem Protokoll stellen wir im Detail ein Calcium-Bildgebungsverfahren vor, einschließlich der Injektion des Virus, der Implantation einer GRIN-Linse (Gradientenindex) und des Anbringens einer Basisplatte zur Abbildung des Gyrus dentatus des Hippocampus. Wir beschreiben weiterhin, wie die Calcium-Imaging-Daten mit MATLAB vorverarbeitet werden können. Darüber hinaus können Studien an anderen tiefen Hirnregionen, die eine Bildgebung erfordern, von dieser Methode profitieren.

Abbildung 1 zeigt das Schema des experimentellen Ablaufs, einschließlich der Virusinjektion, der Implantation der GRIN-Linse, der Befestigung der Basisplatte, der in vivo Calcium-Bildgebung über ein Miniskop und der Datenverarbeitung. In der Regel dauert der gesamte Eingriff 1 Monat. Abbildung 2 zeigt beispielhafte Verfahren der Virusinjektion, einschließlich der Positionierung des Bohrlochs auf dem Schädel und des Zustands des Hirngewebes vor der Implantation der GRIN-Linse.
Abbildung 3 zeigt den Prozess der Entnahme des Hirngewebes, der für den Erfolg dieser Operation entscheidend ist. Je mehr Gewebe abgesaugt wird, desto sichtbarer werden verschiedene Gewebeschichten. Dieser Saugschritt kann gestoppt werden, sobald eine graue, reflektierende Schicht beobachtet wird.
Abbildung 4 zeigt den Ablauf der GRIN-Implantation, einschließlich des Einsetzens der GRIN-Linse, des Aufklebens der Kopfplatte auf den Schädel und des Abdeckens der GRIN-Linse mit einer individuellen Kappe. Die Bildqualität der in vivo Calcium-Bildgebung hängt vom Erfolg der Virusinjektion und der Implantation der GRIN-Linse ab.
Abbildung 5 zeigt vier Arten von Ergebnissen aus der in vivo Calcium-Bildgebung.Abbildung 5A ist das erfolglose Ergebnis; Im bildgebenden Sichtfeld wurden keine aktiven Zellen beobachtet. Abbildung 5B-D sind erfolgreiche Ergebnisse. Abbildung 5B hat weniger als 10 aktive Zellen, aber es gibt keine offensichtlichen Blutgefäße. Abbildung 5C hat mehr als 50 aktive Zellen und sichtbare Blutgefäße. In Abbildung 5D sind Hunderte von aktiven Zellen im Sichtfeld der Bildgebung zu sehen. Gleichzeitig beobachteten wir klare Blutgefäße. Hochwertige In-vivo-Kalzium-Bildgebung weist in der Regel Hunderte von aktivierten Zellen auf. Es wird angenommen, dass weniger als ein Dutzend aktivierter Zellen für die Bildgebung suboptimal sind. In der Regel korreliert die Anzahl der Zellen sowohl mit dem Durchmesser der GRIN-Linse als auch mit dem Teil der Gehirnregion. Ein größerer GRIN-Linsendurchmesser und eine nähere Hirnregion zur dorsalen Seite erhöhen die Wahrscheinlichkeit, aktivere Zellen zu beobachten. Es ist auch wichtig zu beachten, dass je größer der Durchmesser der GRIN-Linse ist, desto mehr Schaden richtet sie am Gehirn der Maus an. Daher ist die Auswahl der richtigen Größe entscheidend. Die Implantation einer GRIN-Linse mit einem Durchmesser von 1 mm hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit des Tieres, das lineare Fährtenverhalten zu erlernen (Ergänzende Abbildung S1).
Verhaltensdaten und Calcium-Imaging-Daten werden in der Regel getrennt verarbeitet. Mausverhaltensdaten können manuell gekennzeichnet oder mit Open-Source-Analysesoftware verarbeitet werden. Die Daten der Kalziumbildgebung werden mit Non-Rigid Motion Correction (NoRMCorre) und EXTRACT in MATLAB verarbeitet. Abbildung 6 zeigt die extrahierten Einzelzellen überlagert mit dem Sichtfeld und zeigt fünf repräsentative Calciumspuren aus einer erfolgreichen in vivo Calcium-Bildgebungsaufnahme. Siehe Ergänzendes Video S1 für ein repräsentatives Video der Rohdaten.
Die Überprüfung, ob die GRIN-Linsenimplantation und die Virusinjektion in der vorgesehenen Hirnregion stattfinden, ist der letzte Schritt und auch für die Interpretation der Daten sehr wichtig. Abbildung 7 ist ein Maushirnschnitt, der die Position der GCaMP6f-Expression (die grüne Fluoreszenzregion) und die Spur der GRIN-Linse zeigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> Abbildung 1: Diagramm der Verfahren der Virusinjektion und der Implantation der GRIN-Linse. (A) Injektion des AAV-CaMKIIα-GCaMP6f-Virus in den Gyrus dentatus. (B) Implantieren Sie die GRIN-Linse oberhalb des Gyrus dentatus. (C) Überprüfen Sie die Bildqualität nach der Operation. (D) Bringen Sie die Basisplatte des Miniskops nach der Überprüfung an. (E) Der Zeitplan und der Ablauf des gesamten Protokolls. Abkürzung: GRIN = Gradient Index. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative chirurgische Ansicht während der Virusinjektion. (A) Platzieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Gerät. (B) Markieren Sie den Implantationsbereich der GRIN-Linse (den schwarzen Bereich). (C) Kraniotomie im Zielbereich. (D) Injizieren Sie 240 nL Virus in den Gyrus dentatus. (E) Entfernen Sie die Mikropipette nach der Injektion. (F) Entfernen Sie die Hirnrinde und einen Teil des CA1-Gehirngewebes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative chirurgische Ansicht während der Aspiration des Hirngewebes. (A) Die vom schwarzen Marker umschlossene Region wird mit einem Mikrobohrer poliert, wobei (B) teilweise freiliegendes kortikales Gewebe zurückbleibt. Der linke Teil zeigt eine freiliegende Rinde und der rechte Teil ist von Dura und Schädelgewebe bedeckt. (C) Repräsentatives Bild während der Aspiration des kortikalen Hirngewebes. Das Gewebe bleibt blassrosa. (D) Die weiße Substanz ist im Sichtfeld sichtbar, wie durch den weißen Pfeil angezeigt. (E) Weiteres Absaugen ergab eine dunkelgrau-rote, reflektierende Oberfläche unter der weißen Substanz. Es wird angenommen, dass es sich bei dem Bereich (schwarzer Pfeil) um die CA1-Oberfläche handelt, und der Sog sollte nicht tiefer gehen. (F) Nach mehrmaligem Spülen mit Kochsalzlösung ist keine Blutung mehr aus dem Bereich sichtbar. In allen Panels kennzeichnen die Sternchen chirurgische Instrumente: eine 30 G stumpfe Nadel für Kochsalzlösung und eine 25 g stumpfe Nadel für die Aspiration von Hirngewebe. Maßstabsbalken = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> Abbildung 4: Ein Beispiel für die Implantation einer GRIN-Linse und die Befestigung der Basisplatte. (A) Implantieren Sie die GRIN-Linse mit Hilfe eines GRIN-Linsenhalters in das Hirngewebe. (B) Kleben Sie die GRIN-Linse an der richtigen Stelle mit UV-Harz auf; der reflektierende Teil stellt das UV-Harz dar. (C) Befestigen Sie die Kopfplatte mit UV-Harz am Mäuseschädel. (D) Decken Sie die GRIN-Linse mit einer 3D-gedruckten Schutzkappe ab. (E) Überprüfen Sie die Qualität der Operation. Das Miniskop wurde durch eine Halterung fixiert. (F) Tragen Sie die Prothesengrundmaterialien um die Basisplatte auf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> Abbildung 5: Erfolgreiche und erfolglose Bildgebungsergebnisse. (A) Erfolgloses Ergebnis der in vivo Calcium-Bildgebung. In A gibt es keine aktiven Zellen und mehrere Regionen weisen dunkle Blutflecken auf, wie durch die schwarzen Pfeile angezeigt. (B-D) Erfolgreiche Ergebnisse bei der In-vivo-Calcium-Bildgebung . (B) Es können weniger als 10 aktive Zellen beobachtet werden, aber keine signifikanten Blutgefäße im Bildgebungsfeld. (C) Es können mehr als 50 aktive Zellen und signifikante Blutgefäße beobachtet werden. (D) Hunderte von aktiven Zellen und bedeutendere Blutgefäße können beobachtet werden. Die gestrichelten Kreise stellen das Bildfeld dar. Die grünen Pfeile stellen die Zellen dar, die GCaMP6f exprimieren. Die roten Pfeile stellen die Blutgefäße dar. Maßstabsleisten = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative in vivo Calcium-Bildgebungsdaten einer Maus, die auf der linearen Spur läuft. (A) Das bildgebende Sichtfeld, das mit dem Miniskop aufgezeichnet wird, Gesamtzellenzahl = 227. (B) Repräsentative Kalziumspuren. Die Positionen der Zelle werden in der gleichen Farbe in A angezeigt. (C) Verhaltensaufgabe: Lineare Spur mit Wasserbelohnungen an beiden Enden. (D) Repräsentatives Ergebnis der Verhaltensanalyse der Aktivität der Maus; Gesamtzeit = 100 s. Blaue vertikale Linien zeigen Zeitpunkte des Leckenverhaltens an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> Abbildung 7: Hirngewebeschnitte von Mäusen nach der Operation. (A,B) Zwei Beispiele für Hirngewebe von Mäusen. Die gestrichelten rechteckigen Bereiche zeigen den Implantationsweg der GRIN-Linse an. Die gekrümmten Linien stellen den Gyrus dentatus im Hippocampus dar. Maßstabsbalken = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problem</td>
			<td>Mögliche Ursache</td>
			<td>Lösung</td>
		</tr><tr><td>Das Bildfeld wird dunkel oder schwarz angezeigt.</td>
			<td>Auf der Unterseite der GRIN-Linse befindet sich eine erhebliche Menge an Restblut.</td>
			<td>Vor der Implantation der GRIN-Linse wird mit der Kochsalzlösung die Oberfläche des Operationsfeldes kontinuierlich gespült, bis keine Blutungen mehr zu beobachten sind.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">In der Bildgebung sind deutlich sichtbare Blutgefäße vorhanden, aber keine neuronale Aktivität erkennbar.</td>
			<td>1. Die Virusexpression war suboptimal oder schlecht.</td>
			<td>1. Es wäre ratsam, Folgendes zu überprüfen:</td>
		</tr><tr><td>2. Die Lokalisation der beobachteten Virusexpression stimmt nicht mit der Position überein, an der die GRIN-Linse implantiert wurde (im Allgemeinen ist die Implantationsposition der GRIN-Linse im Vergleich zur gewünschten Stelle zu flach).</td>
			<td>ein. Stellen Sie sicher, dass die Lagerbedingungen für Viren angemessen sind.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. Vergewissern Sie sich, dass die Virusinjektionsstelle korrekt ist.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. Vergewissern Sie sich, dass die Viruskonzentration geeignet ist.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. Beim nächsten chirurgischen Eingriff kann die Tiefe der GRIN-Linsenimplantation entsprechend erhöht werden, und die genaue Tiefe sollte bei jedem Versuch sorgfältig aufgezeichnet werden.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Das Bildgebungsfeld zeigt einige regionale Muster der neuronalen Aktivität, aber es gibt keine deutlich sichtbare Aktivität auf der Ebene der einzelnen Zellen.</td>
			<td>1. Die Menge des injizierten Virus war übermäßig hoch.</td>
			<td>1. Verdünnen Sie das Virus oder reduzieren Sie das Volumen der Virusinjektion.</td>
		</tr><tr><td>2. Der Ort der Virusexpression stimmt nicht mit der Position der GRIN-Linse überein (typischerweise wird die GRIN-Linse in einer geringeren Tiefe als der optimalen Position für die Virusexpression implantiert).</td>
			<td>2. Beim nächsten chirurgischen Eingriff kann die Tiefe der GRIN-Linsenimplantation entsprechend erhöht werden, und die genaue Tiefe sollte bei jedem Versuch sorgfältig aufgezeichnet werden.</td>
		</tr><tr><td>Es gibt bestimmte Zellen innerhalb des Bildgebungsfeldes, die zu jeder Zeit ein gleichbleibend helles Fluoreszenzsignal aufrechterhalten, und es gibt keine Änderung in der Intensität dieser Fluoreszenz.</td>
			<td>Das Virus wird in einer einzelnen Zelle überexprimiert.</td>
			<td>Verdünnen Sie das Virus oder reduzieren Sie das Volumen der Virusinjektion.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Tabelle zur Fehlerbehebung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Normaler Erwerb der räumlichen Gedächtnisaufgabe durch Mäuse, die sich einer Operation unterzogen haben. Die Grafik zeigt die Quantifizierung der Anzahl der abgeschlossenen Versuche in der 20-minütigen Sitzung pro Tag. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. N = 3 Mäuse in der Gruppe ohne Operation und 4 in der Gruppe ohne Operation. Für den statistischen Vergleich wurde die bidirektionale ANOVA verwendet. Abkürzung: ns = nicht signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S1: Repräsentative Rohdaten der Calcium-Bildgebung in DG. Dieses Video zeigt die Kalziumaktivität über einen Zeitraum von 5 Minuten. Das Video wird mit dem 10-fachen der ursprünglichen Geschwindigkeit abgespielt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Das Design der Kopfplatte. Diese Datei zeigt die 2D-Zeichnung des Kopfplattendesigns. Bei der Herstellung der Kopfplatte wird Edelstahl nach Zeichnung geschnitten. Die beiden kleinen Löcher an der Seitenleiste sollten mit M1.6-Gewinden versehen werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Das Design der 3D-gedruckten Schutzkappe. Diese Datei enthält den gcode der Schutzkappenscheiben, die mit einem 3D-Drucker verwendet werden können. In diesem Protokoll haben wir Polymilchsäure-Kunststoff als Rohstoff für den Druck verwendet. Die kleinen Löcher an der Seite entsprechen den Positionen der Gewindebohrungen auf der Kopfplatte für die Installation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3: Die Konstruktion des Miniskophalters. Diese Datei enthält den gcode der Miniskop-Halterscheiben, die mit einem 3D-Drucker verwendet werden können. Das zylindrische Loch wird für den Einbau in einen stereotaktischen Halter mit einer M4-Schraube verwendet. Die Löcher an der Seite sind dazu gedacht, Schrauben zum Festziehen hinzuzufügen, aber der Halter kann auch ohne diese Funktion verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 4: Arduino-Steuercode und Skripte für die Vorverarbeitung von Rohkalzium-Imaging-Videos. Diese Datei enthält die Skripte zur Steuerung von Arduino und den Code zur Vorverarbeitung von Calcium-Imaging-Daten. Der Arduino-Code steuert das Verhalten, bei dem die Maus lernt, an abwechselnden Enden einer linearen Bahn nach Wasserbelohnungen zu lecken. Nach dem Erlernen der Aufgabe laufen die Mäuse immer wieder auf der Strecke hin und her. Der Vorverarbeitungscode für die Kalziumbildgebung führt eine Dateiformatkonvertierung, Bewegungskorrektur, räumliche Abtastung und Zellsignalextraktion aus den vom Miniskop gesammelten Daten durch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Der Gyrus dentatus des Hippocampus erfüllt wesentliche und unterschiedliche Funktionen beim Lernen und Gedächtnis. Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe robuster und effizienter Verfahren für die in vivo Calciumbildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus bei frei beweglichen Mäusen.

In vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus bei Mäusen 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können.

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

Quelle: Shannonhouse, J., et al. In vivo Kalzium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Spinalganglien. J. Vis. Exp. (2023). Das Video zeigt eine in vivo Calcium-Bildgebungstechnik zur Überwachung der neuronalen Aktivität in den Spinalganglien (DRG) einer transgenen Maus. DRG-Neuronen exprimieren einen Kalziumindikator, der die Fluoreszenzintensität bei Bindung an Kalzium erhöht. Mechanische oder thermische Reize, die auf eine Hinterpfote...

In vivo Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in den intakten Spinalwurzelganglien einer Maus

Quelle: Calvo-Rodríguez, {et al{. Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung von subzellulärem Ca2+ in gealterten Hippocampus-Neuronen. J. Vis. exp. (2015).  Dieses Video zeigt den Einsatz von Fluoreszenzbildgebung zur Messung des zytosolischen Kalziumspiegels in kurz- und langfristigen Hippocampuskulturen von Ratten. Durch den Vergleich junger und gealterter Neuronen wird hervorgehoben, wie eine erhöhte spannungsgesteuerte Kalziumkanaldichte vom L-Typ und eine verlängerte Aktivierung in...

In-vitro-Calcium-Bildgebung in Kurzzeit- und Langzeitkulturen des Hippocampus von Ratten

Quelle: Lee, H. et. al., Erfolgreiche In vivo Calcium-Bildgebung mit einem miniaturisierten Head-Mount-Mikroskop in der Amygdala einer sich frei verhaltenden Maus. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die In-vivo-Kalziumbildgebung bei einer Maus unter Verwendung einer GRIN-Linse (Gradient Refractive Index) und eines miniaturisierten Mikroskops. Der Aufbau kombiniert die Fixierung des Kopfes in einem reibungslosen mobilen Käfigsystem, stimuliert Neuronen und löst den Einstrom von Kalziumionen...

Mikroendoskopische Calcium-Bildgebung in Echtzeit in einer frei beweglichen Maus

Hier präsentieren wir, wie man das genikulierte Ganglion einer lebenden, betäubten Labormaus freilegt und wie man Kalziumbildgebung verwendet, um die Reaktionen von Ensembles dieser Neuronen auf Geschmacksreize zu messen, was mehrere Versuche mit verschiedenen Stimulanzien ermöglicht. Dies ermöglicht detaillierte Vergleiche, welche Neuronen auf welche Tastants reagieren.

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize

Wir präsentieren ein Protokoll, um das Hirnstamm der erwachsenen Maus von der ventralen Seite zu entlarven. Durch die Verwendung einer Gradienten-Refraktiven Indexlinse mit einem Miniaturmikroskop kann die Kalzium-Bildgebung verwendet werden, um die Aktivität von minderwertigen oliv-neuralen Somata nin vivo zu untersuchen.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung neuronaler Dynamik und Mikroschaltkreise in sich frei verhaltenden Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von Gehirnoperationen, um eine gute In-vivo-Kalziumbildgebung mit einem Miniskop zu erreichen.

Stereotaktische virale Injektion und Gradientenindex-Linsenimplantation für Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Das vorliegende Protokoll beschreibt in vivo Calcium-Bildgebung zur Messung der Reaktionen von Ensembles von lumbal-6 DRG-Neuronen auf somatische und viszerale Reize. Neuronen, die auf unterschiedliche Reize reagieren, lassen sich gründlich vergleichen. Dieses Protokoll ist wertvoll für die Untersuchung von Mechanismen des viszeralen Schmerzes und der somatischen Stimulation, wie z. B. der Akupunktur.

im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung der Reaktion von Neuronen der Spinalganglien auf somatische und viszerale Reize

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die GCaMP-Kalziumbildgebung von intakten Trigeminusganglien (TG)-Neuronen. Diese Beschreibung umfasst TG-Expositionsoperationen, konfokale In-vivo-Mikroskopie-Bildgebung von TG-Neuronen, Anwendung somatischer Stimuli während der mikroskopischen Bildgebung von TG-Neuronen und Analyse von in vivo GCaMP-Calcium-Bildgebungsdaten.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Lernen Sie die in vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus bei frei beweglichen Mäusen. Diese Methode kombiniert Virusinjektion und GRIN-Linsen-Implantation für präzise neuronale Aktivitätsstudien.

In vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus bei Mäusen

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