Name: Isolierung von retinalen Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung retinaler Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie. Diese Methode erlaubt die Untersuchung vaskulärer Veränderungen bei diabetischer Retinopathie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Eye Institute/NIH Grant R01EY028242 (an K.G.), Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (an K.G.), die Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant der W.M. Keck Foundation (an das Doheny Eye Institute) und das Ursula Mandel Fellowship und das UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (an I.S.T.). Diese Arbeit wurde auch durch einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, Inc. an die Abteilung für Augenheilkunde an der UCLA unterstützt. Der Inhalt dieses Artikels liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

Messung der Steifigkeit in retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen der Maus

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<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
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<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

AFM wird häufig zur Messung krankheitsassoziierter Veränderungen der Steifigkeit größerer Gefäße wie der Aorta und der Arterien eingesetzt16. Diese Erkenntnisse haben dazu beigetragen, die Rolle der endothelialen Mechanobiologie bei kardiovaskulären Komplikationen wie Atherosklerose zu etablieren17. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir begonnen, die bisher unerkannte Rolle der endothelialen Mechanobiologie bei der Entwicklung retinaler mikrovaskulärer Läsionen in der frühen DR zu untersuchen. Der Erfolg in diesem Bestreben hängt jedoch von der genauen Messung von diabetesinduzierten Veränderungen der retinalen Kapillarsteifigkeit ab. Neuere Studien haben gezeigt, dass ähnlich wie bei großen Gefäßen auch die Steifigkeit der retinalen Kapillaren und der retinalen EC-sezernierten subendothelialen Matrix mit dem AFM 4,5,6 direkt, genau und zuverlässig gemessen werden kann.
Bei diesem Ansatz werden retinale Kapillaren der Maus aus leicht fixierten Augen mittels Trypsinverdau isoliert. Erfahrungsgemäß ist dieser sanfte Fixationsschritt notwendig, da Kapillaren, die von nicht fixierten Augen isoliert wurden (mit der hypotonen Methode), brüchig sind und fragmentiert werden, was sie für die Messung der AFM-Steifigkeit ungeeignet macht4. Umgekehrt können eine stärkere Fixierung und die daraus resultierende Notwendigkeit eines ausgedehnten Trypsinverdaus, über den in anderen retinalen Trypsinverdauungsprotokollenberichtet wurde 18, auch die strukturelle Integrität der Kapillaren beeinträchtigen, wie durch die Störung der Tight Junctions beurteilt wird. So tragen die hier eingesetzte milde Kapillarfixierung und der schonende Trypsinaufschluss dazu bei, Steifigkeitsartefakte zu reduzieren, die durch übermäßige Formalin-induzierte Vernetzung entstehen, und die strukturelle Integrität der Kapillaren für eine zuverlässige AFM-Steifigkeitsmessung zu gewährleisten.
Als alternativer Ansatz wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie über die Messung der AFM-Steifigkeit von Netzhautkapillaren von leicht fixierten retinalen flachen Halterungen berichtet19. Durch die Durchführung von AFM-Krafteindrücken an retinalen Kapillaren innerhalb der intakten Netzhaut ermöglicht dieser Ansatz eine in situ Steifigkeitsmessung. Diese Messungen der Kapillarsteifigkeit umfassen jedoch wahrscheinlich die Steifigkeit der inneren Grenzmembran. Darüber hinaus ist dieser Ansatz auf die Messung nur oberflächlicher Kapillaren beschränkt, die auf einer retinalen flachen Halterung zugänglich sind, während der tiefer liegende Kapillarplexus, der in der frühen DR20 spezifisch betroffen ist, weggelassen wird. Diese Probleme können mit diesem Ansatz gelöst werden, bei dem die Gefäße sauber (frei von residualem Netzhautgewebe) aus allen Netzhautschichten extrahiert werden. Wir optimieren derzeit dieses Protokoll, um Aderhautgefäße aus Tiermodellen der frühen AMD zu isolieren. Wir sind uns jedoch bewusst, dass die milde Formalinfixierung, die im Protokoll verwendet wird, bei AFM-Messungen ein Vernetzungs-assoziiertes Versteifungsartefakt verursachen kann. Daher wäre es ratsam, die mit diesem Ansatz erhaltenen Gefäßsteifigkeitswerte eher als relative Änderungen der Steifigkeit (zwischen verschiedenen Versuchsgruppen) als als absolute Steifigkeit zu interpretieren.
Im Gegensatz zu retinalen Kapillaren, die eine milde Fixierung erfordern, kann die subendotheliale Matrix, die aus retinalen EC-Kulturen gewonnen wird, ohne Modifikation beurteilt werden. Dies ist vor allem auf die Robustheit der abgeschiedenen Matrix zurückzuführen, die sich aus einer Kombination mehrerer Faktoren ergibt, darunter die Zugabe von Ascorbinsäure im Kulturmedium (die die Kollagensynthese verbessert15), die chemische Modifikation von Glasdeckgläsern, die eine Matrixablösung während der Dezellularisierung verhindert, und die verlängerte Kulturdauer (10-15 Tage). Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass die Hyperglykämie-induzierte Zunahme der subendothelialen Matrixsteifigkeit in vitro mit der diabetesinduzierten Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit in vivo übereinstimmt 4. Dies ist nicht überraschend, da erwartet wird, dass eine Erhöhung der Matrixsteifigkeit die Steifigkeit der darüber liegenden retinalen ECs (aufgrund mechanischer Reziprozität) erhöht, was zusammen die Gesamtsteifigkeit der Kapillaren erhöht. Tatsächlich haben wir kürzlich gezeigt, dass retinale ECs steifer werden, wenn sie unter diabetischen Bedingungen gezüchtet werden4, wahrscheinlich durch einen Anstieg der Rho/ROCK-abhängigen Aktin-Zytoskelett-Spannung21. Diese Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die choroidale EC-Versteifung, die im Rhesusaffenmodell der frühen AMD beobachtet wurde, die erhöhte Steifigkeit der choroidalen subendothelialen Matrix und der intakten Gefäße widerspiegelt12, eine Idee, die in laufenden Studien getestet wird. Insgesamt bezeugt die Tatsache, dass Steifigkeitsveränderungen in der unfixierten retinalen subendothelialen Matrix und ECs den Trend widerspiegeln, der bei leicht fixierten intakten retinalen Gefäßen beobachtet wird, die Gültigkeit des milden Fixationsansatzes.
Die direkte Steifigkeitsmessung von retinalen Kapillaren aus Tiermodellen der DR trägt nicht nur dazu bei, die endotheliale Mechanobiologie als neues therapeutisches Ziel für das DR-Management zu etablieren, sondern bietet auch eine gute Grundlage für die Entwicklung neuer empfindlicher Bildgebungsverfahren zur nicht-invasiven Beurteilung der retinalen Kapillarsteifigkeit bei DR-Patienten in der Zukunft. Solche nicht-invasiven Techniken könnten möglicherweise subtile Veränderungen des Blutflusses erkennen, die sich voraussichtlich aus einer Kapillarversteifung ergeben, ähnlich wie die Veränderungen der arteriellen Pulswellengeschwindigkeit, die häufig bei diabetesinduzierten Herz-Kreislauf-Erkrankungen festgestellt werden. AFM-Steifigkeitsmessungen von Netzhautkapillaren, die aus postmortalen menschlichen Augen von diabetischen Spendern isoliert wurden, werden in dieser Hinsicht einen wichtigen Wirksamkeitsnachweis liefern. Angesichts der Tatsache, dass die retinale Kapillarsteifigkeit im Mausmodell (Streptozotocin) des Typ-1-Diabetes4 früh zunimmt, könnte der erfolgreiche Einsatz von AFM bei der Validierung von Bildgebungsmodalitäten zur Messung der Steifigkeit zur Identifizierung der retinalen Kapillarsteifigkeit als klinischer Biomarker für eine frühe DR-Pathogenese führen.

Netzhautkapillaren sind für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Sehfunktion der Netzhaut unerlässlich. Tatsächlich ist ihre Degeneration bei Diabetes im Frühstadium stark an der Entwicklung von sehkraftbedrohenden Komplikationen der diabetischen Retinopathie (DR) beteiligt, einer mikrovaskulären Erkrankung, von der fast 40 % aller Menschen mit Diabetes betroffensind 1. Vaskuläre Entzündungen tragen signifikant zur retinalen Kapillardegeneration bei DR bei. Frühere Studien haben gezeigt, dass aberrante molekulare und biochemische Signale bei Diabetes-induzierten retinalen Gefäßentzündungen eine wichtige Rolle spielen 2,3. Neuere Arbeiten haben jedoch ein neues Paradigma für die DR-Pathogenese eingeführt, das die Versteifung der retinalen Kapillaren als eine entscheidende, aber bisher unerkannte Determinante der retinalen Gefäßentzündung und -degeneration identifiziert 4,5,6.
Insbesondere wird die diabetesinduzierte Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit durch die Hochregulierung des Kollagenvernetzungsenzyms Lysyloxidase (LOX) in retinalen Endothelzellen (ECs) verursacht, das die subendotheliale Matrix (Basalmembran) versteift4,5,6. Die Matrixversteifung wiederum versteift die darüber liegenden retinalen ECs (aufgrund mechanischer Reziprozität), was zu einer allgemeinen Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit führt4. Entscheidend ist, dass diese diabetesinduzierte Kapillarversteifung der Netzhaut allein die Aktivierung der Netzhaut-EC und den entzündungsvermittelten EC-Tod fördern kann. Diese mechanische Regulation von retinalen EC-Defekten kann auf eine veränderte endotheliale Mechanotransduktion zurückgeführt werden, den Prozess, bei dem mechanische Signale in biochemische Signale umgewandelt werden, um eine biologische Reaktion hervorzurufen 7,8,9. Wichtig ist, dass veränderte mechanische EC-Signale und die subendotheliale Matrixstruktur auch mit der choroidalen Gefäßdegeneration in Verbindung mit der frühen altersbedingten Makuladegeneration (AMD) in Verbindung gebracht wurden10,11,12, was die breiteren Auswirkungen der vaskulären Mechanobiologie auf degenerative Netzhauterkrankungen belegt.
Bemerkenswert ist, dass eine Versteifung der retinalen Kapillaren früh bei Diabetes auftritt, was mit dem Auftreten einer Netzhautentzündung zusammenfällt. Daher kann die Zunahme der retinalen Kapillarsteifigkeit sowohl als therapeutisches Ziel als auch als früher diagnostischer Marker für DR dienen. Zu diesem Zweck ist es wichtig, zuverlässige und direkte Steifigkeitsmessungen der retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix zu erhalten. Dies kann durch die Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (Rasterkraftmikroskops) erreicht werden, das eine einzigartige, empfindliche, genaue und zuverlässige Technik zur direkten Messung der Steifigkeit von Zellen, extrazellulärer Matrix und Geweben bietet13. Ein AFM übt eine winzige Eindringkraft (Nanonewton) auf die Probe aus, deren Steifigkeit das Ausmaß bestimmt, in dem sich der eindrückende AFM auslegert – je steifer die Probe, desto mehr biegt sich der Cantilever, und umgekehrt. Wir haben AFM ausgiebig eingesetzt, um die Steifigkeit von kultivierten Endothelzellen, subendothelialen Matrizen und isolierten retinalen Kapillaren der Maus zu messen 4,5,6,11,12. Diese Messungen der AFM-Steifigkeit haben dazu beigetragen, die endotheliale Mechanobiologie als Schlüsseldeterminante der DR- und AMD-Pathogenese zu identifizieren. Um den Anwendungsbereich der Mechanobiologie in der Sehforschung zu erweitern, stellen wir hier eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung von AFM für Steifigkeitsmessungen von isolierten retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen der Maus zur Verfügung.

<table><tbody><tr><td><stark>Retinale Kapillarisolation</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; m PVDF-Spritzenfilter</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>Low Protein Binding Durapore</td></tr><tr><td>10X Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung ohne Calcium % Magnesium</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>Endkonzentration 1X, pH 7,4</td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Rnase-Dnase-frei, pyrogenfrei</td></tr><tr><td>20 mL Luer-Lok TIP Spritze</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 Zoll Einweg-Pipette aus Borosilikatglas/unsteril Pasteur-Pipette</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Gewebekulturschale</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL Pen</td><td>Wissenschaftliches Gerät Labor</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Klingenhalter</td><td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl #10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Zahnwachs</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>Endkonzentration 5% (v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - Wischtuch</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospatel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 Edelstahl 115mm&nbsp; Pinzette</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrastmikroskop</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ Klasse II, Typ A2 Biosicherheitswerkbank</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>AmScope</td><td>SM-3 Series Zoom Trinokulares Stereomikroskop 3,5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger für Mikroskopie - Weißer Lasche - Vorgereinigt - 25x75x1,0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015 Tris-Puffer</td><td></td></tr><tr><td>, 0,1 M Lösung, pH 7,4 - Biotechnologie</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 für Trypsinlösung</td></tr><tr><td>Trypsin 1:250 Pulver Gewebekulturqualität</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10 % (w/v) Trypsinlösung</td></tr><tr><td>Wasser Molekularbiologie</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Subendothelial Matrix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS mit Calcium und Magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen IV Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser aus Glas (12mm)</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd-Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Menschliche retinale Endothelzellen (HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131 medium</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>Retinale Endothelzellen der Maus (mREC)</td><td>Zellbiologika</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Wissenschaftlich</td><td> BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td><stark>AFM Messung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 & Mikro; m Sonde</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>Eine 19 μm hohe halbkugelförmige Sonde mit 1 μm Endradius, Federkonstante 0,25 N/m</td></tr><tr><td>70 nm LC-Sonde</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>Eine 19 μm hohe halbkugelförmige Sonde mit 70 nm Endradius, &nbsp; Federkonstante 0,1 N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; Kamera</td><td>XCAM Familie</td><td>Toupcam</td><td>1080P HDMI</td></tr><tr><td>Desktop zum Ausführen der Kamera</td><td>Asus</td><td>Asus Desktop</td><td>Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM</td></tr><tr><td>Schalenhalter für Deckglas</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm Glasbodenschale mit &nbsp; 14 mm Mikrotopf</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>Bioscience Rasterkraftmikroskop montiert auf einem optischen Mikroskop zur sensitiven Messung der mechanostrukturellen Eigenschaften (Steifigkeit und Topographie) von weichen biologischen Proben</td></tr><tr><td>Phasenkontrast-Mikrofon</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>Inverses Mikroskop mit 10X Objektiv</td></tr></tbody></table>

isolierung von retinalen kapillaren und subendothelialer matrix der maus zur steifigkeitsmessung mittels rasterkraftmikroskopie

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

Die retinale Kapillardegeneration ist ein klinisches Kennzeichen der frühen Stadien der diabetischen Retinopathie (DR). Unsere jüngsten Studien haben gezeigt, dass die diabetesinduzierte retinale Kapillarversteifung eine entscheidende und bisher unerkannte kausale Rolle bei der entzündungsvermittelten Degeneration der retinalen Kapillaren spielt. Die Zunahme der Steifigkeit der retinalen Kapillaren resultiert aus der Überexpression von Lysyloxidase, einem Enzym, das die subendotheliale Matrix vernetzt und versteift. Da davon ausgegangen wird, dass die Behandlung von DR im Frühstadium das Fortschreiten der DR und den damit verbundenen Sehverlust verhindert oder verlangsamt, stellen die subendotheliale Matrix und die Kapillarsteifigkeit relevante und neuartige therapeutische Ziele für die frühe DR-Behandlung dar. Darüber hinaus kann die direkte Messung der retinalen Kapillarsteifigkeit als entscheidender präklinischer Validierungsschritt für die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren zur nicht-invasiven Beurteilung der retinalen Kapillarsteifigkeit bei Tieren und Menschen dienen. Vor diesem Hintergrund stellen wir hier ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Steifigkeitsmessung von retinalen Kapillaren und subendothelialen Matrizen der Maus mittels Rasterkraftmikroskopie zur Verfügung.

Netzhautkapillaren der Maus Die Messung der AFM-Steifigkeit isolierter Netzhautkapillaren umfasst Schritte bei der Probenhandhabung, die möglicherweise ihre mechanostrukturelle Integrität beeinträchtigen könnten. Um dies zu verhindern und damit die Durchführbarkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von AFM-Messungen zu gewährleisten, werden die enukleierten Augen vor der Gefäßisolierung über Nacht bei 4 °C in 5 % Formalin fixiert. Dieses milde Fixierungsprotokoll mit reduzierter Formalinkonzentration, niedriger Fixierungstemperatur, begrenzter Fixierungszeit und fehlender Hornhautpunktion wurde entwickelt, um mögliche Vernetzungs-/Versteifungsartefakte, die durch chemische Fixierung verursacht werden, zu minimieren. Wie in Abbildung 2B,C gezeigt, stellt diese relativ milde Fixierung sicher, dass das isolierte retinale Gefäßsystem strukturell robust und ausreichend langlebig für die AFM-Messung ist. Im Gegensatz dazu werden retinale Gefäße, die aus nicht fixierten Augen (mit der hypotonen Methode)4 oder kurzzeitig fixierten Augen (für 8 h) isoliert wurden, fragmentiert oder kollabieren, wodurch sie für die AFM-Messung ungeeignet sind (Abbildung 2B).
Retinale subendotheliale Matrix Die Gefäßsteifigkeit spiegelt die kombinierte Steifigkeit der Gefäßzellen und der Basalmembran (subendotheliale Matrix) wider4. Da sich Zellen an die Matrixsteifigkeit anpassen, indem sie eine ähnliche Änderung ihrer eigenen Steifigkeit erfahren, wird ein Prozess, der als mechanische Reziprozität9 bezeichnet wird, die subendotheliale Matrixsteifigkeit, zu einer wichtigen Determinante für die gesamte Gefäßsteifigkeit. Für die Messung der Matrixsteifigkeit ist es wichtig, eine homogen dichte subendotheliale Matrix zu erhalten. Bei humanen retinalen ECs, die in ascorbinsäure-supplementiertem Kulturmedium gezüchtet werden, dauert dies in der Regel 10-15 Tage (Abbildung 3A)4,5,6. Dieser Unterschied in der Kulturperiode kann auf Chargenunterschiede bei kommerziell erhältlichen primären retinalen ECs zurückzuführen sein. Darüber hinaus stellen wir im Allgemeinen fest, dass kommerziell erhältliche retinale ECs von C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu primären humanen retinalen EC-Kulturen eine dichtere Matrix ablagern, was auf speziesspezifische Unterschiede hinweist. Wie in Abbildung 3A gezeigt, bieten Phasenkontrastbilder nur eine grobe Ansicht der Matrix auf Makroebene. Die feinere nano- bis mikroskalige fibrilläre Struktur wird jedoch in hochauflösenden konfokalen Fluoreszenzbildern der mit Antikörpern gegen die Matrixstrukturproteine Kollagen IV und Fibronektin immunmarkierten Matrix deutlich (Abbildung 3B). Es sollte beachtet werden, dass diese Matrixproteine auch lehrreiche Hinweise für Endothelzellen liefern, indem sie an spezifische Integrinrezeptoren binden9.
Messung der AFM-Steifigkeit Die Auswahl der geeigneten Cantilever-Steifigkeit (Federkonstante, k) und Sondenabmessung ist für zuverlässige und empfindliche Messungen unerlässlich. Diese Parameter sollten so gewählt werden, dass sie der Steifigkeit und den Abmessungen der biologischen Probe entsprechen. Nachdem der ausgewählte Ausleger auf dem AFM montiert wurde, muss der Infrarot-Laserstrahl auf die Spitze des Auslegers fokussiert werden, und der reflektierte Laserpunkt muss auf dem Photodetektor zentriert werden. Diese Laserausrichtung gewährleistet eine präzise und empfindliche Detektion der Auslenkung und damit die Steifigkeitsmessung. Eine AFM-Steifigkeitsmessung beginnt damit, dass der Z-Piezo den Cantilever senkrecht nach unten in Richtung der Probe bewegt. Zu diesem Zeitpunkt gibt es keine Auslenkung des Auslegers, was zu einer flachen Grundlinie der Annäherungskurve führt (Abbildung 4A). Wenn die Cantilever-Sonde die Probe berührt und einkerbt, biegt sich der Cantilever, was zu einer Laserablenkung auf dem Photodetektor führt, die durch die vertikale Ablenkung der Annäherungskurve dargestellt wird. Nach dem Aufbringen einer voreingestellten Eindringkraft (Sollkraft) auf die Probe fährt der Ausleger in die Ausgangsposition (Z-Zielhöhe) von der Probe weg zurück. Die abgelenkte Rückzugskurve wird dann an das Hertz/Sneddon-Modell angepasst, um den Elastizitätsmodul (Steifigkeit) der Probe zu berechnen.
Aus der repräsentativen Krafteindringmessung, die in Abbildung 4 gezeigt wird, wird deutlich, dass die Annäherungs- und Retraktionskurven einer Netzhautkapillare, die von einer diabetischen Maus isoliert wurde (Abbildung 4B), wesentlich steiler sind als die einer nicht-diabetischen Maus (Abbildung 4A). Die steilere Steigung der Krafteindringkurven deutet auf eine größere Auslenkung des Auslegers hin, die durch einen höheren Widerstand der Probe gegen den Krafteindruck verursacht wird, was eine höhere Probensteifigkeitwiderspiegelt 13. Tatsächlich zeigte die anschließende Datenanalyse mehrerer Krafteindruckkurven, dass die retinalen Kapillaren der Maus bei Diabetes signifikant steifer werden4. Es sollte auch beachtet werden, dass der Kontakt zwischen der Cantilever-Sonde und biologischen Proben häufig eine unspezifische Oberflächenadhäsion verursacht, die zu einer negativen Cantilever-Auslenkung während der Retraktion führt, wie aus der Verlängerung der Retraktionskurve über die Basislinie hinaus zu sehen ist (Abbildung 4B). Darüber hinaus sind biologische Proben wie Zellen, Matrix und Blutgefäße von Natur aus viskoelastisch und können daher nach einer Krafteindringung eine bleibende Verformung und/oder Änderung der scheinbaren Steifigkeit erfahren. Wenn ja, spiegelt sich dies in der Fehlausrichtung von Anfahr- und Retraktionskurve (Hysterese) wider. In der Tat bestätigt der Vergleich von Abbildung 4A und Abbildung 4B den erwarteten Trend, bei dem die Krafteinkerbung weicherer Kapillaren bei nicht-diabetischen Mäusen eine größere Hysterese hervorruft als bei ihren steiferen Gegenstücken. Wie bereits berichtet 5,6, wird auch die Steifigkeit (Elastizitätsmodul) von subendothelialen Matrizen, die aus retinalen EC-Kulturen gewonnen wurden, auf die oben genannte Weise berechnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Schnitts an einem Mausauge zur Netzhautisolierung. Mit einer Pinzette, um den Sehnerv zu halten, wird mit einem Skalpell ein vollständiger Schnitt hinter dem Limbus vorgenommen, um die Netzhaut der Maus von der Linse und der Vorderkammer zu trennen. Die violette gestrichelte Linie zeigt die Position des vertikalen Schnitts. Dieses Schema wurde mit einer wissenschaftlichen Bild- und Illustrationssoftware gezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg"> Abbildung 2: Protokolloptimierung für die Isolierung intakter Maus-Netzhautgefäße für die AFM-Messung. (A) Das Stereoskopbild zeigt eine intakte Netzhaut, die vor den Kapillarisolationsschritten aus einem leicht fixierten Mausauge isoliert wurde. Maßstabsbalken: 2 mm. (B) Repräsentative Phasenkontrastbilder bei 4-facher Vergrößerung zeigen retinale Gefäße der Maus, die mit den verschiedenen Isolationsmethoden gewonnen wurden. Beim Vergleich der strukturellen Integrität und Haltbarkeit der isolierten Gefäße zeigte sich, dass der Trypsinverdau von Netzhäuten aus enukleierten Augen, die 24 h lang bei 4 °C in 5 % Formalin fixiert waren (roter Kasten), das am besten geeignete retinale Gefäßsystem für die Messung der AFM-Steifigkeit ergab. Netzhautgefäße, die mit dieser Methode isoliert wurden, wiesen ein klares Gefäßnetz auf, das sich gleichmäßig entlang der Glasoberfläche ausbreitete. Maßstabsbalken: 500 μm. (C) Die Ansicht eines intakten retinalen Kapillarnetzwerks mit hoher Vergrößerung (20x), ähnlich dem in (B) gezeigten, bestätigt die hohe strukturelle Integrität von Kapillaren, die aus leicht fixierten Augen gewonnen werden. Maßstab: 100 μm. Diese Zahl wurde von4 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg"> Abbildung 3: Dezellularisierte Matrizen, die aus primären REC-Kulturen von Mensch und Maus gewonnen wurden. (A) Repräsentative Phasenkontrastbilder bei 20-facher Vergrößerung, die subendotheliale Matrixaggregate auf Glasdeckgläsern nach der Dezellularisierung von 10-Tage- (10 d) oder 15-Tage-(15 d) Kulturen von Human- oder Maus-RECs zeigen. Maßstabsbalken: 100 μm. (B) Repräsentative konfokale Fluoreszenzbilder mit hoher Vergrößerung (100x) von dezellularisierten Matrizen, die aus 15-Tage-Human-REC-Kulturen gewonnen und mit Anti-Kollagen-IV- und Anti-Fibronektin-Antikörpern markiert wurden, zeigen ein dichtes nanofibrilläres Kollagen IV und Fibronektinmatrix. Maßstab: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg"> Abbildung 4: Kraftabstandskurven aus der AFM-Steifigkeitsmessung von retinalen Kapillaren der Maus. Liniendiagramme zeigen eine repräsentative Annäherungs- (helle Farbe) und Retraktionskurve (dunkle Farbe) von einer einzelnen Krafteindruckmessung an einer Stelle einer Netzhautkapillare der Maus, die von einer (A) nichtdiabetischen oder (B) diabetischen Maus isoliert wurde. Die Kraftkurven, die mit einer halbkugelförmigen Cantilever-Sonde SAA-SPH mit einem Radius von 1 μm erhalten wurden, stellen die Beziehung zwischen dem Cantilever-Probenabstand (gesteuert durch den z-Piezo) und der aufgewendeten vertikalen Kraft dar, die die Cantilever-Ablenkung verursacht. (A) Der gelbe Pfeil zeigt die Z-Piezo-gesteuerte Cantilever-Annäherung an die Probe an, der weiße Pfeil zeigt den Kontaktpunkt an, an dem die Cantilever-Sonde mit der Probe in Kontakt kommt, und der grüne Pfeil zeigt die Cantilever-Auslenkung bis zu einer Soll-Eindringkraft (Spitze) (*) an. (B) Sowohl die Annäherungs- als auch die Retraktionskurve einer retinalen Kapillare, die von diabetischen Mäusen isoliert wurde, weisen eine deutlich steilere Steigung auf als die ihrer nicht-diabetischen Gegenstücke (siehe A), was auf eine höhere Kapillarsteifigkeit bei diabetischen Mäusen hinweist. Die Pfeilspitze zeigt eine Vertiefung der Rückzugskurve unter die Basislinie, die die negative Ablenkung der Cantilever-Sonde widerspiegelt, die durch die Adhäsion zwischen Sonde und Probe während des Eindrucks verursacht wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Vor kurzem haben wir die retinale Kapillarversteifung als neues Paradigma für retinale Dysfunktion im Zusammenhang mit Diabetes identifiziert. In diesem Protokoll werden die Schritte zur Isolierung von retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix aus retinalen Endothelkulturen erläutert, gefolgt von einer Beschreibung der Steifigkeitsmesstechnik mittels Rasterkraftmikroskopie.

Isolierung von retinalen Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie

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