Name: Anwendung von DNA-Barcoding zur Identifizierung von Heilpflanzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie DNA-Barcoding zur Authentifizierung von Heilpflanzen am Beispiel von Angelica sinensis. Diese Methode verbessert die Genauigkeit der Artenidentifizierung erheblich.

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<meta charset="utf8"></head><body>DNA-Barcoding für Heilpflanzen: Identifizierung und phylogenetische Analyse

<ol><li>Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+SL+%22Chin+Med%22">Chin Med</a>. 11, 37(2016).</li>
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<li>Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+species+in+the+aromatic+spice+family+apiaceae+using+DNA+mini-barcodes%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes.</a> Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).</li>
<li>Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+of+medicinal+plant+material+for+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding of medicinal plant material for identification.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Market+access+for+Chinese+herbal+medicinal+products+in+Europe-a+ten-year+review+of+relevant+products%2C+policies%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges.</a> Phytomedicine. 103, 154237(2022).</li>
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<li>Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authentication+of+medicinal+plants+using+molecular+biology+techniques+to+compliment+conventional+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods.</a> Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).</li>
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<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+its2+region+as+a+novel+DNA+barcode+for+identifying+medicinal+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species.</a> PLoS One. 5 (1), e8613(2010).</li>
<li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+%28its%29+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li>
<li>Raskoti, B. B., Ale, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+of+medicinal+orchids+in+asia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding of medicinal orchids in asia.</a> Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).</li>
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<li>Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+potential+DNA+barcode+its2+to+identify+herbal+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials.</a> J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).</li>
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<li>Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+authentication+of+the+poisonous+plant+Gelsemium+elegans+by+combining+filter-paper-based+DNA+extraction+and+rpa-lfd+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection.</a> Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).</li>
<li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+melting+curve+analysis+for+rapid%2C+sensitive%2C+and+discriminating+authentication+of+saffron+%28Crocus+sativus+l.%29+from+its+adulterants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants.</a> Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction Kit</td><td>Shanghai Huiling Biotechnology Co.</td><td>NG411M</td><td>Geeignet für die schnelle Extraktion hochwertiger genomischer DNA aus verschiedenen Geweben einer Vielzahl von Pflanzen</td></tr><tr><td>DL5000</td><td>DNA-Marker Nanjing vazyme Bio-technology Co.</td><td>MD102-02</td><td>Gebrauchsfertiges Produkt, nehmen Sie eine angemessene Menge dieses Produkts direkt zur Elektrophorese ein, wenn Sie das Gel laufen lassen.</td></tr><tr><td>Elektrophorese</td><td>Beijing Liuyi Biotechnologie Co.</td><td>DYY-6C</td><td>Nehmen Sie ein Touchscreen-Design an, können die eingestellte Spannung anzeigen, gleichzeitig den Strom einstellen, parallelen Ausgang</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>BeijingpsaitongBiotechnologyCo., Ltd</td><td>E70015-100G</td><td>Nuclear Isolation Buffer Formulation Reagenzien.</td></tr><tr><td>Goldview Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000 & mal;)</td><td>Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>10201ES03</td><td>Bei der Verwendung der Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis von DNA bindet sie an die DNA und erzeugt ein starkes Fluoreszenzsignal.</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Tischzentrifuge</td><td>Changsha High-Tech-Industrieentwicklungszone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.</td><td>H1650</td><td>Für die schnelle und effiziente Trennung von Proben bietet diese kompakte und leichte Zentrifuge zuverlässige Sicherheit</td></tr><tr><td>Hochdurchsatz-Tissue-Zerkleinerer</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co.</td><td>Tiss-48</td><td>Ein Hochfrequenz-Vibrationsinstrument zum Mahlen von Proben</td></tr><tr><td>http://www.gpgenome.com/</td> <td>Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics-Datenbank</td><td></td> <td>umfasst Genomsequenzen, Gensätze, Organellengenome, Genomdaten mit geringer Abdeckung und DNA-Barcode-Sequenzen.</td></tr><tr><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/</td> <td>U.S. National Library of Medicine</td> <td>-</td> <td>Das National Center for Biotechnology Information fördert Wissenschaft und Gesundheit, indem es Zugang zu biomedizinischen und genomischen Informationen bietet.</td></tr><tr><td>Kylin-Bell</td><td>Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.</td><td>VORTEX-5</td><td>Schnelles Mischen in Form eines Hochgeschwindigkeits-Vortex, Mischgeschwindigkeit, Gleichmäßigkeit, Gründlichkeit</td></tr><tr><td>LifeTouch</td><td>Hangzhou BORI Technology Co.</td><td>TC-96/G/H(b)B</td><td>Einführung einer fortschrittlichen thermoelektrischen Kältetechnologie und einer neu entwickelten TAS-Technologie zur Verbesserung der Gesamtleistung</td></tr><tr><td>Multifunktionales Gel-Bildanalysesystem</td><td>Southwest Operation Center von Shanghai Tianneng Life Science Co.</td><td>Tanon-Mini Space 2000</td><td>Führt schnelle Genamplifikationsexperimente mit einer Gradientenfunktion zur Kartierung von Amplifikationsbedingungen und einem Gradiententemperaturbereich von bis zu 30° durch; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Solarbio Science& Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.</td><td>S8210-100</td><td>Formulierungsreagenzien für nukleare Isolationspuffer.</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Genes GmbH</td><td>ND ONE</td><td>Quantifizieren Sie DNA-, RNA- und Proteinproben in Sekundenschnelle mit nur 1-2 & Mikro; L der Probe</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd</td><td>S30268-500g</td><td>Nuclear Isolation Buffer Formulation Reagenzien.</td></tr><tr><td>Schneeflocken-Eismaschine</td><td>Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.</td><td>ZX-60X</td><td>Übernahme der Rotationsextrusions-Eisherstellungsmethode, schnelle Eisherstellungsgeschwindigkeit und hohe Effizienz der Eisproduktion</td></tr><tr><td>Edelstahlperlen für den Gewebehomogenisator</td><td>Beyotime Biotechnology.</td><td>F6623</td><td>Ausrüstung zum Mahlen und Mischen von Gewebe- und anderen Proben durch Vibration</td></tr><tr><td>Trisacetat-EDTA-Puffer</td><td>Beyotime Biotech Inc</td><td>ST716</td><td>TAE ist ein häufig verwendeter Puffer für die DNA-Elektrophorese, der häufig in der Agarose-Gelelektrophorese eingesetzt wird.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Beijing Solarbio Science& Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.</td><td>T8230</td><td>Reagenzien für die Formulierung von Kernisolationspuffern.</td></tr><tr><td>Wasserkocher für Wasserbad</td><td>Shanghai Senxin Experimental Instrument Co.</td><td>DK-8D</td><td>Präzise Thermostat- und Temperaturregelung, genaue und zuverlässige Temperaturregelung</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Shanghai Eon Chemical Technology Co.</td><td>R054186-100ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Reagenzien für die Formulierung von Nuklearisolationspuffern.</td></tr></tbody></table>

anwendung von dna-barcoding zur identifizierung von heilpflanzen

Application of DNA Barcoding to Identify Medicinal Plants

DNA-Qualität der Probe
Der Bereich der OD260/OD280-Absorptionsverhältnisse lag zwischen 1,80 und 1,84. Die mit dem Spektralphotometer gemessene DNA-Menge für jede Probe betrug mehr als 100 ng/μl (Tabelle 3), was auf eine gute Qualität der DNA-Extraktion der Probe hinweist. Dies deutet darauf hin, dass die Proben während des Extraktionsprozesses nicht durch Proteine, RNA oder Reagenzien kontaminiert wurden und dass sie von guter Qualität und für die nachgelagerte PCR-Amplifikation geeignet waren.
PCR-Analyse
Die Gelelektrophorese wurde an dem PCR-Produkt der drei parallelen experimentellen Proben durchgeführt. Der Aufbau war: Marker, Proben 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3) und Negativkontrolle (0), wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Größen von AS-1, AS-2 und AS-3 liegen alle zwischen 500 bp mit einzelnen, hellen, klaren Banden, und es gibt keine Banden in der 0, was darauf hindeutet, dass die extrahierte DNA mit ITS2-Primern auf 500 bp amplifiziert wurde.
Datenbankvergleich von Sequenzierungsergebnissen
Die Sequenzierungsergebnisse identifizierten A. sinensis mit einer 100%igen Sequenzähnlichkeit, indem die BLAST-Identifizierungsergebnisse der NCBI-Datenbank kombiniert wurden, die mit den Ergebnissen der Artbestimmung der GPGD-Datenbank übereinstimmen (Tabelle 4). Das BLAST-Ergebnis wurde anhand des höchsten prozentualen Identitätswerts und des niedrigsten E-Werts ermittelt. Die Artenbestimmung galt als erfolgreich, wenn die höchste maximale prozentuale Identität eine einzelne Art umfasste und &gt;99 % erreichte. Wenn ein Score ≤ 99 % liegt, überprüfen Sie die Qualität der Sequenzierungsdatei oder ob das PCR-Produkt kontaminiert ist.
Phylogenetische baumbasierte Analyse der Artbestimmung
Die Ergebnisse zeigten, dass in dem konstruierten NJ-Phylogenetenstammbaum alle vier Arten in separaten Kladen geclustert waren und die P. praeruptorum als Außengruppe von den Angelica-Kladen getrennt wurde. Die Spleißsequenzen wurden mit der A . sinensis OR879715.1-Klade geclustert, und der Kladenstützwert (Bootstrap) betrug 100, und dann wurden die beiden anderen Arten, A. dahurica und A. cartilaginomarginata , jeweils in einer separaten Klade geclustert, was beweist, dass es sich bei den Spleißsequenzen um A. sinensis handelte (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66925/66925fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm zur Identifizierung von Arzneipflanzenarten. (A) Prozesspflanze, Extraktions-DNA und Sequenzierung von Heilpflanzen, (B) Vergleich der Artensequenz anhand von Datenbanken und (C) Verwendung phylogenetischer Bäume zur taxonomischen Validierung, um die phylogenetischen Beziehungen zwischen den Arten zu bestätigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66925/66925fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66925/66925fig02.jpg"> Abbildung 2: Arbeitsablauf bei der Extraktion von Arzneipflanzen-DNA. (A) Bei der Extraktion von DNA aus Heilpflanzen sind insgesamt 6 Schritte erforderlich. (B) Amplifikation von PCR-Instrumenten und PCR-Zyklusprozess. (C) Elektrophorese. (D) Sanger-Sequenzierung und das Sequenzierungschromatogramm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66925/66925fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66925/66925fig03.jpg"> Abbildung 3: Gelelektrophorese von Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Unter Verwendung des DNA-Markers DL5000 als molekularer Marker werden AS-1, AS-2 und AS-3 als Proben und 0 als Kontrollgruppe verwendet. Die Gelelektrophorese wurde durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass die AS-1-, AS-2- und AS-3-Proben alle Banden bei 500 bp aufwiesen, während die Kontrolle keine Banden aufwies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66925/66925fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66925/66925fig04.jpg"> Abbildung 4: Neighbor-Joining-Stammbaum, der aus 13 Sequenzen erstellt wurde. Insgesamt wurden 10 Sequenzen von vier Pflanzenarten aus der NCBI-Datenbank heruntergeladen und die Spleißsequenzen verglichen, um intraspezifische und interspezifische Sequenzvariationen zu analysieren und zu vergleichen und phylogenetische Nachbarbäume zu konstruieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66925/66925fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name des Materials/der Ausrüstung</td>
			<td>Dosis</td>
		</tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td>
			<td>ca. 10 g</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl</td>
			<td>1 M 50 ml</td>
		</tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td>
			<td>0,5 M 20 mL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>ca. 20,45 Gramm</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>sterilisiertes deionisiertes Wasser</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Reagenzien für die Formulierung von Kernisolationspuffern.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Barcode</td>
			<td>Fibel</td>
			<td colspan="2">Primer-Sequenz (5'-3')</td>
			<td colspan="3">PCR-Amplifikations-Sequenzierung</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">ITS2</td>
			<td rowspan="3">R:3R</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">GACGCTTCTCCAGACTACAAT</td>
			<td>94°C</td>
			<td colspan="2">5 Minuten</td>
		</tr><tr><td>94°C</td>
			<td>30er Jahre</td>
			<td rowspan="3">40Zyklen</td>
		</tr><tr><td>56°C</td>
			<td>30er Jahre</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">F:2F</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ATGCGATACTTGGTGTGAAT</td>
			<td>72°C</td>
			<td>45 Sek.</td>
		</tr><tr><td>72°C</td>
			<td colspan="2">10 Minuten</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: DNA-Barcode-Primer und PCR-Reaktionsbedingungen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>proben</td>
			<td>DNA-Extraktion (ng/μL)</td>
			<td>OD260/OD280</td>
		</tr><tr><td>AS-1</td>
			<td>124</td>
			<td>1.84</td>
		</tr><tr><td>AS-2</td>
			<td>184</td>
			<td>1.81</td>
		</tr><tr><td>AS-3</td>
			<td>164</td>
			<td>1.82</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Angelica sinensis (Oliv.) Diels extrahierte DNA-Qualität.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Proben</td>
			<td>Ausgerichtete Sequenzlänge (bp)</td>
			<td>Länge der Spleißsequenz (bp)</td>
			<td>GC(%)</td>
			<td>NCBI:Prozentualer BLAST(%)</td>
			<td>GPGD:Prozentuale Identifizierung von Arten (%)</td>
		</tr><tr><td>AS-1</td>
			<td>500 Basispunkte</td>
			<td>229 Basispunkte</td>
			<td>55.50%</td>
			<td>100%</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>AS-2</td>
			<td>504 Basispunkte</td>
			<td>229 Basispunkte</td>
			<td>55.50%</td>
			<td>100%</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>AS-3</td>
			<td>499 Basispunkte</td>
			<td>229 Basispunkte</td>
			<td>55.50%</td>
			<td>100%</td>
			<td>100%</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 4: Datenbankvergleich der Sequenzierungsergebnisse.

Anwendung von DNA-Barcoding zur Identifizierung von Heilpflanzen

Medicinal plants are valuable resources globally and are used worldwide to maintain health and treat disease; however, the presence of adulteration ...

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Research

Forschung

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