Generierung und Charakterisierung von Organoiden der Gebärmutter von Ratten aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte
2. August 2024
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von endometriumen epithelialen Stammzellen (reESCs) von Ratten vor, um endometriale Organoide von Ratten zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht In-vitro-Studien von Endometriumerkrankungen und ermöglicht die Genom-Editierung und andere zelluläre Manipulationen.
Unser Forschungsschwerpunkt liegt auf der Entwicklung eines neuartigen reproduzierbaren Systems zur Kultivierung und Expansion von Endometrium-Organoiden von Ratten aus Gliazellen. Indem wir die Einschränkungen der derzeitigen Methoden zur Herstellung von Endometriumgewebegeräten beheben, wollen wir das Tempo der Forschung in der Reproduktionsbiologie von Frauen verbessern. Unsere Forschung hat eine Methode zur Kultivierung von endometrialen epithelialen Stammzellen von Ratten vorgeschlagen. Basierend auf dieser Methode können wir uns für Endometrium-Organoide von Ratten entscheiden und damit die vorherige Herausforderung überwinden, Blöcke konstruieren und messen zu müssen. Wir werden mögliche Anwendungen untersuchen, einschließlich Medikamententests und Gen-Editing, die zu einem besseren Verständnis und einer besseren Behandlung von Erkrankungen des weiblichen Fortpflanzungssystems beitragen könnten.
[Erzähler] Positionieren Sie zunächst die anästhesierte Ratte auf der Operationsplattform. Führen Sie Längsschnitte auf beiden Seiten der Gebärmutter durch, um das innere Endometrium freizulegen. Kratzen Sie mit einer T10-Skalpellklinge die Gebärmutterschleimhaut ab, bis die Oberfläche rau ist. Legen Sie alle Fragmente des Gebärmutterendometriums in eine 3,5 Zentimeter große Schale und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Mischen Sie nun die Fragmente des Gebärmutterschleimhauts mit drei Millilitern 1% Kollagenase Typ 1 und inkubieren Sie 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Filtern Sie das unverdaute Gewebe mit einem 100-Mikrometer-Zellsieb und sammeln Sie das Filtrat für die weitere Kultivierung. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das benötigt wird, um die Zellen in jeder Vertiefung der 12-Well-Platte zu säen, um die gewünschte Zelldichte zu erreichen. Säen Sie die gesammelten Zellen zur weiteren Kultivierung in 12-Well-Platten in REEM-Medium aus. Nehmen Sie kultivierte REESCs mit 70 % Konfluenz und verdauen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin und einem millimolaren EDTA für fünf bis sechs Minuten. Die REESCs in 500 Mikrolitern FOD-Matrigel resuspendieren und in 12-Well-Platten geben. Inkubieren Sie die Platten 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Gellation zu ermöglichen. Sobald sich die Zellmatrigelmischung verfestigt hat, fügen Sie 1,5 Milliliter pro Vertiefung REEM hinzu, um das Matrigel zu bedecken. Für die Langzeitkultur der Organoide aspirieren Sie das REEM und fügen Sie 40 Minuten lang einen Milliliter Organoid-Entnahmelösung hinzu, um die Organoide zu dissoziieren. Auf Eis inkubieren, um die Integrität der Organoide zu erhalten. Nach der Inkubation sammeln Sie die Organoide mit einer Weidepipette und zentrifugieren sie drei Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius, um sie für die weitere Verarbeitung zu pelletieren. Suspendieren Sie die pelletierten Organoide in Matrigel in einem Verhältnis von eins zu zwei oder eins zu drei zur Einbettung und anschließenden Kultur in 12-Well-Platten. Um die gefrorenen Organoide aufzutauen, erwärmen Sie das REEM in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad und tauchen Sie das gefrorene Brühröhrchen in das Wasserbad, um die Organoide vorsichtig aufzutauen. Nach dem Auftauen werden die Organoide in 500 Mikrolitern Matrigel resuspendiert, um sie wieder einzubetten und in einer 12-Well-Platte zu kultivieren. Nehmen Sie die kultivierten Endometrium-Organoide der Ratte, aspirieren Sie das REEM aus den Organoiden und fügen Sie einen Milliliter Organoid-Entnahmelösung hinzu, um die Organoide zu dissoziieren. Auf Eis inkubieren, um die Integrität der Organoide zu erhalten. Nach der Inkubation sammeln Sie die Organoide mit einer Weidepipette und zentrifugieren sie drei Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius, um sie für die weitere Verarbeitung zu pelletieren. Suspendieren Sie die Organoide in drei Millilitern vorgewärmtem REEM und geben Sie die resuspendierten Organoide in eine 3,5 Zentimeter große Schale. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreichen, verdauen Sie sie fünf bis sechs Minuten lang mit 0,25 % Trypsin und einem millimolaren EDTA.
Übersicht
Diese Studie stellt ein reproduzierbares Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von epithelialen Stammzellen aus der Ratte-Uterusschleimhaut (reESCs) zur Erzeugung von Endometrium-Organoiden vor. Dieser Fortschritt ermöglicht in-vitro-Forschung zu Erkrankungen des Endometriums und ebnet den Weg für Anwendungen in der Genom-Editierung und Arzneimittelprüfung.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Fortpflanzungsbiologie der Frau
- Endometriale Erkrankungen
- Stammzellenforschung
Hintergrund
- Grenzen der derzeitigen Methoden zur Kultivierung von Endometriumgewebe
- Notwendigkeit besserer In-vitro-Modelle
- Bedeutung des Verständnisses von Erkrankungen des weiblichen Fortpflanzungssystems
Verwendete Methoden
- Isolierung und Kultur von epithelialen Stammzellen des Rattenendometriums
- Organoiden des Rattenendometriums als biologisches System
- Verwendung von Kollagenase zur Gewebeverdauung und Matrigel zur Kultur
Hauptergebnisse
- Erfolgreiches Kultivieren und Expandieren von reESCs
- Erzeugung funktioneller ratenartiger endometrialer Organoiden
- Potenzial zur Erforschung von Anwendungen in der Arzneimittelprüfung und Genom-Editierung
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert eine zuverlässige Methode zur Kultivierung von Endometrium-Organoiden, die für die Fortentwicklung der Forschung im Bereich der reproduktiven Gesundheit von entscheidender Bedeutung ist.
- Dieses Protokoll ist von großer Bedeutung für Studien, die darauf abzielen, Therapien für Erkrankungen des weiblichen Fortpflanzungssystems zu entwickeln.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erzeugung und stabile Expansion von Ratten-Endometrium-Organoiden aus epithelialen Stammzellen schließt eine entscheidende Lücke im präklinischen Modellieren der Endometriumphysiopathologie. Diese Plattform ermöglicht eine mechanistische Risikominimierung und eine vorhersagbare Zuverlässigkeit für die Testung therapeutischer Hypothesen im Bereich der reproduktiven Gesundheit von Frauen. Das Modell unterstützt eine translationale Kontinuität von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Bewertung, insbesondere für Anwendungen im Bereich der Arzneimittelprüfung und Genom-Editierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Krankheitsmechanismen des Endometriums in einem kontrollierten, reproduzierbaren System.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung therapeutischer Zielstrukturen, die für die Endometriumpathologie relevant sind.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung durch Modellierung der Hormonantwort und epithelialen Polarität.
- Bietet eine Plattform für die hypothesengeleitete Erforschung der Genfunktion in der Endometriobiologie.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein standardisiertes, erweiterbares Organoid-System für die Wirkstoffscreening und die Profilierung der Arzneimittelwirkung.
- Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für die Entwicklung quantitativer Assays.
- Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für nachgeschaltete Screening-Workflows.
- Unterstützt die zuverlässige Bewertung von Therapiekandidaten im kontextspezifischen Gewebe relevanter Erkrankungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die krankheitsrelevante Modellierung für die translationale Biomarker-Entdeckung.
- Ermöglicht die Kontinuität von der In-vitro-Entdeckung zur präklinischen Validierung in Säugetiersystemen.
- Verringert das translatorische Risiko, indem Pathologien wie intrauterine Adhäsionen bei Ratten simuliert werden.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung von Portfolios im Bereich der reproduktiven Gesundheit.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Organoid-Plattform ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase integriert und ermöglicht eine frühe Target-Validierung, Assay-Entwicklung sowie translationsorientierte Forschung in Modellen endometrialer Erkrankungen.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in der Biologie des Endometriumgewebes.
- Screening: Bietet assaysbereite, reproduzierbare Organoiden für die Wirkstoffbewertung und Arzneimittelprüfung.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Messung der Hormonantwort und epithelialen Eigenschaften.
- Translationale Forschung: Verbindet In-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Modellen, die für die Gesundheit von Frauen relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine wiederverwendbare, skalierbare Plattform für laufende R&D in der Reproduktionsbiologie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit und verringert mechanistische Unklarheiten in der Erforschung von Endometriumerkrankungen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Generierung und Expansion von Organoiden, um reproduzierbare Ergebnisse über verschiedene Studien hinweg zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung bezüglich Fortführung oder Abbruch von Projekten sowie die Kapitalnutzungseffizienz in frühen Entwicklungsprogrammen im Bereich der reproduktiven Gesundheit.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von therapeutischen Kandidaten zur Behandlung von Endometriumerkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Expertise in der Stammzellisolierung und 3D-Organoid-Kultivierungstechniken.
- Erfordert Zugang zu spezialisierten Medien, Matrigel und Instrumenten zur Gewebeprobenverarbeitung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg zur Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten voraus.
- Kann eine Anpassung für die Verwendung mit anderen Säugetierarten oder Krankheitsmodellen erfordern.
- Die Stabilität der Langzeitkultur und die funktionelle Charakterisierung müssen regelmäßig überprüft werden.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:12
Processing Rat Uterine Endometrium to Isolate Rat Endometrial Epithelial Stem Cells (reESCs)
2:23
Establishing Rat Endometrial Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells (reESCs) and Their Long-Term Culture
4:13
Transitioning Rat Endometrial Organoids to Adherent Culture
