Name: Generierung und Charakterisierung von Organoiden der Gebärmutter von Ratten aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Ratten-Endometrium-Organoiden aus epithelialen Stammzellen für reproduktionsbiologische Forschung. Diese Methode ermöglicht effektive Untersuchungen zu weiblichen Fortpflanzungserkrankungen.

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<ol><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li>
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<li>Esfandiari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometriosis+organoids%3A+prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Endometriosis organoids: prospects and challenges.</a> Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Anti-CD15 (SSEA-1)</td><td>Abcam</td><td>ab135377</td><td>Kaninchen, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Östrogenrezeptor alpha</td><td>Abcam</td><td>ab32063</td><td>Kaninchen, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Pan Cytokeratin</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>Maus, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Progesteronrezeptor</td><td>Abcam</td><td>ab101688</td><td>Kaninchen, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab279653</td><td>Maus, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>A8301</td><td>TargetMol</td><td>909910-43-6</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Merck</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähl-Kit-8</td><td>Beyotime</td><td>C0038</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>BioLegend</td><td>109819</td><td>1:20 (FC), Pacific Blue</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BioLegend</td><td>101806</td><td>1:20 (FC), FITC</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>303120</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>301703</td><td>1:20 (FC), PE</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>TargetMol</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td><td>R& D Systems</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 TSA Fluoreszenzsystem Kit</td><td>APExBIO</td><td>K1051</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 TSA Fluoreszenz System Kit</td><td>APExBIO</td><td>K1052</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>BioLegend</td><td>369803</td><td>1:20 (FC), PerCP</td></tr><tr><td>Fluorescein TSA Fluoreszenz System Kit</td><td>APExBIO</td><td>K1050</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG/HRP Antikörper</td><td>APExBIO</td><td>bs-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serumersatz</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix</td><td>Takara</td><td>RR063A</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Merck</td><td>57-83-0</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Ratte</td><td>Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>BioLegend</td><td>323047</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>TB Green Fast qPCR Mix</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>TriZOL</td><td>Invitrogen</td><td>15596026CN</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>u-Slide 8-Well-Platten</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TargetMol</td><td>146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td>qPCR-Primer von Zielgenen&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene</td><td>Company<</td><td>strong>Sequences</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH F</td><td>Sangon Biotech</td><td>GACATGCCGCCTGGAGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>Ratte GAPDH R</td><td>Sangon Biotech</td><td>AGCCCAGGATGCCCTTTAGT</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Nanog F</td><td>Sangon Biotech</td><td>GACTAGCAACGGCCTGACTCA</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Nanog R&nbsp;</td><td>Sangon Biotech</td><td>CTGCAATGGATGCTGGGATA</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Sox2 F</td><td>Sangon Biotech</td><td>ATTACCCGCAGCAAAATGAC</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Sox2</td><td>R Sangon Biotech</td><td>ATCGCCGGAGTCTAGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Okt4 F</td><td>Sangon Biotech</td><td>CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Okt4 R</td><td>Sangon Biotech</td><td>ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung und charakterisierung von organoiden der gebärmutter von ratten aus endometrialen epithelialen stammzellen der ratte

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

Die reESCs und Uterusorganoide der Ratte wurden von sechs weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 g und 250 g gemäß dem in Abbildung 1 dargestellten Protokoll ermittelt. Aufbauend auf dem Erfolg der Langzeitkultur von humanen endometrialen epithelialen Stammzellen bestand die REEM-Formulierung überwiegend aus Y27632, A8301 und CHIR99021. Um die reESCs in vitro zu stabilisieren, isolierten wir zunächst Endometriumzellen aus dem Endometrium der Ratte mit enzymatischen und mechanischen Techniken. Die durchflusszytometrische Analyse in Abbildung 2A zeigte, dass die primären Endometriumzellen zu etwa 50 % aus Epithelzellen bestanden, die CD9 (49,8 %) exprimierten, mit niedrigen EpCAM- (4,49 %) und CD24-Spiegeln (2,64 %). Der SSEA-1-Marker für reESCs lag bei 6,58 %, während die endothelialen Marker CD31 (30,9 %) und CD45 (70,3 %) relativ hoch waren.
Die Kultivierung in REEM führte jedoch dazu, dass P1-reESCs eine einheitliche wirbelförmige oder polyedrische Morphologie aufwiesen und kompakte Klonstrukturen bildeten (Abbildung 2D). Die allmähliche Entfernung einzelner Faktoren aus REEM führte zu einer entsprechenden Abnahme der proliferativen Kapazität von reESCs. Der Klonbildungsassay unterstreicht die entscheidende Rolle von Y27632 in der stabilen Kultur von reESCs (Abbildung 2B, C). Bei der dritten Passage zeigten die reESCs eine konsistente Expression von SSEA-1 und Cytokeratin, was auf eine erfolgreiche Expansion der primären reESCs während der Kultur hinweist (Abbildung 2F). Darüber hinaus behielten reESCs auch bei späten Passagen eine robuste und stabile proliferative Kapazität bei (Abbildung 2E), was ihre erfolgreiche Isolierung und Expansion im aktuellen REEM-System zeigt.
Organoidkulturen wurden nach einem zuvor berichteten System etabliert, das aus menschlichen Endometriumstammzellen gewonnen wurde8. Innerhalb von 3 Tagen zeigten die reESCs eine schnelle Selbstorganisation zu organoidartigen Strukturen mit einem hohlen Zentrum, die anschließend an Größe und Dicke zunahmen (siehe Abbildung 3A). Die typischen HE-Färbeergebnisse, die die Bildung von Organoiden durch reESCs veranschaulichen, sind in Abbildung 3B dargestellt. Diese Organoidkulturen können durch Passage aufrechterhalten werden, wie die hohe Zellviabilität zeigt, die durch die Ki67-Färbung sowohl nach direkter Passage als auch nach Frost-Tau-Zyklen angezeigt wird. Darüber hinaus wurde eine HE-Färbung an der 10. Generation von Organoiden durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass die Organoidstruktur intakt gehalten werden konnte (siehe Abbildung 3E). Darüber hinaus zeigten die qPCR-Ergebnisse, dass Nanog, Sox2 und Oct4 in Konzentrationen exprimiert wurden, die mit denen der P1-Generation vergleichbar waren (Abbildung 3F). Dieser Befund deutet auf das Potenzial für eine langfristige Kultivierung von Organoiden innerhalb des aktuellen Systems hin.
In unserer Studie wurde eine Voruntersuchung zur Reaktion uterusähnlicher Strukturen von Ratten auf E2 und P4 durchgeführt. Die Immunfluoreszenzfärbung in Abbildung 4A zeigte das Vorhandensein von Östrogen- und Progesteronrezeptoren. Nach der Supplementierung mit E2 durchliefen diese Organoide einen Übergang von einer hohlen kugelförmigen Form zu einem dichter besiedelten internen Wachstumsmuster (Abbildung 4C). Die anschließende Exposition gegenüber P4 führte zu einer verminderten Permeabilität der dichten Strukturen, was schließlich zu deren Zerfall führte (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass E2 möglicherweise die weitere Differenzierung uterusähnlicher Strukturen der Ratte vorantreibt, während P4 apoptotische Signalwege auslösen kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig01v2.jpg"> 
Abbildung 1: Verfahren zur Etablierung von Stammzellen des Endometriumepithels von Ratten und Uterusorganoiden von Ratten. Abkürzung: SD = Sprague-Dawley. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig02v2.jpg"> 
Abbildung 2: Erzeugung und Langzeitkultur von Stammzellen des Endometriumepithels der Ratte in vitro. (A) Durchflusszytometrische Analyse, die den Anteil positiver Zellen im Endometrium der Ratte zeigt. (B) Kristallviolett-Färbung von Klonen in REEM mit oder ohne A8301, Y27632 bzw. CHIR99021. Maßstabsbalken = 1 cm. (C) Die Klonnummern in REEM mit oder ohne Faktoren. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. n = 3 Spender (***, p&lt;0,001). (D) Lichtmikroskopische Aufnahmen von P1-Endometriumepithel-Stammzellen der Ratte mit und ohne Kristallviolett-Färbung. (E) CCK-8-Analysen von endometriumen epithelialen Stammzellen der Ratte an Passage 1, Passage 7 und Passage 14. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, n = 3. (F) Immunfluoreszenzanalysen, die die Expression von Cytokeratin und SSEA-1 nachweisen. Abkürzung: REEM = reESCs Expansion Medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig03v2.jpg"> 
Abbildung 3: Erzeugung und Langzeitkultur von Endometrium-Organoiden der Ratte in vitro. (A) Lichtmikroskopische Bilder von P1-Endometrium-Organoiden von Ratten. (B) H&amp;E-Färbung für P1-Organoide aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte. (C) Immunfluoreszenzanalysen, die die Expression von Cytokeratin und SSEA-1 nachweisen. (D) Immunfluoreszenzanalysen, die die Expression von Ki67 und SSEA-1 nachweisen. (E) H&amp;E-Färbung für P 10-Organoide der Ratte. (F) qPCR-Analysen zur Expression von Nanog, Sox2 und Oct-4 in P1- und P10-Endometriumorganoiden der Ratte. Die Expression wurde auf GAPDH normiert (n = 3, zweiseitiger ungepaarter t-Test, n.s. = nicht signifikant). Abkürzung: H&amp;E = Hämatoxylin und Eosin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Sequentielle Kultivierung von Organoiden mit E2 und P4. (A) Immunfluoreszenzanalysen, die die Expression von Östrogenrezeptor, Gestagenrezeptor und SSEA-1 zeigen. (B) Überblick über lichtmikroskopische Aufnahmen von Ratten-Organoiden, die in E2 und P4 kultiviert wurden. (C) Lichtmikroskopische Aufnahmen zeigen die Umwandlung einer Hohlkugel in eine dichte Kugel im inneren Hohlraum von Organoiden, nachdem sie 7 Tage in E2 kultiviert wurde. Abkürzungen: ER = Östrogenrezeptor; PR = Gestagen-Rezeptor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Generierung und Charakterisierung von Organoiden der Gebärmutter von Ratten aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von Endometrium-Epithel-Organoiden der Maus für die Genexpression und histologische Analysen.

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Generierung und Charakterisierung von Organoiden der Gebärmutter von Ratten aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte (Video) | JoVE Journal

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