Name: Konsistente Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus durch laterale Schwanzveneninjektion bei erwachsenen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Lernen Sie die optimierte laterale Schwanzveneninjektion zur konsistenten AAV-Verabreichung bei erwachsenen Mäusen. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Gentherapie-Forschung mit verbesserter Transduktionseffizienz.

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Die Autoren danken den Mitarbeitern der NINDS-Tierpflegeeinrichtung für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Intramurale Forschung des NIH, NINDS, unterstützt (Jahresberichtsnummer 1ZIANS003129). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

AAV-basierte Therapien durch intravenöse Injektion in präklinischen Mausmodellen

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Die Autoren haben keine Offenlegungen, die für die in diesem Artikel veröffentlichte Arbeit relevant sind.

AAV-basierte Therapien bergen aufgrund der Vielseitigkeit von AAV als Gentherapievektor ein großes Potenzial für monogene Erkrankungen, was es ermöglicht, AAVs an die unterschiedlichen Verabreichungsbedürfnisse verschiedener Erkrankungen anzupassen 4,5,7,9. AAVs werden in präklinischen Mausmodellen häufig per IV-Injektion verabreicht, um die Sicherheit und Wirksamkeit potenzieller Therapeutika zu testen16. Da unterschiedliche injizierte AAV-Dosen zu deutlichen Unterschieden in den experimentellen Ergebnissen führen können, ist es für die Experimentatoren von entscheidender Bedeutung, die beabsichtigte AAV-Dosis konsistent injizieren zu können, um die Gültigkeit und Robustheit der generierten In-vivo-Daten sicherzustellen28. IV-Injektionen sind weit verbreitet, aber sie sind technisch anspruchsvoll und erfordern umfangreiche Schulungen und kontinuierliches Üben, um ein Kompetenzniveau zu entwickeln und aufrechtzuerhalten, das eine gleichbleibend erfolgreiche Injektion gewährleistet 16,17,18,19. Zusätzlich zur korrekten Injektion von AAV ist es in der Regel wünschenswert, Assays zu verwenden, um die Bioverteilung und die Verabreichungseffizienz des injizierten AAV an die Zielgewebe oder -zellen zu beurteilen29,30.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, Experimentatoren dabei zu unterstützen, IV-Injektionen erfolgreich und konsistent durchzuführen, indem es die Details eines optimierten IV-Injektionsprotokolls zur Verabreichung von AAV bei 7-9 Wochen alten, nicht edierten Mäusen ausführlich beschreibt. Es ist wichtig zu beachten, dass Mäuse, die deutlich kleiner oder größer als Wildtyp-Mäuse in der hier verwendeten Altersgruppe sind, aufgrund einer verminderten Sichtbarkeit der Venen oder einer Inkompatibilität mit den bei dieser Methode verwendeten Fesseln eine größere Herausforderung darstellen können. Es wurde bereits berichtet, dass Schwanz-IV-Injektionen aufgrund der kleinen Gefäßgröße31 nicht für die intravenöse Verabreichung von Reagenzien bei Mäusen unter 6 Wochen geeignet sind. Obwohl es möglich ist, könnte es schwierig sein, Mäuse mit einem Gewicht von weniger als 22,0 g erfolgreich zu injizieren. Forscher, die Mäuse untypischer Größe verwenden, müssen möglicherweise Anpassungen an das Verfahren vornehmen. Dieses Protokoll beschreibt auch mehrere Assays, die zur Beurteilung der AAV-Bioverteilung und der Transduktionseffizienz verwendet werden können.
Bei der Befolgung dieses Protokolls müssen einige kritische Punkte beachtet werden. Während der Injektion bieten 29-G-Nadeln einen höheren Widerstand, wenn sich die Nadel nicht in der Vene befindet. Dies reduziert den Volumenverlust, der durch versehentliche perivaskuläre Injektion der Lösung bei fehlgeschlagenen Injektionsversuchen verloren geht. Insulinspritzen haben ein geringeres Totvolumen als normale Spritzen. Wenn Sie eine andere Spritze und/oder Nadel als die hier aufgeführten verwenden, muss möglicherweise in den Protokollschritten 1.1.3.3 zusätzliches Injektionsvolumen vorbereitet werden, um ein größeres Totraumvolumen zu berücksichtigen (z. B. fügen Sie der vorgesehenen Dosis 30 μl anstelle von 15 μl hinzu).
Wenn sich beim Ansaugen der AAV-Dosis in die Spritze feine aspirationsbedingte Luftblasen an den Spritzenseiten bilden, ziehen Sie das Injektat langsam weiter nach oben auf der Spritze. Dadurch werden die meisten kleinen Luftblasen entfernt. Laden Sie mindestens weitere 10-15 μl AAV auf das vorgesehene Volumen, das injiziert werden soll. Dieses zusätzliche Volumen dient dazu, das Volumen zu berücksichtigen, das beim Ausstoßen von Luftblasen oder bei möglichen fehlgeschlagenen Injektionsversuchen verloren gehen könnte. (z. B. wenn das zu injizierende Zielvolumen 150 μl beträgt, laden Sie 165 μl in die Spritze (auf halbem Weg zwischen den 160 μl- und 170 μl-Markierungen auf der Spritzenskala). Wenn die Nadel korrekt in der Vene platziert ist und das Volumen in der Spritze unmittelbar vor dem erfolgreichen Injektionsversuch bei 165 μl liegt, geben Sie das Reagenz ab, bis 15 μl in der Spritze verbleiben (auf halbem Weg zwischen der 10 μl- und der 20-μl-Markierung), wodurch 150 μl (165 μl - 150 μl = 15 μl)) abgegeben werden. Die Ausrichtung des abgeschrägten Lumens (Abschrägung nach oben) mit der Spritzenskala ermöglicht die Verfolgung des abgegebenen Volumens während der Injektion.
Einige Experimentatoren ziehen es vielleicht vor, die Maus auf die Seite zu legen, so dass eine ihrer Venen gerade und leicht zugänglich ist, verglichen mit einer Maus auf ihren Füßen. Der Schwanz einer Maus auf der Seite ist jedoch je nach Mausgröße in unterschiedlichen Winkeln geneigt, was eine Anpassung des Injektionswinkels erfordert, wenn Mäuse unterschiedlicher Größe injiziert werden. Dies kann sich negativ auf die Konsistenz des Erfolgs des Eingriffs auswirken. Bei ersten Übungsversuchen können die Experimentatoren beide Ausrichtungen der Maus ausprobieren, um ihren bevorzugten Ansatz zu bestimmen. Wenn Sie die Maus an den Füßen haben, können Sie schnell und einfach auf beide seitlichen Schwanzvenen zugreifen. Dies reduziert die Rückhaltezeit, wenn bei mehreren fehlgeschlagenen Injektionsversuchen ein Zugang zu beiden Venen erforderlich ist.
Wenn Sie die Seitenvene in der Nähe der Schwanzbasis (näher am Mauskörper) injizieren (insbesondere bei Mäusen mit einem Gewicht von >30 g), stellen Sie den Injektionswinkel von parallel zur Vene bis 5°-10° zur Vene ein, da die Vene an der Schwanzbasis etwas tiefer ist als distal.
Die hier aufgeführten Protokolle zur Überprüfung des RNase-Verdaus und der RNA-Kontamination wurden an DNA-Proben verifiziert, die aus frisch gefrorenem Lebergewebe isoliert wurden und insgesamt 175-700 ng Nukleinsäuren in 20 μl enthielten. Das RNase-Verdauprotokoll wurde auch an DNA-Proben getestet, die aus frisch gefrorenem Lebergewebe und FACS-sortierten Zellen isoliert wurden, um das Vorhandensein des Vektorgenoms und des Mausgenoms nach dem RNase-Verdau zu bestätigen. Die Ergebnisse wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese der Endpunkt-PCR-Amplifikation der Zielamplikone visualisiert.
Das Befolgen der beschriebenen Methodik kann die Schulungs- und Übungszeit reduzieren, die erforderlich ist, um intravenöse Injektionen zu beherrschen, und zu einer höheren erfolgreichen Injektionsrate führen, wodurch Reagenzien eingespart werden. Dieses Protokoll verwendet einfache und häufig verwendete Tools, ohne dass fortschrittliche Geräte oder Setups erforderlich sind, die möglicherweise nicht ohne weiteres verfügbar sind. Darüber hinaus können die hier aufgeführten IV-Injektionsschritte auf eine Vielzahl von Injektaten angewendet werden, die intravenös verabreicht werden müssen, wie z. B. Antisense-Oligonukleotide (ASOs), wobei die entsprechenden Modifikationen an den Schritten der Injektvorbereitung je nach Injektat vorgenommen werden.

Monogene Erkrankungen machen 80 % der seltenen Erkrankungen aus, von denen weltweit insgesamt 300 Millionen Menschen betroffen sind 1,2. Für die meisten dieser stark beeinträchtigenden seltenen Erkrankungen gibt es derzeit keine zugelassenen kurativen Therapien 1,2,3. Monogene Störungen sind jedoch ideale Kandidaten für Gentherapien, die dysfunktionale Gene ersetzen, ergänzen, korrigieren oder zum Schweigen bringen können 4,5. Derzeit werden mehrere Vektoren entwickelt und verwendet, um Gentherapien für bestimmte Zelltypen zu verabreichen 4,6. Einer dieser Vektoren ist das Adeno-assoziierte Virus (AAV). AAV ist ein nicht-pathogenes Parvovirus, das zunehmend als Gentherapie-Vektor eingesetzt wird7. Im Vergleich zu anderen viralen Vektoren weist AAV eine geringere Immunogenität, ein geringeres Potenzial zur Integration in das Wirtsgenom und die Fähigkeit auf, sich teilende und nicht teilende Zellen in verschiedenen Geweben effizient zu transduzieren 7,8. Darüber hinaus wurden mehrere Ansätze entwickelt, um AAVs mit wünschenswerten Eigenschaften wie spezifischem Gewebetropismus oder weiter reduzierter Immunogenität zu entwickeln und zu identifizieren, was die Vielseitigkeit von AAV als viraler Vektor für verschiedene Indikationen erheblich erhöht9. Diese Faktoren haben AAV zu einem umfassend untersuchten Gentherapievektor gemacht und zur Entwicklung mehrerer von der FDA zugelassener AAV-basierter Gentherapien geführt10.
Mausmodelle werden häufig verwendet, um potenzielle Gentherapien in vivo zu testen und die Pathomechanismen monogener Erkrankungen besser zu verstehen. Dies ist auf die Rekapitulation der Pathologien verschiedener Erkrankungen durch die Mausmodelle, die Ähnlichkeit ihres Genoms mit dem menschlichen Genom und die relativ einfache Handhabung, Wartung und Generierung von Mäusen zurückzuführen 11,12,13. In-vivo-Tests sind besonders wichtig bei der Untersuchung von Erkrankungen, die mehrere Systeme oder Regionen des Körpers betreffen, wie z. B. Muskeldystrophien. Bei diesen Erkrankungen reichen In-vitro-Tests möglicherweise nicht aus, um die Sicherheit, Wirksamkeit, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Therapeutika, die nach systemischer Verabreichung verschiedene Körperregionen erreichen sollen, umfassend zu beurteilen14.
Für die Verabreichung von Medikamenten können verschiedene systemische Verabreichungswege genutzt werden. Jeder Weg hat seine Vor- und Nachteile und seinen Grad der Kompatibilität mit dem untersuchten Tiermodell und dem untersuchten Medikament15. Die intravenöse (i.v.) laterale Schwanzveneninjektion ist ein häufig verwendeter Weg zur systemischen Verabreichung von AAV bei Mäusen16. Laterale Schwanzvenen-Injektionen ermöglichen eine schnelle und direkte Verabreichung des Injektats in den Blutkreislauf der Maus und gewährleisten so eine hohe Bioverfügbarkeit des Arzneimittels im systemischen Kreislauf17. Sie erfordern auch relativ einfache und allgemein verfügbare Werkzeuge, um ausgeführt zu werden. Vor allem aufgrund des kleinen Schwanzvenendurchmessers und der Schwierigkeit, die Vene zu lokalisieren, sind laterale Schwanzveneninjektionen jedoch technisch anspruchsvoll und erfordern ein hohes Maß an Geschicklichkeit und ständiger Übung, um fehlgeschlagene Injektionsversuche oder unvollständige Dosisabgabe zu vermeiden 16,17,18,19. Diese können zum Verlust teurer Reagenzien oder zu ungenauen Ergebnissen führen, insbesondere wenn die unvollständige Injektion bei der Durchführung der Injektion nicht erkannt wird. Unsere hier zusammengefassten Erfahrungen basieren auf Protokollen, die in gut dokumentierten Artikeln berichtet werden, die wir für unsere Verwendung angepasst haben, um verschiedene Schritte des lateralen Schwanzveneninjektionsverfahrens zu optimieren, um eine gleichbleibend erfolgreiche Injektion zu gewährleisten 20,21,22,23,24,25,26,27.
Hier beschreiben wir dieses detaillierte, optimierte laterale Schwanzvenen-Injektionsprotokoll zur Verabreichung von AAV an unedierte 7-9 Wochen alte Mäuse mit einfachen und allgemein verfügbaren Werkzeugen. Darüber hinaus stellen wir die Protokolle für Methoden zur Verfügung, die zur Bewertung der AAV-Verabreichung und Bioverteilung verwendet werden. Diese Protokolle umfassen die Gewebeentnahme nach der Injektion, die Gewebefixierung, die DNA-Extraktion und die Quantifizierung des Vektorgenoms pro diploidem Genom (vg/dg) der digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR). Das IV-Injektionsprotokoll und die hier bereitgestellten Hinweise zielen darauf ab, die erfolgreiche Durchführung von lateralen Schwanzveneninjektionen zu erleichtern. Dies wird möglicherweise dazu beitragen, die Zeit zu verkürzen, die für die Beherrschung der Injektionsfähigkeiten benötigt wird, und gleichzeitig die Genauigkeit und Konsistenz der Injektionen zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Spritzenfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>0,3 mL Insulinspritzen mit 29G Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Mikrozentrifuge &nbsp; Schlauch</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>The Warner Graham Company</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10x phosphatgepuffert Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Wird zur Herstellung von 1x PBS für die Gewebefixierung</td></tr> verwendet <tr><td>15 ml konisches Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konischer Röhrchenhalter</td><td>Mehrere Quellen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>190 Proof Ethylalkohol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6810-01-113-7320</td><td>Wird zur Herstellung von 70% Ethanol</td></tr><tr><td>verwendet 1x steriles PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Mikrozentrifugen-Gewebeaufbewahrungsröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Adeno-assoziiertes Virus (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>Einzelsträngige DNA (ssDNA) AAV wurde verpackt, um Cre-Rekombinase als Transgen zu liefern, das vom CMV-Promotor angetrieben</td></tr><tr><td>wird Alkoholtupfer</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Nächstes</td><td>Advance</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>BsuRI (HaeIII)-Restriktionsenzym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Ai14-abgeleitete Mäuse aus JAX 007914 Stamm (genetischer Hintergrund: C57BL/6J)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mäuse, die das Ai14 Cre-reporter-Allel enthalten, wurden von JAX gekauft (Katalognummer: 007914)</td></tr><tr><td>Saugeinlagen zum Einmalgebrauch</td><td>Fisherbrand</td><td>1420662</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionszange</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsschere</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Abbaureagenz (DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Extraktion RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Für den RNA-Verdau während der Nukleinsäureextraktion</td></tr><tr><td>DNasefreie RNase für die DNA-Aufreinigung</td><td>&nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>Für den RNA-Verdau nach Nukleinsäure </td></tr><tr><td>Extraktions-dPCR-Sonde PCR-Kit</td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>dPCR-Software&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>QIAcuity Software Suite&nbsp;</td></tr><tr><td>Erhöhte Plattform</td><td>Mehrere Quellen</td><td>N/A</td><td>Eine leere Pipettenspitzenbox wurde verwendet, um den Maus-Rückhalteapparat während des Aufwärmens des Schwanzes anzuheben</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Mehrere Quellen</td><td>N/A</td><td>Hier verwendetes Modell: Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop-Software&nbsp;</td><td>Mehrere Quellen&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Hier eingesetzte Software: NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>Metallbehälter</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>Methylbutan</td><td>J.T. Baker</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in molekularer Qualität</td><td>Biologisch</td><td>351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>Mausschlauch-Zurückhaltung</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Myfuge Mini-Zentrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Polymerase-Kettenreaktions-Thermocycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1851148</td><td>Modell: C1000 Touch</td></tr><tr><td>Precision Tücher</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR Nanoplatte 26k 24-Wells</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One dPCR-System</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blut & Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Wird für die DNA-Extraktion aus Geweben</td></tr><tr><td>verwendet Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Wird für die Reinigung von genomischer DNA verwendet, und die Isolierung von DNA aus kleinen Mengen von Blut Prtocotol wurde für die DNA-Extraktion aus FACS-sortierten Zellen verwendet</td></tr><tr><td>Nagetier-Restrain-Kegel</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>Styroporbox</td><td>Mehrere Quellen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Oberflächenreiniger und Desinfektionsmittel</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Mehrere Quellen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Transferzange</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Daigger & Firma</td><td>22220A</td><td>Modell: Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

konsistente verabreichung des adeno-assoziierten virus durch laterale schwanzveneninjektion bei erwachsenen mäusen

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

Viele Erkrankungen betreffen mehrere Organe oder betreffen verschiedene Regionen des Körpers, daher ist es wichtig, Therapeutika systemisch zu verabreichen, um die betroffenen Zellen an verschiedenen Stellen zu bekämpfen. Die intravenöse Injektion ist ein weit verbreiteter systemischer Verabreichungsweg in präklinischen Studien, in denen Behandlungen untersucht werden, die für die körperweite Verabreichung vorgesehen sind. Bei erwachsenen Mäusen handelt es sich dabei um die intravenöse Verabreichung des Therapeutikums in die seitlichen Schwanzvenen der Maus. Wenn sie gemeistert werden, sind Schwanzveneninjektionen sicher und schnell und erfordern nur einfache und allgemein verfügbare Werkzeuge. Schwanzveneninjektionen sind jedoch technisch anspruchsvoll und erfordern umfangreiche Schulungen und kontinuierliches Üben, um die genaue Abgabe der beabsichtigten Dosis zu gewährleisten.
Hier beschreiben wir ein detailliertes, optimiertes, laterales Schwanzvenen-Injektionsprotokoll, das wir auf der Grundlage unserer Erfahrungen und auf Empfehlungen, die zuvor von anderen Gruppen berichtet wurden, entwickelt haben. Abgesehen von den Maus-Halterungen und Insulinspritzen werden für dieses Protokoll nur Reagenzien und Geräte benötigt, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind. Wir fanden heraus, dass die Befolgung dieses Protokolls zu einer durchweg erfolgreichen intravenösen Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus (AAV) in die Schwanzvenen von nicht edierten 7-9 Wochen alten Mäusen führt. Darüber hinaus beschreiben wir die optimierten Protokolle für den histologischen Nachweis von fluoreszierenden Reporterproteinen und die Quantifizierung des Vektorgenoms pro diploidem Genom (vg/dg), die zur Beurteilung der AAV-Transduktion und Biodistribution verwendet werden. Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Experimentatoren dabei zu helfen, Schwanzveneninjektionen erfolgreich und konsistent durchzuführen, was die Übungszeit reduzieren kann, die zur Beherrschung der Technik erforderlich ist.

Sieben bis neun Wochen alten männlichen Mäusen wurde AAV durch laterale Schwanzveneninjektion in einer Dosis von 1,5 × 1012 vg/Maus injiziert, die in einem Injektionsvolumen von 150-200 μl verabreicht wurde. Das hier verwendete ssDNA-AAV lieferte ein Cre-Rekombinase-Transgen, das vom CMV-Promotor angetrieben wird. Die injizierten Mäuse waren homozygot für das Cre-Reporter-Allel Ai14. Wenn sie der Cre-Rekombinase ausgesetzt sind, exprimieren Ai14-Allel-haltige Zellen das fluoreszierende tdTomato-Protein. Da die tdTomato-Expression durch Cre-induzierte genomische Rekombination verursacht wird, weisen tdTomato-exprimierende Zellen auf Zellen hin, die entweder direkt durch das AAV transduziert wurden oder Nachkommenzellen von transduzierten Zellen waren. Die hier gezeigten Daten beziehen sich auf Mäuse, denen AAV9-CMV-Cre in einer Dosis von 1,5 × 1012 vg/Maus in 160 μl (5,8-5,9 × 1013 vg/kg) injiziert wurde. Die Mäuse wurden 28 Tage nach der Injektion getötet und das Gewebe wie oben beschrieben entnommen. Einige Skelettmuskeln und Leberlappen wurden verdaut und ihre Zellen mit Hilfe von FACS gesammelt. Einige Leberlappen wurden sofort mit vorgekühltem Methylbutan für die Nukleinsäureextraktion eingefroren. Einige Skelettmuskeln und Leberlappen wurden für die histologische Bildgebung der fluoreszierenden tdTomate fixiert. tdTomato wurde diffus in der Leber (Abbildung 2A) und im Quadrizeps (Abbildung 2C) exprimiert, was darauf hindeutet, dass AAV9 verschiedene Regionen beider Gewebe erreichte und transduzierte.
DNA, die aus frisch gefrorener Leber und FACS-sortierten Zellen extrahiert wurde, wurde verwendet, um vg/dg mittels dPCR zu quantifizieren. Die Vg/dg-Quantifizierung kann verwendet werden, um die Konsistenz der Injektion und die Transduktionseffizienz von AAV in der analysierten Probe zu beurteilen. Die 1D-Tröpfchen-Streudiagramme aus der frisch gefrorenen Lebergewebeprobe und den FACS-sortierten Zellen wurden verwendet, um die Validität des Assays sicherzustellen (Abbildung 3A,C). Das Streudiagramm zeigte das Vorhandensein positiver und negativer Partitionen, eine klare Trennung zwischen der positiven und der negativen Partition, die eine genaue Bestimmung der Nachweisschwelle ermöglicht, und das Vorhandensein von wenigen bis wenigen Tröpfchen zwischen der positiven und negativen Partition, die die Genauigkeit des dPCR-Assays verringern können. Die Erfüllung all dieser Kriterien deutete darauf hin, dass die Ergebnisse des dPCR-Assays gültig waren. Die Anzahl der Polr2a-Genkopien in jeder Probe wurde quantifiziert, um die Anzahl der diploiden Genome der Maus zu bestimmen (2 Polr2a-Genkopien/diploides Genom der Maus), und Primer/Sonden gegen die Cre-Rekombinase-Transgensequenz wurden verwendet, um das virale Genom zu quantifizieren (1 Transgenkopie/virales Genom, Tabelle 1). Der vg/dg-Wert wurde für die frisch gefrorene Lebergewebeprobe und die FACS-sortierten Zellen quantifiziert und zeigte das Vorhandensein von 187,7 vg/dg bzw. 4,7 vg/dg in jeder Probe (Abbildung 3B,D). Proben von PBS-injizierten Mäusen und Nicht-Template-Kontrollen, die keine Nukleinsäuren enthielten, wurden als Negativkontrollen verwendet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über die intravenöse Injektionsstation. (A) Erforderliche Werkzeuge für die Durchführung der IV-Injektion. Hier gezeigt sind der (1) Timer, (2) der Rückhalteapparat für Mausschläuche, (3) ungeschnittene und (4) geschnittene Kunststoff-Rückhaltekegel, (5) ein Alkoholtupfer, (6) eine leere Pipettenspitzenbox, die als Plattform zum Anheben des Mausschlauch-Rückhaltesystems verwendet wird, (7) Einweg-Absorptionspads, (8) ein konisches 15-ml-Röhrchen mit warmem Wasser, (9) ein 15-ml-Röhrchenhalter, (10) eine Gaze und (11) eine Insulinspritze. (B) Die Maus wird zuerst in den Schlauchrückhalter gelegt. Dann wird der geschnittene Rückhaltekegel eingeführt, um eine Rückhaltehülle um die Maus zu schaffen, wenn die Maus zu klein ist, um nur durch den Schlauchrückhalteapparat zurückgehalten zu werden. Stellen Sie sicher, dass die Atmung der Maus nicht durch die Fesseln behindert wird. Der Schlauch wird auf die erhöhte Plattform gelegt, um das Platzieren des Mausschwanzes in warmem Wasser zu ermöglichen. (C) Positionierung des Mausschwanzes und Haltewinkel der Nadel unmittelbar vor der Injektion. Ziehe den Schwanz nach hinten, so dass der Schwanz gestreckt ist und die Injektionsstelle vollständig horizontal ist. Die Nadel verläuft parallel zum Schwanz und zur Vene, und die Fase zeigt nach oben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Abbildung 2: Nachweis des fluoreszierenden Reporterproteins nach der IV-Injektion. Sieben bis neun Wochen alte männliche Mäuse, die das Cre-Reporter-Allel Ai14 trugen, wurden entweder mit AAV9-CMV-Cre in einer Dosis von 1,5 × 10,12 vg/Maus in 160 μl (5,8-5,9 × 1013 vg/kg) oder PBS intravenös injiziert. Repräsentative Fluoreszenzbilder von Schnitten aus der Leber (A) oder (C) des Quadrizeps der Maus nach AAV9 nach der Injektion von Cre IV. (B) Leber- oder (D) Quadrizepsschnitte von PBS-injizierten Mäusen wurden als Negativkontrollen abgebildet. Das Gewebe wurde entnommen und 28 Tage nach der intravenösen Injektion fixiert. Nach der Cre-Exposition wird das fluoreszierende tdTomato-Protein in transduzierten Zellen und Nachkommenzellen transduzierter Zellen exprimiert. 10 μm dicke Schnitte wurden bei 10-facher Vergrößerung abgebildet. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Abbildung 3: Quantifizierung des Vektorgenoms pro diploidem Genom (vg/dg). 1D-Scatterplot der Quantifizierung von dPCR-Vektorgenomen in (A) Lebergewebe oder (C) FACS-sortierten Zellen von Mäusen, die entweder mit AAV9-CMV-Cre oder PBS injiziert wurden. Die Streudiagramme zeigen die positiven und negativen dPCR-Partitionen sowie die Nachweisschwelle, die durch die horizontale Linie über den Proben angezeigt wird. (B,D) vg/dg-Quantifizierung nach Quantifizierung der diploiden Genome und Vektorgenome der Maus in den (B) Lebergewebe- oder (D) FACS-sortierten Zellproben. Die hier gezeigten Ergebnisse stammen von einer einzelnen AAV9-injizierten Maus und einer einzelnen PBS-injizierten Maus mit einem technischen dPCR-Duplikat für jede Maus. Fehlerbalken geben das Konfidenzintervall von 95 % für jede Stichprobe an. Abkürzungen: NTC= Nicht-Vorlagensteuerung; dPCR = digitale PCR; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fibel</td>
			<td>Reihenfolge</td>
		</tr><tr><td>Cre Forward Grundierung</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Cre Reverse Grundierung</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Cre-Sonde </td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Polr2a Vorwärts-Grundierung</td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a Rückseiten-Grundierung</td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a-Sonde </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Sequenzen von Primern und Sonden, die für die vg/dg-Quantifizierung verwendet wurden. Cre-Primer und Sonde wurden verwendet, um das Vektorgenom zu quantifizieren. Polr2a-Primer und -Sonden wurden verwendet, um das diploide Genom der Maus zu quantifizieren.

Im Folgenden stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Injektion von seitlichen Schwanzvenen aus der Maus zur systemischen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren (AAV) bei adulten Mäusen vor. Darüber hinaus beschreiben wir Protokolle von häufig verwendeten Assays zur Beurteilung der AAV-Transduktion.

Konsistente Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus durch laterale Schwanzveneninjektion bei erwachsenen Mäusen

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Li, D., et al. Direkte intrathekale Injektion von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren in erwachsene Mäuse. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur intrathekalen Injektion von Adeno-assoziierten Viren (AAV) in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) einer wachen Maus, einschließlich der Spritzenvorbereitung, der Ausrichtung der Wirbelsäule und des präzisen Einführens der Nadel. Diese Methode validiert die gezielte Verabreichung von Genen und unterstützt ihr Potenzial für...

Intrathekale Verabreichung von Viren in einem Mausmodell zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralnervensystems

Quelle:Pourshafie, N., et al. Systemische Verabreichung von microRNA unter Verwendung des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018).In diesem Video wird eine von spinaler und bulbärer Muskelatrophie oder SBMA betroffene Maus einer Schwanzveneninjektion von rekombinanten AAV-Vektoren (Adeno-assoziierten Vektoren) unterzogen, die ein Plasmid tragen, das für therapeutische microRNA kodiert. Der Vektor produziert...

Injektion rekombinanter adeno-assoziierter Vektoren in einem Mausmodell für spinale und bulbäre Muskelatrophie

Quelle: Grames, M. S., et al. Methoden und Tipps zur intravenösen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren an Ratten und zur Bewertung der Transduktion des Zentralnervensystems. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Schwanzveneninjektion von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren (AAV) bei Ratten. Nach der Injektion in die Seitenschwanzvene gelangt das Virus in den Blutkreislauf, zirkuliert durch das Herz und erreicht das Gehirn, wo es in Neuronen eindringt und die Produktion von...

 Intravenöse Verabreichung von rekombinanten Adeno-assoziierten Virusvektoren in einem Rattenmodell 

Hier beschreiben wir die Lieferung von MicroRNA verwenden ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 in einem Mausmodell der neuromuskulären Erkrankungen. Eine einzelne periphere Verabreichung bei Mäusen führte zu nachhaltigen MiRNA Überexpression in Muskel und motorischen Neuronen, bietet eine Möglichkeit, MiRNA Lernfunktion und therapeutische Potenzial in Vivo.

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Potenz und Sicherheit der spinalen Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9) -vermittelten Genabgabe zu entwickeln und zu validieren, indem eine neuartige subpiale Genabgabetechnik bei erwachsenen Mäusen verwendet wurde.

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Hier präsentieren wir Ihnen eine direkte intrathekale Injektionstechnik mit 1 % Lidocain Hydrochlorid in eine virale Lösung gewährleisten effizienten Adeno-assoziierten Viren Lieferung an Kleintieren und etablieren ein scoring-System zur Vorhersage der Transduktion Effizienz im zentralen Nervensystem nach dem Grad der vorübergehende Schwäche durch Lidocain induziert.

Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen

In diesem Manuskript wird die subkonjunktivale Injektion als gültige Vektorabgabemethode für Augengewebe bei Mäusen unter Verwendung eines Injektionssystems demonstriert, das aus einer Infusions-/Entnahmespritzenpumpe und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege anpassbar.

Subkonjunktivale Verabreichung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Kleintiermodellen

Es wird ein chirurgischer Eingriff beschrieben, bei dem Injektionen in die Lendenwirbelkammer der juvenilen Ratte durchgeführt werden. Dieser Ansatz wurde für die intrathekale Verabreichung von Gentherapie-Vektoren verwendet, aber es wird erwartet, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von Therapeutika, einschließlich Zellen und Medikamenten, verwendet werden kann.

Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Lernen Sie die optimierte laterale Schwanzveneninjektion zur konsistenten AAV-Verabreichung bei erwachsenen Mäusen. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Gentherapie-Forschung mit verbesserter Transduktionseffizienz.

Konsistente Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus durch laterale Schwanzveneninjektion bei erwachsenen Mäusen

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