Name: Eintierische, einröhrige RNA-Extraktion zum Vergleich der relativen Transkriptspiegel mittels qRT-PCR im Bärtierchen Hypsibius exemplaris (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle RNA-Extraktionsmethode für einzelne Hypsibius exemplaris zur Analyse relativer Transkriptspiegel mittels qRT-PCR. Diese Technik ermöglicht effiziente Genexpressionsstudien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Ein-Röhrchen-Pipeline für die RNA-Extraktion aus einem einzelnen Bärtierchen. (A) Schema, das das Protokoll für die RNA-Extraktion aus einem einzelnen Bärtierchen zeigt, einschließlich sechs Frost-Tau-Zyklen und anschließender cDNA-Synthese. Proben können anschließend für die RT-PCR und qRT-PCR verwendet werden. (B) Bild der Mikropipettenverjüngung, die zur Entfernung von Wasser verwendet wird. Maßstabsbalken: 2 mm. (C) Hellfeldbild eines Bärtierchens in einer kleinen Wassermenge (gestrichelte Linie). Die Entfernung des größten Teils des Wassers in der angegebenen Menge ist für eine erfolgreiche Extraktion erforderlich und verhindert eine Verdünnung des Lysepuffers. Maßstab: 50 μm. (D) Das Bild zeigt das Eintauchen von Proben in flüssigen Stickstoff mit einer langen Pinzette, um die Proben schnell und sicher einzufrieren und aufzutauen. Ein Teil der Inhalte wurde in BioRender erstellt. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
HINWEIS: Abbildung 1A zeigt ein Schema des Verfahrens. Detaillierte Informationen zu den Kultivierungsverfahren für Bärtierchen und Algen finden Sie in den zuvor veröffentlichten Berichten 45,46,47.
1. Sterilisation von Quellwasser
<ol>
	<li>Gießen Sie 2 l Quellwasser aus einem 5-Gallonen-Wasserkrug (siehe Materialtabelle für Einzelheiten) in eine autoklavensichere 2-Liter-Glasflasche.</li>
	<li>Setzen Sie den Verschluss auf die autoklavensichere Flasche und verschließen Sie ihn mit einer kleinen Menge Autoklavenband. Ziehen Sie die Flasche nicht fest; Setzen Sie die Kappe darauf.</li>
	<li>Autoklavieren Sie das Quellwasser 50 Minuten lang in einem Nasszyklus ohne Trocknungsschritt.</li>
	<li>Lassen Sie das Wasser auf Raumtemperatur (RT) kommen und verschließen Sie die Kappe fest, bevor Sie sie bei RT lagern.</li>
</ol>
2. Ziehen der Mikropipette aus Glas (mit einem Pipettenabzieher)
<ol>
	<li>Befestigen Sie eine Mikropipette aus Glas (AD: 1 mm, ID: 0,58 mm, Länge: 10 cm) an einem Mikropipettenabzieher. Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Heizfaden, da dies die Form der Pipette verändert und den Faden beschädigt.<ol>
		<li>Bestimmen Sie das Ziehen der Pipette empirisch für jedes Filament und jeden Pipettenzieher. Als Ausgangspunkt für die Optimierung dienen jedoch 78 °C und ein einzelner Zugschritt mit einem Zuggewicht von 182,2 g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lassen Sie das Filament Hitze und Schwerkraft einwirken, um die Glasmikropipette in zwei Glasmikropipetten mit scharfen Spitzen zu trennen (Abbildung 1B).</li>
	<li>Bewahren Sie diese gezogenen Glasmikropipetten in einer geschlossenen 100-mm-Petrischale mit Wachs oder Ton auf, um sie an Ort und Stelle zu halten und ein Brechen der scharfen Spitzen zu verhindern.</li>
</ol>
3. Ziehen von Mikropipetten aus Glas (ohne Pipettenabzieher)
<ol>
	<li>Zünden Sie einen Bunsenbrenner oder eine andere kontrollierte Flammenquelle auf niedriger Stufe an.</li>
	<li>Nehmen Sie eine Mikropipette aus Glas mit einem Ende in jeder Hand.</li>
	<li>Halten Sie die Mitte der Glasmikropipette über die Flamme, bis das Glas zu schmelzen beginnt. Ziehe dann die beiden Enden schnell auseinander. Dadurch entstehen zwei sehr zarte, scharfe Spitzen.</li>
	<li>Brechen Sie die Spitze leicht mit einer sterilen feinen Pinzette.</li>
	<li>Bewahren Sie diese gezogenen Glasmikropipetten in einer geschlossenen 100-mm-Petrischale mit Wachs oder Ton auf, um sie an Ort und Stelle zu halten und ein Brechen der scharfen Spitzen zu verhindern.</li>
</ol>
4. RNA-Extraktion
<ol>
	<li>Beziehen Sie 0,5 l flüssigen Stickstoff in einem kryosicheren Behälter. ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff ist kryogenisch und kann Verbrennungen verursachen, wenn er Haut oder Augen ausgesetzt wird. Verwenden Sie bei der Handhabung Schutzkleidung, eine Spritzschutzbrille, Nitrilhandschuhe, Kryohandschuhe, einen Laborkittel und geschlossene Schuhe. Vergewissern Sie sich, dass der Behälter für flüssigen Stickstoff geeignet ist, bevor Sie die Flüssigkeit transportieren. Für diesen Schritt kann auch die Verwendung eines Ethanol-Trockeneisbades möglich sein.</li>
	<li>Stellen Sie einen cDNA-Synthese-Mastermix her: eine 10-μl-Lösung, die 1 μl zufälliger Hexamer-Primer, 2 μl DNase, 4 μl 5x RT-Puffer, 1 μl Enzymmix, 1 μl H2O und 1 μl 10 mM dNTPs enthält. Lagern Sie diese Lösung auf Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie den Bärtierchen-Lysepuffer (5 mM Tris (pH = 8), 0,5 % (v/v), Detergens 1, 0,5 % (v/v), Detergens 2, 0,25 mM EDTA in sterilem, nukleasefreiem Wasser vor. HINWEIS: Diese Lösung kann 6 Monate lang auf dem Labortisch gelagert werden. Bewahren Sie jedoch die Sterilität und vermeiden Sie potenzielle RNAse-kontaminierende Quellen.</li>
	<li>Aliquot genug Lysepuffer für Extraktionen (2 μL/ Bärtierchen).</li>
	<li>Geben Sie einen RNAse-Inhibitor in die Bärtierchen-Lysepufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 4 U/μl.</li>
	<li>Die Lösung wird bei RT auf einer Tischzentrifuge bei einer Geschwindigkeit von 2000 x g 5 s lang vortext und geschleudert, bevor die Lösung auf Eis gelagert wird.</li>
	<li>Mit einer sterilen P1000-Pipette mit Filterspitze werden so viele Bärtierchen, wie für den Versuch benötigt werden, aus der Kultur entnommen und in eine sterile 35-mm-Petrischale gegeben. HINWEIS: Es können beliebig viele Bärtierchen auf diese Weise verarbeitet werden. In der Regel werden drei Bärtierchen pro Zustand für die Extraktion verarbeitet.</li>
	<li>Waschen Sie die Bärtierchen dreimal mit 1 ml autoklaviertem sterilem Quellwasser und einer sterilen P1000-Pipette mit Filterspitze. Das langsame Auf- und Abpipettieren hilft, Algenverunreinigungen zu entfernen.</li>
	<li>Mit einem Präpariermikroskop bei 25- bis 50-facher Vergrößerung wird ein einzelnes Bärtierchen aus dieser gewaschenen Kultur mit einer sterilen P10-Pipette mit Filterspitze in eine neue sterile 35-mm-Petrischale übertragen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile P200-Pipette mit Filterspitze, um das einzelne Bärtierchen in 100 μl sterilem nukleasefreiem Wasser zu waschen. HINWEIS: Dieser Waschschritt wird verwendet, um Verunreinigungen, einschließlich Ribonukleasen, weiter zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie das gewaschene Bärtierchen mit einer sterilen P10-Pipette mit Filterspitze in 1-2 μl sterilem nukleasefreiem Wasser auf den Boden eines sauberen, sterilen PCR-Röhrchens und achten Sie dabei sorgfältig darauf, dass das Bärtierchen nicht an der Seite der Spitze klebt.</li>
	<li>Visualisieren Sie das Bärtierchen unter einem Präpariermikroskop bei 25-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Um die Wasserentnahme zu erleichtern, brechen Sie die Spitze der gezogenen Glasmikropipette leicht außerhalb des Röhrchens. Stellen Sie sicher, dass die Bohrung groß genug ist, um das Wasser hochzuziehen, aber nicht das Bärtierchen.</li>
	<li>Mit der Kapillarwirkung einer gezogenen Glasmikropipette wird das Wasser so lange entfernt, bis das Tier von einer kleinen Wasserblase mit einem Durchmesser von etwa zwei Bärtierchenlängen umgeben ist.</li>
	<li>Überwachen Sie den Wasserentnahmeprozess über das Präpariergerät, um sicherzustellen, dass der Wasserstand angemessen ist und das Bärtierchen hydratisiert bleibt. HINWEIS: Abbildung 1C zeigt ein Beispiel dafür, wie viel Wasser entfernt werden muss. Dies ist ein entscheidender Schritt. Eine kleine Wasserblase umgibt das Bärtierchen, um ein Austrocknen zu verhindern, aber so viel überschüssiges Wasser wie möglich sollte entfernt werden, um eine Verdünnung des Lysepuffers zu verhindern. Ein Beispiel für die verbleibenden Wasserstände finden Sie in Abbildung 1C.</li>
	<li>Unmittelbar nach dem Entfernen des Wassers 2 μl Bärtierchen-Lysepuffer auf den Boden des Röhrchens geben, kurz vortexen und das Röhrchen bei RT 5 s bei 2000 x g auf einer Tischzentrifuge zentrifugieren.</li>
	<li>Legen Sie die Proben, die die Bärtierchen enthalten, sofort in ein PCR-Röhrchengestell und stellen Sie sicher, dass sie vom Gestell fest gehalten werden.</li>
	<li>Fassen Sie das Gestell mit einer langen groben Pinzette an und tauchen Sie das Gestell mit den Proben vorsichtig in den flüssigen Stickstoff, bis es vollständig gefroren ist (Abbildung 1D).</li>
	<li>Nehmen Sie das Gestell vom flüssigen Stickstoff und legen Sie es sofort auf Eis. Lassen Sie die Probe auftauen (dauert ~45 s bis 1 min). Überwachen Sie die Probe alle 15 s, indem Sie sie aus dem Eis nehmen und sichtbar inspizieren. Sobald die Probe sichtbar transparent ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.18-4.19 noch fünfmal. Für eine maximale Lyse und Extraktion sind insgesamt sechs Gefrier-Auftau-Zyklen erforderlich (Abbildung 2A,B).</li>
	<li>Sobald das Einfrieren und Auftauen abgeschlossen ist, legen Sie die Proben auf Eis und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Frieren Sie die Proben zu diesem Zeitpunkt nicht zur Lagerung ein, da dies die verfügbare RNA für die cDNA-Präparation verringert.</li>
</ol>
5. cDNA-Synthese
<ol>
	<li>Geben Sie 2 μl cDNA-Synthese-Mastermix in das PCR-Röhrchen mit Bärtierchenlysat. Das Röhrchen kurz schnippen und mit einer Tischzentrifuge 5 s lang bei RT bei 2000 x g drehen, bevor die Proben wieder auf Eis gelegt werden.</li>
	<li>Die Proben werden in einen Thermocycler gegeben und 10 Minuten lang bei 25 °C zu Primern geglüht, 30 Minuten lang bei 55 °C zur reversen Transkription und schließlich Enzyme 5 Minuten lang bei 85 °C hitzeinaktiviert.</li>
	<li>Stellen Sie das Röhrchen nach der Inkubation sofort auf Eis und verdünnen Sie die Probe auf ein Gesamtvolumen von 25 μl, indem Sie 21 μl steriles nukleasefreies Wasser hinzufügen. Bei Transkripten mit niedriger Kopienzahl ist dieser Verdünnungsschritt wie empirisch bestimmt zu ändern.</li>
</ol>
6. qPCR
<ol>
	<li>Bestimmen Sie die Annealing-Temperatur des Primer-Sets unter Verwendung von Gesamt-RNA, die aus größeren Mengen von Bärtierchen hergestellt wurde, z. B. mit der in Boothby, 201843 vorgestellten Bulk-Extraktionsmethode.</li>
	<li>Führen Sie einen PCR-Temperaturgradienten durch, um die optimale Annealing-Temperatur zu bestimmen, bevor Sie die qRT-PCR ausführen (für alle in diesem Protokoll verwendeten PCR-Einstellungen siehe Tabelle 1 und Tabelle 2).</li>
	<li>Tauen Sie eine Tube des Indikatorfarbstoffs Super Mix auf Eis auf und isolieren Sie ihn vor Licht. Legen Sie eine 96-Well-qPCR-Platte auf Eis und geben Sie 5 μl Super Mix, 2 μl Wasser, 1 μl jedes Primers (10 μM) und 1 μl cDNA-Produkt in die gewünschte Anzahl von Wells.</li>
	<li>Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einer Plattenversiegelung und führen Sie die qRT-PCR mit einer für das Primer-Set geeigneten Glühtemperatur durch (für alle in diesem Dokument verwendeten qRT-PCR-Einstellungen siehe Tabelle 3).</li>
</ol>
7. Quantifizierung und Interpretation der Ergebnisse
<ol>
	<li>Vergleichen Sie die Ergebnisse quantitativ mit einem oder mehreren Kontroll-Housekeeping-Genen, von denen erwartet wird, dass ihre Expression unter den auferlegten Bedingungen konstant ist. Für diese Studie wurde das Aktin-Gen verwendet.</li>
	<li>Ermitteln und vergleichen Sie die Ct-Werte oder den Zyklusschwellenwert für jede Vertiefung mit den Ct-Werten der Genreaktionen der Kontrollkontrolle. Berechnen Sie die Faltungsänderung in der Genexpression mit der folgenden Gleichung: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;"> HINWEIS: Die Faltengenexpression wird für jedes Transkript und jedes Bärtierchen als 2-(ΔΔCt)48 aufgetragen.</li>
	<li>Um eine grobe Schätzung der Transkriptnummer aus demC-t-Wert zu erhalten, verwenden Sie die folgende Gleichung: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;"> Dabei ist N die Anzahl der Transkripte und 2 die angenommene PCR-Effizienz oder die Faltzunahme der Fluoreszenz pro Zyklus von PCR48.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierte RNA-Extraktion für die qRT-PCR bei individuellen Bärtierchen

<table><tbody><tr><td>10 & Mikro; L Premium-Barrierespitzen Steril</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td> mit geringer Bindung, bezeichnet <td>als P 10-Pipette mit Sterilfilter&nbsp; Spitzen</td></tr><tr><td>1000 &micro; L&nbsp; Premium-Pipettenspitzen, geringe Bindung, steril im Rack</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td>, <td>bezeichnet als sterile P 1000-Pipette mit Filterspitze&nbsp; Tipps</td></tr><tr><td>200 &micro; L&nbsp; Premium-Barrierespitzen Steril</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-412</td> mit geringer Bindung, auch bekannt <td>als P 200-Pipette mit Sterilfilterspitze&nbsp; Tipps</td></tr><tr><td>4 Sterne Gerade Starke Medium Point Pinzette&nbsp;</td><td>Excelta&nbsp;</td><td>00-SA-DC</td><td>bezeichnet als Long Pinzette</td></tr><tr><td>96-Well PCR Rack mit Deckel sortiert, 5 Racks/Einheit</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-202A</td><td>wird als PCR Rack</td></tr><tr><td>bezeichnet Andwin Scientific&nbsp; 3M BLEIFREIES AUTOKLAVENBAND 1"</td> <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC0802040</td><td>wird als Autoklavenband bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoklavenband</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td>bezeichnet als PCR Plattendichtungen</td></tr><tr><td>Benchling v8</td><td>Benchling</td><td>N/A</td><td>bezeichnet als Benchling&nbsp;</td></tr><tr><td>BioRadHard-Shell 96-Well-PCR-Platte</td><td>BioRad&nbsp;</td><td>HSS9641</td><td>wird als PCR-Platte bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>BULWARK FR Laborkittel:&nbsp;</td><td>Grainger&nbsp;</td><td>26CF64</td><td>wird als Lab Coat</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad Thermocycler bezeichnet&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td> als <td>Thermocycler bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad Thermocycler mit CFX Optikmodul&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td> wird <td>als qPCR-Thermocycler bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroccoccum hypnosporum.&nbsp; &nbsp;</td><td>Carolina</td><td>152091</td> als <td>Algae</td></tr><tr><td>Corning bezeichnet&nbsp; PYREX Mehrweg-Aufbewahrungsflaschen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td>Bezeichnet als autoklavensicherer 2-Liter-Glasflaschen-Daigger</td></tr><tr><td>& Unternehmen Vortex-Genie 2 Labormischer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>3030A</td><td>, wird als Vortexer bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Direkt-zol-Mikrovorbereitung &nbsp;</td><td>Zymo Forschung&nbsp;</td><td>R2060</td><td>wird als RNA-Extraktionskit bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont 5 Biologie Pinzette</td><td>Feine Wissenschaft Werkzeuge&nbsp;</td><td>11254-20</td><td>wird als feine Pinzette</td></tr><tr><td>EDTA bezeichnet;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500&nbsp;</td><td>Bezeichnet als EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>FIJI v 2.14.0/1.54f&nbsp;</td><td>ImageJ,N</td><td>/A</td><td>Bezeichnet als FIJI/ImageJ</td></tr><tr><td>Filament für Pippette Puller&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td><td>wird als Filament</td></tr> bezeichnet <tr><td>Fisherbrand Economy Impact Goggles</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-181-501</td> wird <td>als Splash Goggles bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Glas-Mikropipette AD 1mm ID 0,58, Länge 10 cm</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&nbsp;</td><td>Bezeichnet als Mikropipette aus Glas</td></tr><tr><td>Hypsibius exemplaris Z151 Stamm&nbsp;</td><td>Carolina</td><td>133960</td><td>Bezeichnet als Bärtierchen&nbsp; oder H. exemplaris&nbsp;</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff Dewar 1 L</td><td>Agar Wissenschaftlich</td><td>AGB7475</td><td>wird als kryosicherer Behälter bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Maxima H Minus Erststrang-cDNA-Synthesekit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific K1651</td><td>wird als cDNA-Synthese-Mastermix bezeichnet.</td></tr><tr><td>Narishige Zweistufiger Mikropipettenabzieher aus Glas&nbsp;</td><td>Tritech Forschung</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>wird als Mikropipettenzieher bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Nitrilhandschuhe</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-000-314</td><td>wird als Nitrilhandschuhe bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>PETRISCHALE, PS, 35/10 mm, MIT ÖFFNUNGEN</td><td>Grenier</td><td>627102</td><td>Bezeichnet als 35 mm Petrischale&nbsp;</td></tr><tr><td>PIPETMAN P10, 1&ndash; 10 & Mikro; L, Metallauswerfer</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td> als <td>P 10 Pipette</td></tr><tr><td>bezeichnet PIPETMAN P1000, 100&ndash; 1000 &Mikro; L, Metallauswerfer</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td> als <td>P 1000 Pipette</td></tr><tr><td>bezeichnet PIPETMAN P200, 20&ndash; 200 & Mikro; L, Metall-Auswerfer</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F144058M</td><td>als P 200 bezeichnet</td></tr>, klopfen <tr><td>Sie diese 4-Farben-Modelliermasse&nbsp;</td><td>Amerikanischer Wissenschaftsüberschuss</td><td> 96517P001</td><td>bezeichnet als Clay&nbsp;</td></tr><tr><td>Prisma v10.0&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>bezogen auf ein Prisma&nbsp;</td></tr><tr><td>RNAse-frei, 8 Streifen 0,2 mL PCR-Röhrchen mit Kappen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM12230</td><td>als steriles PCR-Röhrchen</td></tr><tr><td>bezeichnet RNasin Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega&nbsp;</td><td>N2111</td><td>wird als RNAse Inhibitor bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Quellwasser&nbsp;</td><td>Nestlé Pure Life</td><td>44221229</td> bezeichnet <td>als Quellwasser</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td> bezeichnet <td>als Indikatorfarbstoff Super Mix&nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomikroskop-System mit Optik und Beleuchtung</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1</td><td>wird als Präpariermikroskop</td></tr><tr><td>bezeichnet Supertek Scientific&nbsp; Tirrill-Brenner</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S09572B</td> auch als <td>Bunsenbrenner bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Qualitron</td><td>&nbsp; DW-41-115-NEW</td><td>wird als Tischzentrifuge bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Tempshield&nbsp; Kryo-Handschuhe</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-305</td>, <td>auch bekannt als Kryo-Handschuhe&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Nunc Petrischalen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>Bezeichnet als 100 mm Petrischale&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-500&nbsp;</td><td>Wird als Tris oder Tris Base bezeichnet&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>93443</td><td>wird bezeichnet als Waschmittel 1&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma aldrich</td><td>P1379-500&nbsp;</td><td>Bezeichnet als Detergent 2</td></tr><tr><td>Wasser - PCR/RT-PCR-zertifiziertes, nukleasefreies</td><td>Growcells</td><td>PCPW-0500</td><td>wird als steriles nukleasefreies Wasser bezeichnet</td></tr></tbody></table>

eintierische, einröhrige rna-extraktion zum vergleich der relativen transkriptspiegel mittels qrt-pcr im bärtierchen hypsibius exemplaris

Single-Animal, Single-Tube RNA Extraction for Comparison of Relative Transcript Levels via qRT-PCR in the Tardigrade Hypsibius exemplaris

Entwicklung und Optimierung der Extraktion von Single-Tardigrade-RNA Durch die Anpassung des Protokolls von Ly et al., 201542 für die RNA-Extraktion bei Bärtierchen wird das STST-System optimiert, um die Quantität und Qualität des Präparats zu maximieren (Abbildung 1A). Die RT-PCR wurde für Aktin-Transkripte durchgeführt, wobei die Transkriptausbeute durch Amplifikation einer 527 bp-Region, die die Exons 1 und 2 umfasste, quantifiziert wurde (Seque...

Eintierische, einröhrige RNA-Extraktion zum Vergleich der relativen Transkriptspiegel mittels qRT-PCR im Bärtierchen Hypsibius exemplaris

The tardigrade Hypsibius exemplaris is an emerging model organism renowned for its ability to survive environmental extremes. To explore the molecular ...

single-animal-single-tube-rna-extraction-for-comparison-relative

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Drosophila-Flugmuskeln werden als Modellsystem für Muskelentwicklung und Physiologie verwendet. Dieses Video beschreibt die Flugmuskulatur von Erwachsenen und zeigt ein Protokoll zur Dissektion der sich entwickelnden indirekten Flugmuskulatur, die für die RNA-Sequenzierung von Puppen geeignet ist.

Drosophila Dissektion des späten indirekten Flugmuskels (IFM): Eine Methode zur Gewebeentnahme mit hohem Durchsatz

Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, die zelltypspezifische Translation von mRNA zu erfassen. Hier berichten wir über das erste TRAP-Protokoll, das sich der Isolierung von mRNA in seltenen Zellpopulationen von Drosophila-Embryonen widmet.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Ein Protokoll zur Quantifizierung von bakteriellen 16S rRNA-Genen und Transkripten aus Küstensedimenten mittels Echtzeit-PCR wird bereitgestellt. Die Methodik umfasst die Co-Extraktion von DNA und RNA; Herstellung von DNA-freier RNA; und Quantifizierung von 16S rRNA-Genen und -Transkripten mittels RT-q-PCR, einschließlich Standardkurvenkonstruktion.

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Kontamination während der Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Organismen bleibt ein großes Problem. Hier zeigen wir eine Methode um das Genom der Bärtierchen aus einem einzigen Exemplar mit so wenig wie 50 Pg genomic DNA ohne Verstärkung des gesamten Genoms zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu sequenzieren.

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung von RNA, DNA und Proteine aus der gleichen Probe in einer Bemühung zu reduzieren Variation, Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Interpretationen zu erleichtern.

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt einen effektiven In-situ-Hybridisierungsansatz, um die mRNA-Expressionsniveaus und räumlichen Muster von Zielgenen in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu erkennen.

In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In diesem Artikel wird ein Hochdurchsatzprotokoll zur schnellen und zuverlässigen Bestimmung der Genexpressionsniveaus in einzelnen oder massenhaften C. elegans Proben beschrieben. Dieses Protokoll erfordert keine RNA-Isolierung und erzeugt cDNA direkt aus Proben. Es kann zusammen mit hochdurchsatzigen multiplexed nanofluidischen Echtzeit-qPCR-Plattformen verwendet werden.

Quantitative RT-PCR mit hohem Durchsatz in Einzel- und Bulk-C. elegans Proben mit Nanofluidic-Technologie

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zelltypspezifisch translatierende ribosomale mRNAs mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren.

Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aufzuchtmethode von tortriciden Schädlingsinsekten in den Laboratorien. Die Verfahren zur Unterscheidung des Geschlechts von Insekten und zum Extrahieren von Nukleinsäuren für die Hochdurchsatzsequenzierung werden unter Verwendung von zwei Tortricid-Schädlingen festgelegt.

Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen

Erfahren Sie eine schnelle RNA-Extraktionsmethode für einzelne Hypsibius exemplaris zur Analyse relativer Transkriptspiegel mittels qRT-PCR. Diese Technik ermöglicht effiziente Genexpressionsstudien.

Eintierische, einröhrige RNA-Extraktion zum Vergleich der relativen Transkriptspiegel mittels qRT-PCR im Bärtierchen Hypsibius exemplaris (Video) | JoVE Journal

Eintierische, einröhrige RNA-Extraktion zum Vergleich der relativen Transkriptspiegel mittels qRT-PCR im Bärtierchen Hypsibius exemplaris

Weitere Videos entdecken