Name: Rasterkraftmikroskopische Messungen von Knorpel in intakten und regenerierenden Axolotl-Gliedmaßen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Erfahren Sie, wie AFM-Messungen mechanische Eigenschaften von Axolotl-Knorpel in regenerierenden Gliedmaßen quantifizieren. Diese Methode liefert wichtige Erkenntnisse über mechanische Signale in der Geweberegeneration.

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<meta charset="utf8"></head><body>Mechanische Charakterisierung der Gewebesteifigkeit während der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Affinity Designer</td><td>Affinität</td><td>&nbsp; Version 1.10.4</td><td>Für die Figurenzusammenstellung</td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td>Für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Zur Färbung von Gewebe</td></tr><tr><td>Axiozoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zur Abbildung von Proben unter dem AFM</td></tr><tr><td>Benzocain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Zur Betäubung der Tiere</td></tr><tr><td>Butorphanol (+)-Tartrat Salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; B9156</td><td>Als Analgetikum</td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow TL1</td><td>Für AFM-Indentationsmessungen</td></tr><tr><td>Cellhesion 200 Aufbau mit einem Motortisch</td><td>JPK/Bruker</td><td></td><td>Für AFM-Indentationsmessungen</td></tr><tr><td>CellSense Entry</td><td></td><td></td><td>Für die Bildgebung im Stereoskop Olympus UC90</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Zur Reinigung von Proben und Schnitten unter Vibratom</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ2)</td><td>https://imagej.net/software/fiji</td><td>Version 2.9.0/1.53t</td><td>Für</td></tr><tr>die<td>Bildverarbeitung GraphPad</td><td>Prism GraphPad Software</td> <td>(Version 8.4.3)</td><td>Zur grafischen Darstellung und statistischen Analyse der</td></tr><tr><td>Daten Wärmeinaktiviertes FBS</td><td>Gibco 10270-106</td><td></td><td>Für Zelle Nährmedium</td></tr><tr><td>Histoacryl-Kleber (2-Butyl-Cyanacrylat)</td><td>Braun</td><td></td><td>Zum Aufkleben von Proben auf Petrischalen</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>Zum Färben von Gewebe</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>Für Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Inverses konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>780 LSM</td><td>Zum Abbilden von Gewebeschnitten</td></tr><tr><td>Inverses konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>980 LSM</td><td>Zur Abbildung von Gewebeschnitten</td></tr><tr><td>JPK/Bruker Datenverarbeitungssoftware</td><td>JPK/Bruker</td><td>SPM 6.4</td><td>Zur Analyse von Kraft-Weg-Kurven</td></tr><tr><td>L15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma</td><td>L1518</td><td>Für Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Für Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Für Zellen Nährmedium</td></tr><tr><td>Polystyrolkügelchen ( 20 & micro; m Durchmesser); )</td><td>microParticles</td><td></td><td>Für AFM-Eindringmessungen</td></tr><tr><td>Pyjibe</td><td>geschrieben von Paul M&uuml; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe</td><td>0.15.0</td><td>Für viskoelastische Analysen</td></tr><tr><td>Stereoskop Olympus SX10</td><td>Olympus</td><td>SX10</td><td>Für Amputationen von Gliedmaßen und Gewebemontage</td></tr><tr><td>Stereoskop Olympus UC90</td><td>Olympus</td><td>UC90</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>Vibratome Leica</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td>Für Gewebeschnitte</td></tr></tbody></table>

rasterkraftmikroskopische messungen von knorpel in intakten und regenerierenden axolotl-gliedmaßen

Atomic Force Microscopy Measurements of Cartilage in Intact and Regenerating Axolotl Limbs

Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls maßen wir den scheinbaren Elastizitätsmodul von knorpeligem Axolotl-Gliedmaßengewebe unter homöostatischen ("intakten") Bedingungen, während der frühen Knorpelhistolyse und späterer Knorpelkondensationsstadien (Abbildung 1A). Wir untersuchten auch die mechanischen Eigenschaften der Skelettelemente in verschiedenen Regionen, einschließlich ihres Zentrums und ihrer Peripherie, wie in den Bildern zu sehen ist, die die Auslegerposition darstellen (Abbildung 1B). Um die Gewebearchitektur darzustellen und mit Steifigkeitsmessungen zu korrelieren, wurden entweder transversale Gewebeschnitte oder der Gewebeblock, in dem die Messungen durchgeführt wurden, fixiert und mit Alexa Fluor 488-konjugiertem Phalloidin bzw. Hoechst auf Aktinfilamente und -kerne gefärbt (Abbildung 1C). Bei intakten Gliedmaßen ist der Radius deutlich größer als bei der Elle, aber beide knorpeligen Skelettelemente haben eine ähnliche Morphologie, mit gleichmäßig verteilten runden Kernen in der Mitte, umgeben von einem Ring abgeflachter Kerne, der dem Perichondriumentspricht 24. Während der Histolysephase wurden dramatische Veränderungen in der Gewebearchitektur festgestellt, mit unorganisierten und weniger dicht gepackten Kernen innerhalb der Skelettelemente. In der späteren Knorpelkondensationsphase organisieren sich die Zellkerne wieder, mit einer klaren Abgrenzung zwischen dem neu gebildeten Knorpel und dem umgebenden regenerierenden Gewebe. In diesem Stadium sind die meisten Kerne jedoch abgeflacht, und es gibt keine klaren morphologischen Unterschiede zwischen Zentrum und Peripherie.
Bei der Messung von Querschnitten beider Skelettelemente, die in der zeugopodialen Region vorhanden sind (Radius und Ulna), wurden ununterscheidbare scheinbare Young-Module in intakten Gliedmaßen mit Medianwerten von 10,95 ± 11,69 kPa bzw. 15,71 ± 6,49 kPa nachgewiesen (Abbildung 2D, links), was mit ihren anatomischen Ähnlichkeiten übereinstimmt (Abbildung 1C). Interessanterweise zeigte die Analyse des Knorpelzentrums vs. der Peripherie, dass unter intakten Bedingungen die scheinbaren Elastizitätsmodule in der Mitte höher waren als in der Peripherie, mit Medianwerten von 16,48 ± 6,86 kPa gegenüber 7,53 ± 4,63 kPa (Abbildung 2E, links). Am Tag 5 nach der Amputation, entsprechend der Histolysephase, nahmen die scheinbaren Elastizitätsmodule im Radius und in der Ulna deutlich ab (0,03 ± 0,02 kPa bzw. 0,13 ± 0,09 kPa, Abbildung 2D, rechts), aber auch die Unterschiede zwischen Zentrum und Peripherie verschwanden, wobei die medianen Elastizitätsmodule bei 0,11 ± 0,07 kPa bzw. 0,27 ± 0,34 kPa lagen (Abbildung 2E, rechts). Bei der Analyse der Knorpeleigenschaften während einer späteren Regenerationsphase, zu dem Zeitpunkt, an dem der Knorpel zu kondensieren beginnt, wurde ein signifikanter Anstieg der scheinbaren Elastizitätsmodule festgestellt, die Zwischenwerte zwischen der intakten und der histolytischen Phase erreichten (0,77 ± 0,29 kPa, Abbildung 2F).
Wie in den bereitgestellten Beispielkurven (Abbildung 2B) zu sehen ist, trat zwischen den meisten Annäherungs- und Retraktionskurvenpaaren eine Hysterese auf, was auf eine viskoelastische Reaktion des Gewebes unter Kraft hinweist. Darüber hinaus machten wir uns daran, die viskoelastischen Eigenschaften der verschiedenen Gewebe genauer zu analysieren. Da oszillatorische Messungen über mehrere Frequenzen zeitaufwändig und in Bezug auf die Erhaltung der Gewebeintegrität etwas kritisch sind, insbesondere bei der Kartierung mehrerer Geweberegionen, haben wir eine zuvor veröffentlichte Methode von Abuhattum et al. verwendet, die es ermöglicht, den Annäherungsteil von Kraft-Weg-Kurven anzupassen, bevor der Cantilever sofort zurückgezogenwird 26. Das Modell basiert auf Kelvin-Voigt Maxwell-Modellelementen und wurde bereits für die Analyse der viskoelastischen Eigenschaften von Zellen und Hydrogelen26 sowie von Pankreasgewebe27 eingesetzt. Mediane unentspannte Module (Intakt: 23,05 kPa, Histolyse: 0,20 kPa und Kondensationsknorpel: 1,60 kPa) und scheinbare Young-Module (Intakt: 17,54 kPa, Histolyse: 0,07 kPa und Kondensationsknorpel: 1,54 kPa), die für Gewebe in den verschiedenen Stadien der Regeneration abgeleitet wurden, zeigten signifikante Unterschiede (Abbildung 2G-H). Insgesamt wurde bei der gewählten Verformungsrate eine überwiegend elastische Reaktion des Gewebes auf Verformung beobachtet, was sich in der großen Ähnlichkeit von unentspannten und scheinbaren Elastizitätsmodulen widerspiegelt (Abbildung 2G,H). Signifikant niedrigere mediane scheinbare Viskositätswerte wurden für das histolytische Stadium (0,72 Pa·s) im Vergleich zum intakten (2,06 Pa·s) und kondensierenden Knorpelstadium (2,32 Pa·s) erhalten (Abbildung 2I). Wie erwartet, stimmten die scheinbaren Young-Module der PyJjibe-Analyse (Abbildung 2H) in hohem Maße mit den Werten überein, die von der JPK-Datenverarbeitungssoftware erhalten wurden (Abbildung 2F).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die mechanische Charakterisierung die dynamische Gewebeumstrukturierung während des Regenerationsprozesses widerspiegelt. Diese Messungen stimmen mit den anatomischen Beobachtungen überein, bei denen die Gewebesteifigkeit zusammen mit den beobachteten Veränderungen in der Gewebearchitektur abnimmt (Abbildung 1C) und während der Regeneration allmählich wiedererlangt wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Eindringmessungen des Axolotl-Gliedmaßenknorpels während der Regeneration. (A) Schematische Darstellung der Regenerationsstadien. Die gestrichelte Linie zeigt die ungefähre Stelle des durch Vibrationen erzeugten Querschnitts, an der die Messungen durchgeführt wurden. (B) Repräsentative Bilder der mittleren (oben) und peripheren (unten) Messungen im Gliedmaßenknorpel. Die schwarze Spitze ist der Ausleger. Maßstabsbalken: 100 μm. (C) Gewebearchitektur in intakten Gliedmaßen (links), in der Histolyse befindliches Gewebe (Mitte) und kondensierender Knorpel (rechts). Grün: Zellkerne (Hoechst), magenta: Aktinfilamente (Phalloidin). Maßstabsleiste: 500 μm. C' vergrößerter Bereich im Panel. Maßstab: 100 μm. Die Eindruckgitter von 70 μm x 70 μm werden durch weiße (Mitte) und gelbe (periphere) gestrichelte Quadrate gekennzeichnet. In den Feldern B und C geben die Buchstaben R und U den Radius bzw. die Ulna an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5.jpg"> Abbildung 2: Messung der Knorpelsteifigkeit während der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen mit AFM. (A) Schematische Darstellung des AFM-Eindringexperiments als Kraft in Abhängigkeit von der Zeit (oben) und Kraft als Funktion des Abstands zwischen dem Eindringkörper und der Probe (unten). An- und Rückzugskurven werden in Blau bzw. Rot dargestellt. Der Kontaktpunkt wird durch eine schwarze vertikale gestrichelte Linie dargestellt. Die Kraft-Eindringkurven wurden in den Anflugteil der Kurve eingepasst, entweder unter Verwendung des Hertz/Sneddon-Modells (JPK-Datenverarbeitungssoftware und Pyjibe) oder der viskoelastischen KVM-Modellerweiterung in Pyjibe. (B) Repräsentative Kraft-Weg-Kurven aus AFM-Messungen in intakten und regenerierenden Gliedmaßen während der Histolyse- und Kondensationsknorpelstadien. Der Prozentsatz der analysierbaren Kurven (d. h. ohne Artefakte) wird in der oberen rechten Ecke jeder Kurve angezeigt. (C) Beispiele für typische Artefakte in Kraft-Eindruck-Kurven, z. B. aufgrund eines unsachgemäßen Kontakts des Eindringkörpers mit der Oberfläche. Die gezeigten Beispiele beziehen sich auf intakte Gliedmaßen, aber gleichwertige Arten von Artefakten wurden unter allen Bedingungen beobachtet. Für B-C: Repräsentative Kraft-Weg-Kurven wurden mit Pyjibe angepasst und angezeigt. Die hellblaue Kurve stellt den Anflugteil der Kurve dar, und die hellrote Kurve ist der Rückzugsteil. Die dunklere blaue Linie ist das aufgetragene Hertz/Sneddon, das für einen kugelförmigen Eindringkörper geeignet ist. Die entsprechenden Residuen aus der Passung sind unten für die unteren Kraft-Weg-Kurven dargestellt. Dargestellte Residuen stellen die Differenz zwischen den Werten für die Anpassung und die tatsächliche Kraft dar. (D) Scheinbare Elastizitätsmodule des Radius und der Ulnazentren, gemessen an intakten Gliedmaßen, die sich in der Histolyse befinden. (E) Scheinbare Elastizitätsmodule des Knorpelzentrums gegenüber der Peripherie (Peri) bei intakten Gliedmaßen und während der Histolyse. (F) Scheinbare Young-Module, gemessen für das Knorpelzentrum in den analysierten Stadien der Regeneration. Für D-F: Jeder Punkt wird von einer erfolgreich analysierten Kraft-Weg-Kurve abgeleitet, und größere Punkte entsprechen den Medianwerten pro Probe. Die scheinbaren Elastizitätsmodule wurden unter Verwendung der Hertz/Sneddon-Modellanpassung der JPK Bruker-Software erhalten. (G-I) Unentspannter Modul (G), scheinbarer Elastizitätsmodul (H) und scheinbare Viskosität (I), berechnet mit PyJibe (KVM-Erweiterung) aus Knorpelzentrumsmessungen in den analysierten Regenerationsstadien. Jeder Punkt wird von einer erfolgreich analysierten Kraft-Weg-Kurve abgeleitet. Die Linien entsprechen den Medianwerten aller Messungen pro Bedingung. Für D-I: Kruskal-Wallis mit Dunns Mehrfachvergleichstest. Unterschiedliche Buchstaben stehen für Bedingungen, die sich statistisch voneinander unterscheiden (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Rasterkraftmikroskopische Messungen von Knorpel in intakten und regenerierenden Axolotl-Gliedmaßen

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