Name: Überwachung der Leucin-reichen Repeat-haltigen 8-Kanal-Aktivität (LRRC8/VRAC) mittels sensibilisiertem Emissions-Förster-Resonanz-Energietransfer (SE-FRET) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Erfahren Sie die FRET-basierte Überwachung von LRRC8/VRAC-Kanalaktivität in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht nicht-invasive Untersuchungen osmotischer Regulation und subzellulärer Prozesse.

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<meta charset="utf8"></head><body>FRET-basierte Methode zur Überwachung der LRRC8-Kanalaktivität ohne Elektrophysiologie

Ionenkanäle, die aus Heteromeren von Proteinen der leucinreichen Repeat-8-Familie (LRRC8) bestehen, sind in allen Wirbeltierzellen zu finden und an einer Vielzahl physiologischer Funktionen beteiligt 1,2. Diese LRRC8-Kanäle, die zunächst als volumenregulierte Anionenkanäle (VRACs) oder volumensensitive nach außen gleichrichtende Kanäle (VSOR) identifiziert wurden, spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären regulatorischen Volumenabnahme 3,4. Sie erleichtern den Ausstoß von Chloridionen und organischen Osmolyten, woraufhin als Reaktion auf osmotische Quellung Wasserausfluss folgt. Neben ihrer Rolle bei der osmotischen Stressreaktion wurde ihre Rolle bei der zellulären Volumenregulation mit Zellproliferation und -migration, Apoptose, Spermiogenese und epithelialer Integrität in Verbindung gebracht 5,6,7. Es wurde gezeigt, dass die Veränderung des Membranpotentials bei LRRC8/VRAC-Aktivierung zur Differenzierung der Myotuben8 und zur Insulinsekretion durch Pankreas-β-Zellenbeiträgt 9,10,11. Darüber hinaus leiten LRRC8-Kanäle eine Vielzahl organischer Osmolyte wie die purinergen Signalmoleküle ATP und cGAMP oder die exzitatorische Aminosäure Glutamat, wodurch diese Kanäle in der Zell-Zell-Kommunikation im Immunsystem oder in der Glia-Neuronen-Interaktion platziertwerden 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Auch Xenobiotika, wie der Farbstoff Fluorescein, das Antibiotikum Blasticidin S oder das Krebsmedikament Cisplatin, werden über die LRRC8-Kanälegeleitet 23,24,25.
Es gibt zahlreiche Berichte über die Signaltransduktion, die zur Aktivierung von LRRC8/VRAC führte 26,27,28. Der Mechanismus bleibt jedoch unklar, und die Literatur präsentiert ein breites Spektrum potenzieller Mechanismen, die von dem spezifischen physiologischen Prozess abhängen könnten. Dazu gehören Änderungen der zytosolischen Ionenstärke, der Wechselwirkung mit dem Zytoskelett, der Membranzusammensetzung, der G-Proteine, des Redoxzustands und der Phosphorylierungskaskaden 2,27,29,30,31.
LRRC8/VRAC-Kanäle enthalten LRRC8A als essentielle Untereinheit 3,4, die mit mindestens einem ihrer Paraloge LRRC8B-E heteromerisieren muss, um physiologisch funktionelle Kanäle 4,14,32 zu bilden. Die Zusammensetzung der Untereinheiten bestimmt die biophysikalischen Eigenschaften des Kanals, wie z. B. die rektifikations- und depolarisationsabhängige Inaktivierung 4,29,32,33,34, die Substratspezifität 15,17,20,21,24,35 und einige Aktivierungswege 36,37. Strukturen der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zeigen, dass LRRC8A-Homomere sowie Heteromere als Hexamere anlagern 38,39,40, während LRRC8A/LRRC8C-Chimären, die funktionelle Kanäle bilden, Heptamere sind 41. Der N-terminale Teil aller LRRC8-Proteine besteht aus vier Transmembran-Helices, und der C-terminale Teil enthält eine Domäne mit leucinreichen Repeats (LRRD). Die verfügbaren LRRC8-Komplexstrukturen liefern Hinweise darauf, dass die LRRDs, die sich in das Zytosol 3,4,23 erstrecken, während des Kanal-Gating Konformationsumlagerungen erfahren können 34,42,43. Diese Annahme wird durch die Erkenntnis bestätigt, dass die C-terminale Fusion fluoreszierender Proteine zu einer basalen Kanalaktivitätführt 14 und dass die Bindung von Nanobodies an die Domänen die Kanalaktivität modulieren kann44. Darüber hinaus wurden Konformationsänderungen der C-Termini durch den intra-komplexen Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)45 gezeigt.
Die gebräuchlichste Methode zur Untersuchung der Ionenkanalaktivität sind elektrophysiologische Messungen46, die bei der Untersuchung von VRACs vor ihrer molekularen Identifizierung ausgiebig angewendet wurden47. Es gibt jedoch verschiedene zusätzliche Möglichkeiten, die VRAC-Aktivität indirekt zu überwachen, einschließlich der Messung seiner leitungsgebundenen Substrate - Halogenidionen oder organische Osmolyte - oder seiner Wirkung auf das Zellvolumen48. Tatsächlich beruhte die Identifizierung von LRRC8-Proteinen als VRAC auf einem Assay, der auf dem Quenchen eines halogenidempfindlichen fluoreszierenden Proteins49 durch Jodid basierte, das durch aktivierte VRACs 3,4 in die Zelle gelangte. Eine andere Methode zur Überwachung der LRRC8/VRAC-Kanalaktivität nutzt die Bewegung der zytosolischen Domänen, die wie in anderen Ionenkanälen 50,51,52,53 durch Änderungen in FRET 45 beobachtet werden kann. Zu diesem Zweck wurden fluoreszierende Proteine, die als FRET-Paare dienen, wie das cyan-fluoreszierende Protein (CFP)/mCerulean3 als Donor und das gelb-fluoreszierende Protein (YFP)/mVenus als Akzeptor, mit den C-Termini der LRRC8-Proteine fusioniert (Abbildung 1). Intra-komplexe FRET zwischen LRRC8-Untereinheiten wurde durch Akzeptor-Photobleichexperimentegezeigt 45. Unter Vermeidung des destruktiven Photobleichverfahrens wurden FRET-Veränderungen im Laufe der Zeit durch sensilizierte Emissions-FRET (SE-FRET) überwacht, wobei grundsätzlich die sensibilisierte Emission des Akzeptors bei Anregung des Donors aufgrund der Überlappung des Emissionsspektrums des Donors mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors gemessen wird. Die Anwendung der extrazellulären Hypotonie, einem Stimulus für die LRRC8/VRAC-Aktivierung, führte zu einer reversiblen Verringerung der SE-FRET-Intensität45. Wichtig ist, dass gleichzeitige Ganzzell-Patch-Clamp-Messungen und FRET-Überwachung während der hypotonen Behandlung zeigten, dass diese Verringerung der FRET tatsächlich die LRRC8/VRAC-Aktivierung widerspiegelte45. Diese Methode, die eine Störung der Plasmamembran oder eine Veränderung der intrazellulären Umgebung durch Pipettenlösung vermeidet, bietet eine Alternative zur Überwachung der LRRC8/VRAC-Aktivität. Es ist besonders nützlich in physiologischen Umgebungen, in denen die Aufrechterhaltung des nativen Cytosols entscheidend ist, eine subzelluläre Auflösung erforderlich ist oder eine längere Beobachtung der Kanalaktivität erforderlich ist.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung von LRRC8/VRAC mit einer solchen FRET-basierten Auslesung vor. Das Protokoll beschreibt, wie Zellen gehandhabt und transfiziert werden, wie Proben- und Kontrollbilder erfasst werden, wie die Daten analysiert werden und wie die Werte für sensibilisierte Emissions-Fret (SE-FRET) berechnet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig01v2.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des LRRC8 FRET-Paarsystems. mCerulean3 ist in Cyan und mVenus in Gelb dargestellt. Nach der VRAC-Öffnung ändert sich der Abstand (und/oder die räumliche Orientierung) zwischen den Fluorophoren, was zu einem verringerten Energietransfer zwischen Donor (Don) und Akzeptor (Acc) führt und damit die beobachtete FRET senkt. Erstellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Kamera DFC9000GTC</td><td>Leica</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18aa-YFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Geschenk von C.F. Kaminski (University of Cambridge, UK)</td></tr><tr><td>Cycloheximid (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Kochsalzlösung)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Emissionsfilterrad (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)</td><td>Leica</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Filterwürfel CYR71010</td><td>Leica</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenkulturschalen 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>Säugetier-Gebärmutterhalskarzinom/ Gewonnen vom Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Disch 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Kaliumchlorid)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET Wizard</td><td>Leica</td><td></td><td></td>11640862</tr><tr><td>Lichtquelle LED8</td><td>Leica</td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automated Cell Counter</td><td>logos biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides</td><td>logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Magnesiumchlorid)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop THUNDER Imager lebende Zellen</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchlorid)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv HC PL APO 63x/1.40 ÖL</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (Pen Step)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tumornekrosefaktor (TNF)-a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>Ventilgesteuertes Schwerkraftperfusionssystem</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung der leucin-reichen repeat-haltigen 8-kanal-aktivität (lrrc8/vrac) mittels sensibilisiertem emissions-förster-resonanz-energietransfer (se-fret)

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

Mit dieser FRET-basierten Methode kann die LRRC8/VRAC-Aktivität während der osmotischen Stimulation überwacht werden, und die Reduktion der SE-FRET korreliert mit dem Grad der extrazellulären Hypotonie45. Hier sind auch repräsentative Ergebnisse für die hypotonieinduzierte Kanalaktivierung dargestellt (Abbildung 3 und Abbildung 4). Darüber hinaus kann eine LRRC8/VRAC-Aktivierung durch verschiedene isosmotische Stimuli, wie z.B. die Manipulation des Diacylglycerin-Signalwegs45 oder während der Myozytenaktivierung56, beobachtet werden.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig04.jpg"> 
Abbildung 4: SE-FRET-Spuren. (A) Scheinbare SE-FRET-Spuren aus 5 unabhängigen Experimenten. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von N = 2 bis N = 7 Zellen pro Sichtfeld (FOV) dar. (B) Mittlere ± SD aller Zellen (N = 31 Zellen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Da LRRC8/VRAC-Kanäle auch an der apoptotischen Volumenabnahme beteiligt sind24,57, wäre die Beobachtung der Kanalaktivität bei Induktion der Apoptose eine weitere Anwendung für das hier beschriebene Verfahren. Dementsprechend wurde das Protokoll zur Überwachung von SE-FRET in HeLa-Zellen, die LRRC8A-mCerulean3 und LRRC8E-mVenus exprimieren, unter Anwendung von Todesrezeptor-vermittelten Apoptose-induzierenden Arzneimitteln durchgeführt. Es wurde bereits gezeigt, dass Tumornekrosefaktor (TNF)-α und Cycloheximid (CHX) innerhalb weniger Minuten VRAC-Ströme hervorrufen58. Nach der Zugabe von 2 ng/ml TNF-α und 1 μg/ml CHX in isotonischem Puffer kam es zu einer robusten Abnahme des SE-FRET (Abbildung 5). Ersetzte man den Puffer durch ein hypertonisches Medium, obwohl es TNF-α und CHX enthielt, erholten sich die SE-FRET-Werte nahe dem Ausgangswert (Abbildung 5A), was einer Abnahme der VRAC-Ströme in der hypertonen Badlösung während der Behandlung mit dem Apoptose-induzierenden Fas-Liganden58 entspricht. Die Behandlung der Zellen mit DMSO, dem Lösungsmittel für TNF-α und CHX, führte nicht zu einer SE-FRET-Reduktion. TNF-α + CHX beeinflusste nicht die SE-FRET von CFP-18aa-YFP, einem EYFP- und ECFP-Tandemkonstrukt als FRET-Kontrolle59, was die Spezifität für LRRC8/VRAC demonstriert (Abbildung 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig05v2.jpg"> 
Abbildung 5: Isosmotische VRAC-Aktivierung durch Todesrezeptor-vermittelte Apoptose. (A) Normalisierte SE-FRET-Werte von LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen-exprimierenden HeLa-Zellen (n = 8 Schalen, 23 Zellen) über die Zeit. Nach 15 Zyklen in isotonischem Bildgebungspuffer (Baseline) wurde die Badlösung durch isotonischen Puffer ersetzt, der mit 2 ng/ml TNF-α und 1 μg/ml Cycloheximid (CHX) für 30 Zyklen ergänzt wurde, gefolgt von 20 Zyklen hypertonischem Bildgebungspuffer mit TNF-α und CHX. Der rohe mittlere SE-FRET-Wert jedes ROI und Zeitpunkts wurde auf den Mittelwert des (isotonischen) Basiswerts für den jeweiligen ROI normiert. (B) Quantifizierung der normierten SE-FRET-Werte von LRRC8A/E-exprimierenden HeLa-Zellen wie in A mit isotonischer DMSO-haltiger Lösung als Vehikelkontrolle für CHX (n = 5 Schale, 12 Zellen) oder isotonischem Puffer mit Apoptose-Induktoren wie in A (n = 8 Schale, 23 Zellen) oder von HeLa-Zellen, die CFP-18aa-YFP exprimieren, mit Apoptose-Induktoren (n = 3 Schale, 9 Zellen). Die Daten stellen den Mittelwert der letzten 10 Zeitpunkte im jeweiligen Puffer der einzelnen Zellen (Symbole) und den Mittelwert aller Zellen ± SD dar; ** p &lt; 0,01 gewöhnliche einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichs-Post-hoc-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig05largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Überwachung der Leucin-reichen Repeat-haltigen 8-Kanal-Aktivität (LRRC8/VRAC) mittels sensibilisiertem Emissions-Förster-Resonanz-Energietransfer (SE-FRET)

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

monitoring-leucine-rich-repeat-containing-8-channel-lrrc8vrac

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir demonstrieren FRET zwischen konjugiertes Polymer Polydiacetylen (PDA) und Fluorophor auf die Oberfläche des PDA Liposomen für die Erfassung von Biomolekülen gebunden. PDA Liposomen auch Rezeptormoleküle auf ihren Oberflächen für Biomoleküle als Sonden verwendet werden enthalten. Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf Änderungen des FRET-Effizienz zwischen dem Fluorophor und PDA, welche die Grundlage des Fühlmechanismus ist zu führen.

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