Name: Optimierung der Tränensammlung bei Mäusen für die mRNA- und Proteinanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Tränensammlung bei Mäusen für mRNA- und Proteinanalyse mittels Pilocarpin-Stimulation und Schirmer-Streifen. Diese Methode ermöglicht minimal-invasive Biomarker-Identifikation für Frühdiagnosen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der VELUX STIFTUNG [Projekt 1852] an M.L. und Postgraduiertenstipendien von CONAHCYT an M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) und A.M.F. (CVU 1317418). Herzlichen Dank an alle Mitglieder des Laboratoriums, des Centro de Investigación sobre el Envejecimiento und des Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) für ihre Beiträge zu den anregenden Diskussionen.

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von der Tierethikkommission von Cinvestav genehmigt (CICUAL, # 0354/23). Die Labortiere wurden in strikter Übereinstimmung mit den Tierverwendungsrichtlinien der Zeitschrift und gemäß der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung behandelt und behandelt. Die Augengesundheit vor und nach den Eingriffen wurde durch die Beurteilung von Augenausfluss, geschwollenen Augenlidern, Augenanomalien und Verhaltensänderungen bewertet.
1. Tiere und Reagenzienzubereitung
<ol><li>Verwenden Sie für das Verfahren drei 2 Monate alte männliche C57BL/6-Mäuse pro Replikat mit einem Startgewicht von ~25 g (Abbildung 1). Bearbeiten Sie jede Maus einzeln und legen Sie sie auf ein Heizkissen, um die Wärme zu erhalten.</li>
	<li>Um die Tränensekretion zu induzieren, bereiten Sie eine Stammlösung von Pilocarpin in einer Dosis von 20 mg/ml mit sterilem Wasser vor.</li>
	<li>Schneiden Sie die Schirmer-Teststreifen auf eine Länge von 5 mm zu und biegen Sie jeden Streifen an der Kerbe in einem 90°-Winkel.</li>
	<li>Bereiten Sie 250 μl steriles Wasser mit einem Proteasehmer vor (1 Tablette für 50 ml, gemäß den Anweisungen des Herstellers).</li>
</ol>2. Anregung und Sammlung der Tränenproduktion
<ol><li>Wiegen Sie jede Maus einzeln, um die geeignete Dosierung der Behandlungen zu berechnen.</li>
	<li>Um die Tränenproduktion zu stimulieren, verabreichen Sie 30 mg/kg Pilocarpin intraperitoneal mit einer 6-mm-Insulinspritze (Abbildung 1B). Warten Sie 2 Minuten nach der Injektion, bis sich die Wirkung manifestiert. HINWEIS: Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Tränenflüssigkeit konnten keine Daten von nicht stimulierten Tieren erhoben werden.</li>
	<li>Sammeln Sie die Tränen, indem Sie das Ende jedes Schirmer-Streifenfragments mit einer Pinzette über die Mitte des unteren Augenlids legen und an Ort und Stelle halten, bis der Riss die Streifengrenze erreicht (Abbildung 1C). Ersetzen Sie dann den Streifen. Platzieren Sie nacheinander 2 Schirmer-Streifen in jedem Auge, mit einem Abstand von 2 Minuten zwischen den Streifen für die Entnahme. Für die Tränensammlung werden etwa vier Streifenfragmente über 10 min pro Maus benötigt.</li>
	<li>Legen Sie die Schirmer-Streifenfragmente in sterilen Röhrchen auf Eis, um eine Degradation der Komponenten zu vermeiden. Sobald die Sammlung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit der Tränenverarbeitung.</li>
</ol>3. Isolierung von Proteinen
<ol><li>Die Streifenfragmente werden in ein 600-μl-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 20 μl steriles Wasser mit einem Proteaseinhibitor enthält, und 1 h bei 600 x g bei 4 °C zentrifugiert, wie zuvor gezeigt17 (Abbildung 1D).</li>
	<li>Führen Sie eine Punktion mit einer 7,5 cm langen Injektornadel aus Edelstahl an der Spitze des 600-μl-Röhrchens mit der Probe durch (Abbildung 1E). Übertragen Sie dann dieses punktierte Röhrchen in ein neues sterilisiertes 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C, wie zuvor berichtet17, um das Volumen der verdünnten Tränen zurückzugewinnen. Das Volumen des Tränenfilms (Überstand) befindet sich am Boden der Tube.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Proteinpool, indem Sie den Überstand aus allen Proben kombinieren. In diesem Experiment wurde ein Gesamtvolumen von ca. 200 μl erhalten. HINWEIS: Die Tränenproduktion kann über 1 Stunde dauern. In dieser Zeit können noch Tränen aufgefangen werden.</li>
	<li>Quantifizieren Sie den Gesamtproteingehalt des Tränenpools unter Verwendung der Bradford-Standardmethode22.</li>
</ol>4. SDS-PAGE-Analyse
<ol><li>Erhitzen Sie die Proteinproben 4 min lang bei 99 °C, um die Proteine zu denaturieren. Die Proben kurz vortexen, um die Komponenten zu vermischen.</li>
	<li>Laden Sie 30 μg quantifizierten Proteingehalt aus jeder Probe auf ein 10%iges SDS-PAGE-Gel (Tabelle 1) und lassen Sie die Proben 2 h lang bei 90 V mit einer Standardmethode23 laufen.</li>
	<li>Nach der Elektrophorese das Gel mit Färbelösung (Tabelle 1) bedecken und 30 Minuten inkubieren, um die Proteine zu färben.</li>
	<li>Spülen Sie das Gel mehrmals mit der Entfärbungslösung aus, bis der Hintergrund klar wird und Proteinbanden sichtbar sind.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder mit einem Gel-Dokumentationssystem.</li>
</ol>5. mRNA-Isolierung für qPCR und digitale PCR
<ol><li>Legen Sie die Streifen in ein 600-μl-Mikrozentrifugenröhrchen mit 20 μl sterilem Wasser. Machen Sie eine Punktion an der Spitze des Röhrchens, das die Probe enthält, geben Sie es in ein neues sterilisiertes 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie, wie zuvor in Human Tears3 berichtet, für 20 Minuten bei 2.000 x g bei 4 °C (Abbildung 1E-H).</li>
	<li>Erstellen Sie einen Pool aus allen Beispielen. Das gewonnene Volumen dieses Experiments betrug etwa 22 μl Überstand für jede Maus, d.h. 66 μl Gesamtvolumen. Legen Sie die Röhrchen auf Trockeneis, um den Abbau von Biomolekülen zu vermeiden.</li>
	<li>200 μl monophasische Lösung aus Phenol und Guanidiniumisothiocyanat (kommerziell erhältlich) zugeben und durch Pipettieren homogenisieren. 5 min bei Raumtemperatur ziehen lassen. In diesem Schritt können die Proben mehrere Wochen lang bei -20 °C oder mehrere Monate lang bei -70 °C gelagert werden.</li>
	<li>40 μl Chloroform zugeben und 15 s in einem Wirbel einmischen. 2 min bei Raumtemperatur ziehen lassen. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie die wässrige Phase vorsichtig (ohne die Interphase zu nehmen) in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>0,5 μl Glykogen (0,05 μg/μl) zu 100 μl Isopropanol geben und durch Pipettieren mischen. Glykogen wird mit der RNA co-präzipitiert und beeinträchtigt die nachfolgenden Schritte nicht.</li>
	<li>10 min bei -20 °C ziehen lassen. Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand schnell dekantieren.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μl kaltes 75%iges Ethanol hinzu und resuspendieren Sie das RNA-Pellet durch Vortexen. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Dekantieren Sie das Ethanol. Lassen Sie den Schlauch 20-30 Minuten an der Luft trocknen, ohne ihn umzudrehen. 20 μl RNase-freies Wasser zugeben und resuspendieren.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem Ablesen der optischen Dichte im Mikrovolumen-Spektrophotometer bei 260 nm und 280 nm fort, um die Reinheit der RNA zu beurteilen. Die Proben müssen auf Eis sein. HINWEIS: Die ribosomalen Banden 28S und 18S können aufgrund der Art der Probe nicht mit einem Agarosegel beobachtet werden. Das Vorhandensein anderer RNAs, wie z. B. miRNAs oder mRNAs, kann mit einem Bioanalysator analysiert werden, wie zuvor gezeigt18.</li>
	<li>Synthetisieren Sie die cDNA aus Tears-RNA mit einem kommerziellen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.<ol><li>Beginnen Sie mit einer Eingangs-RNA in einem Bereich von 10 ng bis 5000 ng; Je nach verwendetem Kit mischen Sie es mit 1 μL Oligo (dT) und bis zu 12 μL RNase-freiem Wasser. Bei 500 x g 30 s schleudern und bei 65 °C 5 min inkubieren.</li>
		<li>In das Mischröhrchen werden 4 μl 5x Reaktionspuffer, 1 μl RNase-Inhibitor, 2 μl dNTP-Mix und 1 μl reverse Transkriptase gegeben.</li>
		<li>Die Tube bei 500 x g für 30 s drehen, um die Mischung nach unten zu ziehen. Inkubieren Sie das Röhrchen dann 60 Minuten lang bei 42 °C. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 70 °C inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufgrund der geringen Konzentration von mRNA in Tränen wird empfohlen, unverdünnte cDNA für die qPCR24 zu verwenden. Für dieses Experiment wurden 150 ng cDNA verwendet. Führen Sie die qPCR mit DNMT3a-Primern durch: Vorwärts: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Rückseite: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA und GAPDH Primer: Vorwärts: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, Rückwärts: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC gemäß den Anweisungen der Hersteller und Geräteverfahren.<ol><li>Verwenden Sie für den qPCR-Zyklus das folgende Programm: Anfängliche Denaturierung: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen von 95 °C - 15 s, 60 °C - 30 s und 72 °C - 30 s, enden mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten.</li>
		<li>Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse durch, um das Vorhandensein von Primer-Dimeren oder unspezifischen Amplikons in der Reaktion zu beurteilen. Die Temperaturrampe begann von 50 °C bis zu 99 °C, mit einer anfänglichen Wartezeit von 90 s für den ersten Schritt und einer Wartezeit von 5 s zwischen jedem Schritt.</li>
		<li>Führen Sie für die dPCR25 serielle Verdünnungen durch, um die Menge an cDNA zu optimieren, die zum Nachweis der interessierenden mRNA erforderlich ist. In diesem Experiment werden die folgenden Verdünnungen von cDNA in nukleasefreiem Wasser verwendet: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng und 18,75 ng cDNA. Es wurden die bereits erwähnten Primer für DNMT3a verwendet. Für den dPCR-Zyklus verwenden Sie das folgende Programm: Erstdenaturierung: 95 °C für 2 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C - 15 s und 60 °C - 30 s.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protokoll zur Extraktion von Tränenproteinen in experimentellen Tiermodellen

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<li>Masoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+human+tear+film%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of human tear film: A review.</a> Exp Eye Res. 220, 109101(2022).</li>
<li>Dara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+RNA+extraction+method+from+human+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel RNA extraction method from human tears.</a> Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).</li>
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<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+th17-associated+cytokines+and+clinical+correlations+in+patients+with+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease.</a> PloS one. 12 (4), e0173301(2017).</li>
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<li>Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tears+and+ocular+surface+disorders%3A+Usefulness+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers.</a> J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).</li>
<li>Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tears+as+a+source+of+biomarkers+for+ocular+and+systemic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases.</a> Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).</li>
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<li>Khanna, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+lipidomics+approaches+in+human+tears%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review.</a> Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).</li>
<li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid%3A+From+sampling+to+preanalytical+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing.</a> Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).</li>
<li>Koduri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+tear+protein+elution+from+Schirmer%27s+strips+in+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease.</a> Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Tränenflüssigkeit ist leicht zugänglich, und die Bestimmung von Biomarkern in Tränen kann als erfolgreiche ergänzende Technik zur Früherkennung verschiedener menschlicher Krankheiten eingesetzt werden27. Während die biochemische Analyse der Tränenzusammensetzung in experimentellen Tiermodellen diesen Ansatz ergänzt und erhebliche Fortschritte beim Verständnis der molekularen Grundlagen von Krankheiten verspricht, gibt es einen Mangel an verfügbaren Daten und Protokollen, was uns dazu veranlasst hat, eines zu entwickeln. Die in diesem Bericht beschriebene Methode ist technisch einfach durchzuführen und ermöglicht die vorläufige Identifizierung der differentiellen Expression verschiedener krankheitsassoziierter Kandidatenmoleküle.
Die Tränensammlung kann durch verschiedene Verfahren wie Kapillarröhrchen und Schirmer-Streifen16,17, Tupfer28und Schwämme29 erreicht werden. Die Schirmer-Streifenmethode wurde aufgrund ihres einfachen Zugangs, ihrer quantitativen Fähigkeiten, ihrer Anpassungsfähigkeit bei der Probenentnahme, ihrer Kosten und ihrer Einfachheit bei der Extraktion von Tränenkomponenten für die Laborverarbeitung bevorzugt. Darüber hinaus ist dieses Verfahren kostengünstig, minimalinvasiv und stellt dank der Zusammensetzung des Papierfilterstreifens16,17 keine Verletzungsgefahr oder Schädigung der Hornhaut dar. Zu den kritischen Schritten dieses Protokolls gehören die Notwendigkeit einer pharmakologischen Stimulation der Tränenproduktion mit Pilocarpin und die Auswahl eines geeigneten Elutionspuffers.
Pilocarpin ist ein cholinerger Agonist, der an M3-Muskarinrezeptoren bindet und eine pharmakologische Stimulation der exokrinen Drüsen bewirken kann, wodurch die Tränenproduktion, die Speichelsekretion und das Wasserlassen verbessert werden. Obwohl Studien am Menschen gezeigt haben, dass die Tränenstimulation die Osmolarität der gesammelten Flüssigkeit nicht verändert30, beeinflusst sie jedoch eindeutig die Proteinprofile31. Die Verwendung von Pilocarpin als cholinerger pharmakologischer Stimulator exokriner Drüsen und Tränensekretionsverstärker wurde bei Kaninchen und Mäusen erfolgreich berichtet 19,32,33, aber die Wirkung der Stimulation auf den Proteingehalt wurde nicht untersucht. Um diese Einschränkung zu vermeiden und einen genauen Vergleich der Tränenprofile zwischen den Versuchsbedingungen zu ermöglichen, ist es entscheidend, die spezifischen Entnahmeeinstellungen zu berücksichtigen. In ähnlicher Weise kann die Einführung eines Spülschritts vor der Tränenentnahme von Vorteil sein, um eine vorherige Kontamination der Augenoberfläche zu vermeiden. In diesem Protokoll wurde eine Konzentration von 30 mg/kg Pilocarpin verwendet13. Da die Mäuse nach der Injektion dieses Medikaments unbeweglich und ruhig blieben, wurden die Tränen ohne Betäubung gesammelt, was die Probenentnahme erleichterte.
Die Wahl eines geeigneten Elutionspuffers hängt eng mit dem gewählten Verfahren zur Analyse der biochemischen Zusammensetzung einer Tränenprobe und der Wiederfindungsrate von biologischem Material aus dem Streifen zusammen. So wurde beispielsweise in einer vergleichenden Studie, die sich auf die Proteinretention aus Schirmer-Streifen bei Patienten konzentrierte, festgestellt, dass ein Puffer aus 100 mM Ammoniumbicarbonat zusammen mit 0,25 % Nonidet P40 (NP40) hervorragende Ergebnisse für Proteomik- oder Multiplex-ELISA-Analyseanwendungen lieferte17. In unseren Händen erwies sich die Verwendung von sterilem Wasser als ausreichend, um Gesamtproteinextrakte in SDS-PAGE sichtbar zu machen und die mRNA der interessierenden Gene mittels PCR nachzuweisen.
Um das Vorhandensein von DNMT3a- und GAPDH-mRNA in Mäusetränen zu beurteilen, verglichen wir die Leistung von qPCR und dPCR. Das Vorhandensein von Primer-Dimeren, die in der qPCR-Schmelzkurve beobachtet wurden, wird auf die geringe Häufigkeit des DNMT3a-Transkripts zurückgeführt. Wie gezeigt, weist die dPCR eine signifikant höhere Sensitivität und Wirksamkeit beim Nachweis der Ziel-mRNA in diesen Proben in unverdünnten und verdünnten Proben auf. Diese präzise Nachweisfähigkeit macht die dPCR zur bevorzugten Methode für die Tränenanalyse bei Mäusen und bietet Forschern und Klinikern ein zuverlässiges Werkzeug für zukünftige Studien und potenzielle klinische Anwendungen.
Die Entwicklung eines standardisierten Protokolls für die Entnahme von Tränenproben im Tiermodell stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Forschung dar. Dieses Protokoll erleichtert nicht nur die systematische und präzise Entnahme von Tränenproben, sondern eröffnet auch vielfältige Möglichkeiten für deren Anwendung in verschiedenen Untersuchungsbereichen. Die Möglichkeit, Tränenproben aus Tiermodellen zu gewinnen, ermöglicht die Untersuchung eines breiten Spektrums von Krankheiten und Zuständen sowie die Erforschung neuer Biomarker und potenzieller Therapien. Darüber hinaus wird durch die Etablierung eines standardisierten Protokolls die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse über verschiedene Studien und Labore hinweg gefördert und damit zur Validität und Zuverlässigkeit der Forschung beigetragen. Letztendlich hat dieser Fortschritt in der Methodik zur Entnahme von Tränenproben in Tiermodellen das Potenzial, wichtige Entdeckungen voranzutreiben und das Verständnis der Pathophysiologie verschiedener Krankheiten zu verbessern, wodurch neue Wege für Diagnose, Behandlung und Prävention eröffnet werden.

Tränen gelten als Plasma-Ultrafiltrat und wurden aufgrund einer signifikanten Überlappung der Biomoleküle, die sie teilen, auch als Zwischenflüssigkeit zwischen Plasmaserum und Liquor cerebrospinalis beschrieben1. Es wurde berichtet, dass menschliche Tränen Proteine, Tränenlipide, Metaboliten und Elektrolyte enthalten2. In jüngster Zeit wurden auch andere Biomoleküle wie mRNAs, miRNAs und extrazelluläre Vesikel identifiziert 3,4,5,6,7.
Beim Menschen befinden sich die Basaltränen im Tränenfilm, der aus drei Schichten besteht: der äußeren Lipidschicht, die die Tränenoberfläche glatt hält, damit wir hindurchsehen können und die Verdunstung der Tränen verhindert wird; die mittlere wässrige Schicht, die das Auge mit Feuchtigkeit versorgt, Bakterien abweist, die Hornhaut schützt und 90 % des Tränenfilms ausmacht; Und schließlich die Muzinschicht, eine Familie von Proteinen mit hohem Molekulargewicht, die mit der Hornhaut in Kontakt kommen und es der Träne ermöglichen, am Auge zu haften8. Die Tränenverteilung über die Augenoberfläche beginnt mit der Sekretion aus der Tränendrüse. Diese Flüssigkeit wird dann durch Tränenkanäle geleitet, um über die Augenoberfläche zu fließen und in die Abflusskanäle zu fließen. Mit jedem Blinzeln können sich die Tränen gleichmäßig über das gesamte Auge verteilen und es bleibt feucht9.
Der Tränenfilm ist eine hochdynamische Bioflüssigkeit, die in der Lage ist, molekulare Veränderungen widerzuspiegeln, die nicht nur auf der Augenoberfläche, sondern auch in anderen Geweben und Organen auftreten. Die Analyse der differentiellen Expression in dieser Bioflüssigkeit stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Entdeckung von Biomarkern bei menschlichen Krankheitendar 10,11. Die Verwendung von Tränenfilm als Quelle von Biomarkern für die Früherkennung verschiedener Pathologien wurde durch das Vorhandensein nicht-invasiver Entnahmemethoden erheblich erleichtert. Die gebräuchlichste Methode zum Sammeln von Tränen in Human- und Tierkliniken ist eine membranbasierte Stütze (Schirmer-Streifen), die nach dem Prinzip der Kapillarwirkung funktioniert und es dem Wasser in den Tränen ermöglicht, entlang der Länge eines Papierteststreifens oder von Kapillarröhrchen zu wandern, die in den unteren Bindehautsack des Probanden eingesetzt werden 12,13,14. Trotz der inhärenten Einschränkung, mit dieser Methode ein kleines Probenvolumen zu erhalten, hat die biochemische Analyse der Tränenzusammensetzung unter Verwendung verschiedener empfindlicher Techniken die Identifizierung potenzieller Biomarkermoleküle erleichtert11,15. Protokolle zur Optimierung und Bewertung der Elution von Tränenproteinen aus Schirmer-Streifen und Kapillaren bei menschlichen Patienten sind gut dokumentiert16,17. Vollständige Beschreibungen von optimierten Protokollen, die speziell entwickelt wurden, um molekulare Informationen über Tränen aus experimentellen Tiermodellen zu extrahieren, sind jedoch verfügbar, aber rar. Bestehende Methoden, wie z. B. die Träneninduktion durch direkte Stimulation der Tränendrüse18, ermöglichen zwar die Entnahme größerer Volumina, sind jedoch invasiv und können bei den Tieren zu Beschwerden führen. Nicht-invasive Methoden, wie das Sammeln von Rissen von der Augenoberfläche, wurden als eine Möglichkeit zur Isolierung von DNA und miRNAs beschrieben19,21.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine kostengünstige und optimierte Methode zur Sammlung und Verarbeitung von Tränen bei Mäusen zu etablieren. Die Methode legt den Schwerpunkt auf die Nicht-Invasivität und erhält gleichzeitig ausreichende Tränenvolumen, die für die molekulare Analyse durch Techniken wie SDS-PAGE, qPCR und dPCR geeignet sind. Die Informationen über den extrahierten Protein- und mRNA-Gehalt können dann genutzt werden, um potenzielle Biomarker in bestehenden experimentellen Krankheitsmodellen zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>1985023</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Puffer</td><td>Bio-Rad</td><td>16-0737</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Quimica Meyer</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. A4058</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. B6916</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1003045143</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blau R 250</td><td>US Biologisch</td><td>6104-59-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Quimica Rique</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus DNA-Leiter</td><td>Thermofisher wissenschaftlich</td><td>Nr. SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>US Biologisch</td><td>Nr. G8145</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC- 29096</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Quimica Rique</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Quimica Rique</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Quimica Meyer</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen 600 & Mikro; l</td><td>Axygen</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. S3014</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen & Streifen</td><td>Novasbio</td><td>PCR 0104</td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. 6503-10g</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Hemmer</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity EvaGreen PCR-Kit (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>250112</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity Nanoplate 26k 24-Wells (10)</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>Echter qPlus 2x Master Mix Grün</td><td>Ampliqon</td><td>A323402</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Erstes Strad-cDNA-Synthese-Kit</td><td>Thermofisher wissenschaftlich</td><td>Nr. K1622</td><td></td></tr><tr><td>Die Teststreifen von Schirmer</td><td>Laboratorio Santgar</td><td>SANT1553</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. L3771</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma aldrich</td><td>102560430</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9424-200ML</td><td>Monophasische Lösung von Phenol und Guanidiniumisothiocyanat</td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologisch</td><td>Nr. T8650</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Chem Cruz</td><td>sc-3715A</td><td></td></tr></tbody></table>

optimierung der tränensammlung bei mäusen für die mrna- und proteinanalyse

Optimizing Tear Collection in Mice for mRNA and Protein Analysis

Der Tränenfilm ist eine hochdynamische Bioflüssigkeit, die in der Lage ist, pathologische molekulare Veränderungen nicht nur in der Augenoberfläche, sondern auch in anderen Geweben und Organen widerzuspiegeln. Die molekulare Analyse dieser Bioflüssigkeit bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, Krankheiten zu diagnostizieren oder zu überwachen, die Wirksamkeit medizinischer Behandlungen zu beurteilen und mögliche Biomarker zu identifizieren. Aufgrund des begrenzten Probenvolumens erfordert die Entnahme von Tränenproben spezifische Fähigkeiten und geeignete Werkzeuge, um eine hohe Qualität und maximale Effizienz zu gewährleisten. In Humanstudien wurden verschiedene Methoden der Tränenprobenahme beschrieben. In diesem Artikel wird eine umfassende Beschreibung eines optimierten Protokolls vorgestellt, das speziell auf die Extraktion tränenbezogener Proteininformationen aus experimentellen Tiermodellen, insbesondere Mäusen, zugeschnitten ist. Diese Methode umfasst die pharmakologische Stimulation der Tränenproduktion bei 2 Monate alten Mäusen, gefolgt von der Probenentnahme mit Schirmer-Streifen und der Bewertung der Wirksamkeit und Effizienz des Protokolls durch Standardverfahren, SDS-PAGE, qPCR und digitale PCR (dPCR). Dieses Protokoll kann leicht für die Untersuchung der Tränenproteinsignatur in einer Vielzahl von experimentellen Paradigmen angepasst werden. Durch die Etablierung eines erschwinglichen, standardisierten und optimierten Tränenentnahmeprotokolls für Tiermodelle sollte die Lücke zwischen Human- und Tierforschung geschlossen, translationale Studien erleichtert und der Fortschritt auf dem Gebiet der Erforschung von Augen- und systemischen Erkrankungen beschleunigt werden.

Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll bietet eine einfache und erschwingliche Methode zur Gewinnung molekularer Informationen aus Tränenflüssigkeit unter Verwendung von Techniken, die in den meisten molekularbiologischen Laboratorien üblicherweise verfügbar sind. Darüber hinaus kann das Protokoll durch den Einsatz hochempfindlicher Techniken wie ELISA zum Nachweis der enzymatischen Aktivität skaliert werden.
Nach diesen Verfahren betrug die Gesamtproteinausbeute etwa 3-4 μg/μl. Die Analyse von Gesamtproteinextrakten auf Coomassie-gefärbten SDS-Seiten zeigt Muster der Proteinexpression in der Gesamtnetzhaut und in den Rissen (Abbildung 2A).
Isolierte RNA hatte ein UV-Absorptionsverhältnis von 260/280 zwischen 1,9 und 2,0. Die durchschnittliche Ausbeute betrug 134,8 ng/μl. Die qPCR wurde unter Verwendung von Primer-Sets für ein Housekeeping-Gen (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, GAPDH)3 und ein putatives Biomarker-Gen (DNA-Methyltransferase 3a, DNMT3a)26 durchgeführt. Es wurde eine unverdünnte cDNA-Probe 1:1 (150 ng) verwendet.
Es wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt und die Ct-Raten in der qPCR-Software berechnet. Alle Experimente wurden doppelt durchgeführt. Die Analyse ergab Ct-Werte zwischen 20 und 24, was ein geeigneter Bereich für die Anfangsmenge der Ziel-mRNA in der Probe ist (Abbildung 2B). Die Analyse der Schmelzkurve in Abbildung 2C deutet jedoch auf das geringe Vorhandensein von Ziel-mRNA hin. Nichtsdestotrotz bestätigte das 2%ige Agarose-Gel das Vorhandensein von Amplikons in der erwarteten Größe (Abbildung 2D).
Die dPCR wurde mit dem gleichen Paar Primer-Sets für DNMT3a durchgeführt. Die Verdünnung der verwendeten cDNA-Proben betrug 1:1 (150 ng), 1:2 (75 ng), 1:4 (37,5 ng), 1:8 (18,75 ng). Alle Experimente wurden doppelt durchgeführt. Die dPCR konnte von 1,33 Kopien/μl in der unverdünnten Probe bis zu 0,45 Kopien/μl in der 8-fach verdünnten Probe nachweisen (Abbildung 3A, 3B). Somit zeigte die dPCR im Vergleich zur qPCR eine erhöhte Sensitivität gegenüber der in Tränen vorhandenen Ziel-mRNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Tränenextraktionsprotokolls von Mäusen. (a) Tränensammlung. Es wurden drei 2 Monate alte C57BL/6J-Mäuse verwendet. (B) Die Tränenproduktion wurde pharmakologisch durch intraperitoneale Verabreichung von Pilocarpin induziert. Foto, das die Platzierung des Schirmer-Bandes veranschaulicht. (c) Verarbeitung von Tränen. Die Tränen wurden dann mit Schirmer-Streifen für 10 min aufgefangen und in Mikrozentrifugenröhrchen überführt. (D) Die in den Schirmer-Streifen gesammelten Tränen wurden mit sterilem Wasser und Proteaseinhibitoren oder nur mit sterilem Wasser zentrifugiert. (E, F) Diese Röhrchen wurden am Boden perforiert und anschließend in ein neues sterilisiertes 1,5-ml-Röhrchen überführt, um die Flüssigkeitsentladung zu erleichtern. (G, H) Die Tränen werden in der 1,5 Tube mL gesammelt. (I) Repräsentatives Foto des Verfahrens zum Sammeln von Tränen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig02.jpg"> Abbildung 2: Downstream-Analyse des Tränenfilms für molekulare Anwendungen. (A) SDS-PAGE von Maustränen und einem retinalen Proteinextrakt. MW: Molekulargewichtsmarker.; Spur 1: Proteinprofile der Netzhaut (30 μg); Spur 2: Proteinprofile von Tränen (30 μg). (B) qPCR für GAPDH und DNMT3a in Mäusetränen. Die durchschnittliche CT und ΔCT sind in Tabelle 2 dargestellt. (C) Analyse der Schmelzkurve für DNMT3a - und GAPDH-PCR-Produkte . Die y-Achse stellt die Änderungsrate der Fluoreszenz in der Amplifikationsreaktion (dF/dT) dar, und die x-Achse stellt die Temperatur in °C (D) dar. Analyse des PCR-Amplikons in einer 2%igen Agarose-Gelelektrophorese mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid. Spur M: 1 kb plus DNA-Leiter. Spur 1,2: GAPDH - bzw. DNMT3a-PCR-Amplikon . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Digitale PCR (dPCR) für die DNMT3a-Expression in Tränen von Mäusen. (A) Die dPCR-Ergebnisse werden als 1D-Streudiagramm dargestellt, das in blauen Punkten die DNMT3a-Transkriptkopien zeigt. Schwarze Punkte sind Partitionen, in denen keine DNMT3a-Transkriptkopien vorhanden sind. (B) Es wurde eine Verdünnungsreihe von cDNA erzeugt, um die optimale Konzentration für die Quantifizierung von DNMT3a-Transkriptkopien zu bestimmen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig03largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name des Materials</td>
			<td colspan="5">Beschreibung</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">10% SDS Gel</td>
			<td colspan="5">Für ein Trenngel: 3,8 mL destilliertes H2O; 2,6 mL Tris; pH-Wert 8,8; 1,5 M 3,4 mL Acrylamid; 100 μL 10 % SDS; 100 μL 10 % APS; 4 μL TEMED.</td>
		</tr><tr><td colspan="5">Für ein Sammelgel: 2,72 mL destilliertes H2O, 0,52 mL Tris; pH-Wert 6,8; 1,5 M 0,68 mL Acrylamid, 40 μL 10 % SDS, 40 μL 10 % APS 4 μL TEMED.</td>
		</tr><tr><td>Elektrophorese-Puffer</td>
			<td colspan="5">250 mM Tris-Base, 2 M Glycin, 1% SDS</td>
		</tr><tr><td>Färbelösung</td>
			<td colspan="5">Die folgenden Reagenzien werden in 43 ml Wasser aufgelöst (bei Raumtemperatur in einer braunen Flasche gelagert): Coomassie 0,25 g; Essigsäure 7 ml; Methanol 50 mL</td>
		</tr><tr><td>Entfärbungslösung</td>
			<td colspan="5">Die folgenden Reagenzien werden in 63 mL Wasser gelöst (bei Raumtemperatur lagern): Essigsäure 7 mL; Ethanol 30 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1. Für SDS-Page einrichten. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name des Gens</td>
			<td>CT1</td>
			<td>CT2</td>
			<td>Durchschnitt mit SD</td>
			<td>ΔCT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH</td>
			<td>20.14</td>
			<td>20.73</td>
			<td>20.44±0.17 Uhr</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DNMT3a</td>
			<td>24.59</td>
			<td>24.97</td>
			<td>24.78±0.07 Uhr</td>
			<td>4.35</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2. Ct-Werte von DNMT3a und GAPDH in Tränen von Mäusen.

Die Identifizierung von RNA- und Protein-Biomarkern aus Rissen in Mausmodellen ist vielversprechend für die Frühdiagnostik verschiedener Krankheiten. Dieses Manuskript bietet ein umfassendes Protokoll zur Optimierung der Wirksamkeit und Effizienz der mRNA- und Proteinisolierung aus Maustränen.

Optimierung der Tränensammlung bei Mäusen für die mRNA- und Proteinanalyse

The tear film is a highly dynamic biofluid capable of reflecting pathology-associated molecular changes, not only in the ocular surface but also in other ...

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Forschung

JoVE Journal

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Biologie

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