AAV-Systeme und Mausmodelle zur Untersuchung der ektopischen Expression von Neurod1 in transduzierten Zellen zu subakuten und chronischen Zeitpunkten nach ischämischem Schlaganfall

Wir untersuchen die AAV-vermittelte ektopische Expression neurogener Transkriptionsfaktoren als mögliche Behandlung für ischämische Schlaganfälle. Unser Fokus liegt darauf, zu untersuchen, ob die Neurod1-Expression in GFAP-exprimierenden Zellen während der subakuten und chronischen Phase nach einem Schlaganfall die transduzierten Neuronen erhöht und mit Verbesserungen der motorischen Funktion korreliert. Jüngste Befunde zeigen, dass die Genexpression im Kortex je nach Region mit demselben AAV variiert. Unsere Forschung ergab, dass der GFAP-Promotor im medialen präfrontalen Kortex aktiver ist als im motorischen Kortex, was darauf hindeutet, dass transduzierte Zellen unterschiedlich auf bestimmte Promotoren reagieren.

Daher sollten Therapien mit neurogenen Transkriptionsfaktoren auf die Zielregion des Gehirns zugeschnitten werden. Zu den aktuellen Herausforderungen gehört die Variabilität der Schlaganfallläsionsgröße aufgrund von Variablen wie den Injektionsraten von ET-1 und der Transduktionseffizienz zwischen den Hirnregionen. AAV-Titer und Tropismus über Gehirnregionen und Mausstämme hinweg können die Transduktionseffizienz beeinflussen und sich auf die zelluläre Bewertung der ektopischen Neurod1-Expression nach einem Schlaganfall auswirken.

Die größte Herausforderung bei der Umwandlung von Astrozyten in Neuronen besteht darin, reprogrammierte Neuronen von bereits existierenden zu unterscheiden. Unser Labor will bestätigen, dass diese Reprogrammierung in vivo stattfindet, indem wir neuartige Werkzeuge entwickeln. Letztendlich versuchen wir zu verstehen, wie die ektopische Expression des neuronalen Transkriptionsfaktors die Genesung bei hirnverletzten Tieren verbessert.

Nehmen Sie zunächst das betäubte Tier aus der Kammer und legen Sie es auf eine saubere Oberfläche. Nach der Reinigung des Operationsbereichs der Maus legen Sie die Nase in den stereotaktischen Nasenkegel und stabilisieren den Schädel mit Hilfe von Ohrstangen. Machen Sie mit einer Skalpellklinge mit der Nummer 10 einen vertikalen Schnitt parallel zur Sagittalebene von hinter dem Mittelpunkt der Augen bis zum Scheitelknochen.

Ziehen Sie dann die Haut vorsichtig zurück, um den Schädel freizulegen. Verwenden Sie als Nächstes ein Wattestäbchen, um die Faszie am Schädel zu stören, und lassen Sie den Schädel trocknen, um das Bregma vollständig freizulegen. Bohren Sie mit einem stereotaktischen Hochgeschwindigkeitsbohrer drei Bohrlöcher an den Koordinaten im rechten sensomotorischen Kortex.

Ersetzen Sie dann den Bohrer durch eine 26-Gauge-Spritze, die mit einer Nadel mit einer Länge von 0,375 Zoll ausgestattet ist. 1,5 Mikroliter 400 mikromolare Endothelin-1-Lösung, gelöst in sterilem PBS, in die Spritze geben. Geben Sie ein kleines Volumen Endothelin-1 ab, um einen Tropfen an der Nadelspitze zu beobachten, der einen guten Fluss gewährleistet.

Senken Sie die Nadelspitze über den Schädel hinaus in das mittlere Bohrloch ab, ohne die Dura mater zu durchstechen. Sobald sie ausgerichtet ist, senken Sie die Nadel einen Millimeter in das Gehirn ab. Geben Sie mit der Hamilton-Spritze jeweils 0,1 Mikroliter ab und warten Sie eine Minute, bevor Sie die nächsten 0,1 Mikroliter injizieren.

Um zu verhindern, dass die Nadel zwischen und nach den Injektionen verstopft, geben Sie eine kleine Menge Endothelin-1 ab, bis ein Tropfen an der Nadelspitze erscheint. Wischen Sie vor der Injektion mit einem sterilen Wattestäbchen das überschüssige Endothelin-1 ab. Zum Schluss vernähen Sie die darüber liegende Haut am Schädel mit einer sterilen 4-0-Naht, um die Wunde zu verschließen.

Nach der Anästhesierung der mit Endothelin-1 behandelten Maus wird die Maus in den stereotaktischen Rahmen übertragen. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Nähte an der Wunde durch. Entfernen Sie mit einer Pinzette den Schorf und ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.

Verwenden Sie dann ein steriles Wattestäbchen, um die Schädeloberfläche zu trocknen und die Bohrlöcher zu lokalisieren. Richten Sie die Manipulatorarme der stereotaktischen Apparatur ein. Platzieren Sie einen Nadelhalter mit einer 26-Gauge-Spritze und einer Nadel mit einer Länge von 0,375 Zoll.

Laden Sie nun 3,4 Mikroliter AAV-Lösung in die Spritze. Senke die Nadelspitze über den Schädel hinaus in das erste, vorderste Bohrloch. Stellen Sie sicher, dass die Nadel die Dura mater nicht durchsticht, und senken Sie sich dann einen Millimeter in das Gehirn ab.

Injizieren Sie mit der Hamilton-Spritze einen Mikroliter AAV-Lösung, indem Sie jeweils 0,1 Mikroliter abgeben, wie zuvor gezeigt. Naht dann die darüber liegende Haut am Schädel, um die Wunde mit einer 4-0 Polysorb Polyesternaht zu verschließen. Nehmen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie sie in einen sauberen, vorgeheizten Stallkäfig im Auffangbereich um.