Name: AAV-Systeme und Mausmodelle zur Untersuchung der ektopischen Expression von Neurod1 in transduzierten Zellen zu subakuten und chronischen Zeitpunkten nach ischämischem Schlaganfall (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Erfahren Sie die AAV-vermittelte Neurod1-Expression in Mäusen nach ischämischem Schlaganfall zur Untersuchung neuronaler Regeneration und motorischer Funktionsverbesserung in subakuten und chronischen Phasen.

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<meta charset="utf8"></head><body>AAV-Systeme und Mausmodelle zur Untersuchung der ektopischen Neuroden1-Expression nach einem Schlaganfall

<ol><li>GBD 2016 Stroke Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+burden+of+stroke%2C+1990-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016.</a> Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).</li>
<li>Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+stroke%3A+Mechanisms%2C+modulation%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential.</a> J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).</li>
<li>Kuriakose, D., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+treatment+of+stroke%3A+Present+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives.</a> Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).</li>
<li>Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+degeneration+of+neurons+in+the+penumbra+region+following+a+small%2C+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke.</a> Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).</li>
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<li>Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin-1+and+endothelin+receptor+antagonists+in+inflammatory+response+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+scar+is+more+than+just+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The glial scar is more than just astrocytes.</a> Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
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<li>Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+reactive+glia+into+iPSCs+to+produce+new+neurons+in+the+cortex+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 22490(2016).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
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<li>Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+through+in+vivo+cell+fate+reprogramming+for+neural+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair.</a> Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+conversion+of+striatal+astrocytes+into+gabaergic+neurons+in+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>#77 Bohrer (.018")</td><td>David Kopf Instruments</td><td>8177</td><td></td></tr><tr><td>AAV5-GFAP(0,7)-mNeurod1-2A-iCre</td><td>Vektor&nbsp; Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resorbierbares Nahtmaterial mit Nadel Polysorb&trade; Polyester CV-15 3/8 Circle Taper Point Nadel Stärke 4 - 0 Geflochtener</td><td>Covidien</td><td>GL-881</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN Antikörper (Kaninchen)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>ABN78&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Charles River</td><td>027</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidin Lösung</td><td>Partnar</td><td>PCH-020</td><td></td></tr><tr><td>Contec&trade; &nbsp; PREempt&Handel; RTU Desinfektionslösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>29-636-6212</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Thermo Scientific &nbsp;</td><td>HM525 NX&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-23-3800-0.5MG</td><td></td></tr><tr><td>Feder Rasierhobel Mikrotom Klingen</td><td>Feder</td><td>12-631P</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Deckbrille: Rechtecke</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium für Fluoreszenz</td><td>Agilent Technologies</td><td>S3023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Hamilton Company</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Hochgeschwindigkeitsbohrer</td><td>David Kopf Instruments</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Metacam Solution (Meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5-GFAP-iCre</td><td>Vector Builder</td><td>P190924-1001suq</td><td></td></tr><tr><td>Polyderm Salbe USP</td><td>TARO</td><td>2181908</td><td></td></tr><tr><td>SOMNI Scientific&trade; &nbsp; Das Heizkissen für die Tiertemperatur</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-777-177</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktische Instrumente</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modell 902</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger, weiß</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>tdTomato Reporter Mäuse&nbsp;</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>007914</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Tisch-Anästhesiesystem für Labortiere</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr></tbody></table>

aav-systeme und mausmodelle zur untersuchung der ektopischen expression von neurod1 in transduzierten zellen zu subakuten und chronischen zeitpunkten nach ischämischem schlaganfall

AAV Systems and Mouse Models for Investigating Ectopic Expression of Neurod1 in Transduced Cells at Subacute and Chronic Times Post-Ischemic Stroke

Zur Untersuchung der zellulären Ergebnisse der kurzen GFAP (gfaABC(1)D)-Promotor-gesteuerten, ektopischen Neurod1-Expression in Wildtyp-Stämmen (C57BL/6J) und in transgenen tdTom-Cre-Reporterstämmen (insbesondere B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 wurden zwei AAV5-basierte Systeme bei ET-1-Schlaganfall-verletzten Mäusen eingesetzt (Abbildung 1A-C). In einem subakuten Schlaganfallmodell wurde Neurod1 im Cre-Flex AAV-System verpackt und am Tag 7 nach dem Schlaganfall an Wildtyp-Mäuse verabreicht (Abbildung 1B). Der zweite Flex-Vektor enthält die invertierte Sequenz für GFP, die vom CAG-Promotor angetrieben wird, der von heterotypischen, antiparallelen loxP-Typ-Rekombinationsstellen flankiert wird (Abbildung 1B). Beide viralen Konstrukte werden nach dem Schlaganfall gleichzeitig injiziert. Sobald Cre in transduzierten Zellen exprimiert ist, wird das GFP invertiert und an Rekombinationsstellen exzidiert, wodurch die Sequenz in Sinnesrichtung ausgerichtet wird, was die Expression von GFP ermöglicht. Daher sind Zellen, die Cre exprimieren, GFP-positiv, was darauf hindeutet, dass sie von den Cre-Flex-Vektoren transduziert wurden. Im subakuten Modell wurden Mäuse 21 Tage nach der Transduktion (d.h. 28 Tage nach dem Schlaganfall) getötet, und die Anzahl der transduzierten Zellen (GFP+) sowie die Anzahl der NeuN+GFP+-Zellen (transduzierte Zellen, die NeuN exprimieren) Zellen wurden im Parenchym der durch einen Schlaganfall verletzten Gehirne gezählt. Wie in Abbildung 2A zu sehen ist, gehen Neuronen an der Stelle der ischämischen Verletzung verloren. Die Quantifizierung transduzierter Zellen im subakuten Paradigma mit dem Cre-Flex AAV-System zeigt signifikant mehr markierte Neuronen (NeuN+GFP+/GFP+-Zellen) in den mit Neurod1 behandelten Mäusen im Vergleich zu Stroke-Cre-Kontrollmäusen (43,05 +/- 5,50% vs. 18,43 +/- 3,03% NeuN+GFP+/GFP+-Zellen, in Stroke-Neurod1 vs. Stroke-Cre (Kontrolle) behandelte Mäuse) (p = 0,0172) (Abbildung 2B,C).
In einer separaten Reihe von Experimenten wurde die AtN-Umwandlung in einem chronischen Schlaganfallmodell durchgeführt (Abbildung 1B,C). Der Transkriptionsfaktor Neurod1 wurde ET-1-Schlaganfall-geschädigten tdTom-Cre-Reportermäusen am Tag 21 nach dem Schlaganfall verabreicht (Abbildung 1C). Identisch mit dem Cre-Flex-System, das in Wildtyp-Mäusen verwendet wird, wurde die Neurod1-Expression durch den kurzen GFAP-Promotor gesteuert. In diesem System wurde jedoch ein einzelnes AAV-Konstrukt mit Cre-Rekombinase nach Neurod1 verwendet (Abbildung 1B). Daher produzieren GFAP-exprimierende Zellen Cre-Rekombinase, die den tdTom-Reporter induziert, der auf Zellen hinweist, die AAV transduziert wurden. Die Mäuse wurden 77 Tage nach dem Schlaganfall (8 Wochen nach dem AAV) getötet (Abbildung 1C). Wie in Abbildung 3A zu sehen ist, wird eine kortikale Läsion am Tag 77 nach dem Schlaganfall bei tdTom-Cre-Mäusen beobachtet. Die Anzahl der transduzierten Zellen, die den neuronalen Marker NeuN+ exprimieren, wurde quantifiziert (relativer Prozentsatz von (NeuN+tdTom+/tdTom+ Zellen) im chronischen Stadium nach einem Schlaganfall und es wurde festgestellt, dass Mäuse, die Stroke-Neurod1 erhielten, signifikant mehr markierte Neuronen aufwiesen als die Stroke-Cre-Kontrollmäuse (74,81 +/- 4,835% vs. 53,05 +/- 5,028% NeuN+tdTom+/tdTom+ Zellen in Stroke-Neurod1vs. Stroke-Cre (Kontrolle) behandelte Mäuse) (p = 0,0355) (Abbildung 3B,C).
Insgesamt zeigen die Ergebnisse eine Baseline-Transduktion von Neuronen und eine höhere Anzahl von transduzierten Zellen, die NeuN+ mit Neurod1-Abgabe exprimieren, sowohl in der subakuten als auch in der chronischen Phase nach einem Schlaganfall in Wildtyp- und tdTom-Cre-Reportermäusen mit zwei verschiedenen AAV-basierten Systemen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Ektopische Expression von Neurod1, Vektoren und Zeitlinien. (A) Grafische Darstellung der Schlaganfallinduktion durch Endothelin-1 (ET-1) Injektion in den motorischen Kortex der Maus. Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das an 3 Stellen verabreicht wird, sowohl an der ET-1-Injektionsstelle als auch an den Stellen, die die Läsion umgeben, 1 mm anterior und posterior. Vergrößertes Panel, das transduzierte Zellen mit AAV-Neurod1 im motorischen Kortex zeigt. (B) Schematische Darstellung der beiden AAV-Vektoren im Cre-Flex-System, die an Wildtyp-Mäuse verabreicht werden (oberes Bild). AAV5-Vektor 1 enthält den kurzen GFAP-Promotor, den Neurod1-Transkriptionsfaktor und die Cre-Rekombinase-Sequenz, flankiert von einer loxP-Stelle (schwarzes Dreieck) und einer lox2272-Stelle (weißes Dreieck). AAV5-Vektor 2 trägt die invertierte GFP-Genreportersequenz, die von einem Paar loxP- und lox2272-Stellen flankiert wird. Die Transduktion beider Vektoren in Zellen führt zu einer Cre-vermittelten Exzision und Inversion, die es der GFP-Expression ermöglicht, transduzierte Zellen zu markieren. Neurod1 wurde auch an tdTom-Cre-Mäuse mit einem AAV5-Vektor (unteres Bild) verabreicht. Im AAV5-Vektor 1 sind der kurze GFAP-Promotor, der Neurod1-Transkriptionsfaktor und die Cre-Rekombinase-Sequenz verpackt. Die Cre-Expression in transduzierten Zellen treibt die Exzision des Stop-Codons an den loxP-Stellen (schwarzes Dreieck) an, was die Expression von tdTomato ermöglicht. (C) Das Cre-Flex-System wurde an Wildtyp-Mäusen getestet, deren AAVs in der subakuten Phase nach dem Schlaganfall (Tag 7 nach dem Schlaganfall) injiziert wurden. Wildtyp-Mäuse wurden 21 Tage nach der AAV-Transduktion (28 Tage nach dem Schlaganfall) getötet. AAV wurde tdTom-Cre-Mäusen in der chronischen Periode nach dem Schlaganfall (Tag 21 nach dem Schlaganfall) verabreicht, und die Mäuse wurden 56 Tage nach der AAV-Transduktion (77 Tage nach dem Schlaganfall) getötet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig02v4.jpg"> 
Abbildung 2: Die ektopische Verabreichung von Neurod1 mit Cre-Flex AAVs in der subakuten Phase nach einem Schlaganfall führt zu einer erhöhten Anzahl transduzierter Zellen, die NeuN exprimieren. (A) Immunfärbung von koronalen Hirnschnitten durch den motorischen Kortex am Tag 28 nach dem Schlaganfall von Mäusen mit Stroke-Cre-Kontrolle (links) und Stroke-Neurod1 (rechts). Ein neuronaler Verlust wird an der Stelle der Läsion beobachtet (weiße gestrichelte Linien). Transduzierte Zellen (GFP+, grün), Neuronen (NeuN+, rot) und kolokalisierte NeuN+GFP+ (orange) Zellen sind im Kortex zu sehen. Maßstabsbalken: 250 μm. (B) Repräsentative Bilder des Hirngewebes der Stroke-Cre-Kontrolle (oben) und des Stroke-Neurod1 (unten) mit Neuronen (NeuN+, rot) und AAV-transduziertem GFP+ (grün). Weiß umrandete Einschübe zeigen eine Nahaufnahme der Zellen für jeden einzelnen Kanal. Weiße Pfeilspitzen zeigen AAV-transduzierte Zellen (GFP+) an. Weiße Pfeile zeigen kolokalisierte NeuN+GFP+-Zellen an. Maßstabsbalken: 125 μm. (C) Quantifizierung von NeuN+GFP+/GFP+-Zellen in Stroke-Cre - und Stroke-Neurod1-Mäusen . N = 3 Mäuse pro Gruppe. Die Daten sind als Durchschnitt ± SEM. Shapiro-Wilk-Test dargestellt (p = 0,3223). Ungekoppelter t-Test, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Die ektopische Verabreichung von Neurod1 in tdTom-Cre-Reportermäusen in der chronischen Phase nach einem Schlaganfall führt zu einer erhöhten Anzahl transduzierter Zellen, die NeuN exprimieren. (A) Immunfärbung von koronalen Hirnschnitten durch den motorischen Kortex am Tag 77 nach dem Schlaganfall von Stroke-Cre-Kontroll - und Stroke-Neurod1-Mäusen . Der neuronale Verlust ist an der ischämischen Verletzungsstelle zu sehen (weiße gestrichelte Linien). Transduzierte Zellen werden im Periinfarkt mit tdTom (rot) markiert. NeuN+tdTom+ (orange) sind transduzierte Zellen, die neuronale Marker exprimieren. Maßstabsbalken: 250 μm. (B) Repräsentative Bilder des Hirngewebes der Stroke-Cre-Kontrolle (oben) und des Stroke-Neurod1 (unten) mit Neuronen (NeuN+, grün) und AAV-transduzierten Zellen (tdTom+, rot). Weiß umrandete Einschübe zeigen eine Nahaufnahme der Zellen für jeden einzelnen Kanal. Weiße Pfeilspitzen zeigen AAV-transduzierte Zellen (tdTom+) an. Weiße Pfeile zeigen kolokalisierte NeuN+tdTom+-Zellen an. Maßstabsbalken: 125 μm. (C) Die Quantifizierung von NeuN+tdTom+/tdTom+-Zellen im chronischen Paradigma zeigt signifikant mehr transduzierte Zellen, die NeuN+ exprimieren (NeuN+tdTom+/tdTom+-Zellen) in den mit Neurod1 behandelten Mäusen. N = 3 Mäuse pro Gruppe. Die Daten werden als Durchschnitt ± SEM. Shapiro-Wilk-Test (p = 0,2044) dargestellt. Ungekoppelter t-Test, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

AAV-Systeme und Mausmodelle zur Untersuchung der ektopischen Expression von Neurod1 in transduzierten Zellen zu subakuten und chronischen Zeitpunkten nach ischämischem Schlaganfall

Ectopic expression of neurogenic factors in vivo has emerged as a promising approach for replacing lost neurons in disease models. The use of neural basic ...

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AAV-Systeme und Mausmodelle zur Untersuchung der ektopischen Expression von Neurod1 in transduzierten Zellen zu subakuten und chronischen Zeitpunkten nach ischämischem Schlaganfall (Video) | JoVE Journal

AAV-Systeme und Mausmodelle zur Untersuchung der ektopischen Expression von Neurod1 in transduzierten Zellen zu subakuten und chronischen Zeitpunkten nach ischämischem Schlaganfall

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