Name: Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie retrovirale CRISPR/Cas9-Transduktion zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in primären T-Zellen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht präzise Gen-Editing und funktionelle Analysen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Retrovirale Transduktion von Guide-RNA zur Geneditierung bei der Th17-Differenzierung

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
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<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
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<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
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<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Zell- und Gewebekulturschale</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (Freie Säure, steril)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zell- und Gewebekulturplatte</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Zell- und Gewebekulturplatte</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A Solution (1.000x)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anti-Maus CD4 Antikörper (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>CD3e Monoklonaler Antikörper (145-2C11), Functional Grade, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Monoklonaler Antikörper (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>CD62L (L-Selectin) Monoklonaler Antikörper (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (40 &mu; m)</td><td>biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (70 &mu; m)</td><td><a name="REICHWEITE! B14">Biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5425&nbsp; R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; Kompetente Zellen</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Maus CD4+ T-Zell-Isolationskit</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Mini-Plasmid-Kit II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect Transfektionsreagenz</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, Premium Plus</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-Maus IL-17A Antikörper (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix für qPCR?+gDNA-Wischer?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Maokang Biotechnologie</td><td>07.07.1950</td><td></td></tr><tr><td>Maus GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM Reduziertes Serummedium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>Pacific Blue Anti-Maus CD4 Antikörper (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>100531</tr><tr><td>PE/Cyanin7 Anti-Maus CD25 Antikörper (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanin7 Anti-Maus CD4 Antikörper (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9 Mäuse&nbsp;</td><td>Shanghai Model Organisms Center</td><td>Kat.-Nr. NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TGF-beta 1 (CHO-exprimiert) Protein, CF</td><td>R& D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Forschungszellanalysator</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Forschungszellsortierer</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermocycler PCR-System</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvatlösung (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Maus-CD28-Antikörper (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Maus-IFN-& Gamma; Antikörper (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Maus-Antikörper IL-4 Antikörper (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Maus-Antikörper IL-12/IL-23 p40 Antikörper (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

retrovirales crispr/cas9-vermitteltes gen-targeting zur untersuchung der th17-differenzierung in vitro

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

In der Studie klonierten wir das sgRNA-Ziel an Rorc und sgRNA-nicht-targeting-kodierende Sequenzen in einen pMX-U6-MCS-Vektor mit mCherry-Fluoreszenzprotein (Abbildung 1A,B). Die Retrovirusproduktion erfolgte gemäß dem in Abbildung 2 dargestellten Protokoll. Die Transfektion wurde an Tag 0 eingeleitet und die retrovirale Entnahme erfolgte an Tag 2. Die Transfektionseffizienz kann anhand der mCherry-Fluoreszenzintensität getestet werden (Abbildung 1C). Vor der Ernte des Virus wurden naive CD4+ T-Zellen sortiert und aktiviert. Diese aktivierten CD4+ T-Zellen wurden dann mittels Spin-Infektion infiziert, gefolgt von der Fortsetzung der Differenzierungsschritte wie beschrieben. Schließlich wurden die Effizienz der Transduktion und die Ergebnisse der Differenzierung mittels Durchflusszytometrie und qPCR-Analyse bewertet.
Abbildung 3 veranschaulicht die Gating-Strategie, die zur Sortierung naiver CD4+ T-Zellen angewendet wird. Nach der Auswahl der Hauptzellpopulation und der Singulettzellen (wie in den ersten beiden Gates von Abbildung 3 gezeigt) wurden FVD-CD4+-Zellen gegated, um CD4-T-Zellen in polarisierten mit Th17-Zellen von denen in APCs zu unterscheiden. Schließlich repräsentiert IL-17A, das von CD4-T-Zellen produziert wird, die Th17-Differenzierungseffizienz, was auf die Knockout-Effizienz hinweist. Der Prozentsatz der mCherry-positiven Zellen spiegelt die Effizienz der retroviralen Infektion wider, während die Knockout-Effizienz durch den Prozentsatz der IL-17A-positiven Zellen angegeben wird. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern und die Sortierdauer zu minimieren, wurden die Splenozyten mit einem CD4+ T-Zell-Isolationskit der Maus angereichert, was zu einer Anreicherungseffizienz von über 90 % führte.
Die Wirksamkeit einer Retrovirusinfektion, die durch das Vorhandensein von mCherry-positiven Zellen angezeigt wird, liegt in der Regel bei etwa 40 % (Abbildung 4A). Obwohl die Infektionseffizienz durch Viruskonzentration gesteigert werden kann, geht dieser Ansatz auf Kosten einer verlängerten Versuchsdauer und höherer Kosten. In unseren Experimenten dienten infizierte Zellen, die ohne den Th17-Zelldifferenzierungscocktail kultiviert wurden, als Th17-Differenzierungs-Negativkontrolle, die als Th0 bezeichnet wird. Als Positivkontrolle wurde eine nicht-zielgerichtete sgRNA verwendet, die als sgNT bezeichnet wird. Für die Geneditierung verwendeten wir gRNA, die auf das RORγt-Gen (sgRNA-Rorc) abzielte, was die Th17-Differenzierungseffizienz signifikant reduzierte (Abbildung 4A). Diese Intervention führte auch zu einer erheblichen Abnahme der Expressionsniveaus von Rorc und IL-17a (Abbildung 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Beispiel für eine subklonierte sgRNA in einen retroviralen Vektor und Transfektionseffizienz. Als Ausgangskonstrukt wurde der pMX-U6-MCS-Vektor verwendet. Das gRNA-Gerüst wurde zusammen mit den sgRNA-Sequenzen (der orangefarbene Teil), die auf die (A) Scramble-Stelle und (B) Ronc abzielen, stromabwärts des U6-Promotors eingefügt (der grüne Teil als Schnitt für die Sequenzierung mit U6-Primern). Die Positionen der sgRNA-haltigen Primer und der Sequenzierungsprimerstellen sind unterhalb des zirkulären Vektors angegeben. Die vollständigen Namen der Abkürzungen auf dem Plasmid lauten wie folgt. Abkürzungen: AmpR = Resistenz gegen Ampicillin, Carbenicillin und verwandte Antibiotika; LTR = langer Terminal-Repeat; MMLVψ = Verpackungssignal des moloney murinen Leukämievirus; gag = verkürztes Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV) Gag-Gen , dem das Startcodon fehlt. (C) Mikroskopische Bildgebung von mCherry in Plasmid-DNA-transfizierten Plat-E-Zellen. Maßstabsleiste: 500 px. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Protokolls. Am Tag vor der Transfektion muss die Dichte der Plat-E-Zellen auf einen geeigneten Bereich eingestellt werden. Führen Sie am nächsten Tag (Tag 0) eine Transfektion durch und ersetzen Sie das Medium 12 h später. An Tag 1 werden die naiven T-Zellen von Cas9-exprimierenden Mäusen sortiert und aktiviert. Anschließend (Tag 2) wird der virushaltige Kulturüberstand entnommen und mit den aktivierten T-Zellen für die retrovirale Transduktion kombiniert. Die infizierten Zellen werden dann für 3-4 Tage in Th17-Zellen differenziert und mit FACS analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Gating-Strategie zur Sortierung der CD4-naiven T-Zellen. Die angereicherten CD4-T-Zellen wurden oberflächengefärbt, um CD4, CD25, CD44 und CD62L zu markieren. Die angewandte Gating-Strategie war wie folgt: Zunächst wurden die Lymphozyten auf der Grundlage von Vorwärtsstreu- und Seitenstreuparametern gegated. Anschließend wurden Einzelzellen mittels FSC-H und FSC-W identifiziert. CD4+CD25-Zellen wurden dann so gegated, dass regulatorische T-Zellen (Tregs) ausgeschlossen wurden. Schließlich wurden CD44-niedrige CD62L-Zellen mithohem naiven T-Wert identifiziert. Die isolierten CD4+ naiven T-Zellen wurden für nachfolgende Experimente gesammelt. Abkürzungen: FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = seitliche Streuung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Beispiel für eine erfolgreiche Transduktion von aktivierten T-Zellen und Th17-Differenzierung. (A) Die Differenzierungseffizienz von Th17 ist signifikant reduziert, was durch RORγt gRNA (Gating auf mCherry+ IL-17a+Population) editiert wird. (B) Rorγt- und IL-17a-relative mRNA-Expression in Th0 (infizierte Zellen, die ohne Th17-Zelldifferenzierungscocktail kultiviert wurden), sgNT (nicht-targeting-sgRNA) und sgRNA-Rorc (sgRNA, die auf das RORγt-Gen abzielt). p &lt; 0,001 (t-Test eines ungepaarten zweiseitigen Studenten; die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Komponenten der PCR-Reaktion</td>
			<td colspan="4">PCR-Programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestandteil</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
			<td>Schritt</td>
			<td>Aushilfe.</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × Phanta Mix (Farbstoff Plus)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>3 Minuten</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>15 Sek.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer-F (10 μM)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56 ºC</td>
			<td>15 Sek.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Primer-R (10 μM)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72 ºC</td>
			<td rowspan="2">5 min 30 s</td>
			<td>Gehen Sie zu Schritt 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 ×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorlage (~30 ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72 ºC</td>
			<td>5 Minuten</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12 ºC</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: PCR-Reaktionskomponenten und PCR-Programm für die Konstruktion von gRNA-Vektoren.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

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