Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Diese Studie bietet ein Standardprotokoll zur Untersuchung der Differenzierung von Th17-Zellen, einer Untergruppe von T-Helferzellen, die eine Schlüsselrolle bei Immunantworten spielen. Durch retrovirale Transduktion von Guide-RNA in primäre T-Zellen von Cas9-transgenen Mäusen können Wissenschaftler die besondere Funktion der Gene bei der Regulierung der Th17-Differenzierung untersuchen. In dieser Studie wird die CRISPR-Cas9-Technologie für eine präzise Geneditierung verwendet und die retrovirale Transduktion genutzt, um spezifische Gene in primären T-Zellen effizient zu adressieren.

Die Durchflusszytometrie wird zur Bewertung der Transduktionseffizienz und zur Überwachung der Zelldifferenzierung eingesetzt. In vitro werden Th17-Polarisationen durchgeführt, um die Differenzierung von CT4+T-Zellen zu stimulieren. Unsere Forschung zielt darauf ab, die Lücken im Verständnis darüber zu schließen, wie bestimmte Gene die Th17-Differenzierung regulieren.

Wir verwenden CRISPR-Cas9 zusammen mit retroviraler Transduktion, die eine schnellere und kostengünstigere Alternative zu herkömmlichen Knockout-Mausmodellen bietet. Unser Protokoll beschreibt nicht nur die retrovirale Transduktion von CD4-T-Zellen, sondern bietet auch einen umfassenden Leitfaden für unser Training von sgRNA-Sequenzen und die Konstruktion von Plasmiden, der in anderen Protokollen übersehen wird. In diesem Artikel werden die einzelnen Schritte des experimentellen Prozesses beschrieben, um sicherzustellen, dass andere Forscher die Methodik leicht replizieren können.

Verwenden Sie zunächst das CRISPick-Tool, um die Single-Guide-RNA für den ROR Gamma T-Knockout zu entwerfen. Legen Sie das Referenzgenom auf Maus-GRCM 38 fest, und geben Sie die PAM-Sequenz als NGG an, basierend auf dem CRISPRko-Guide-System. Geben Sie den Namen des Zielgens in das Suchfeld in der Spalte Quick Gene Lookup ein.

Stellen Sie sicher, dass das System die richtige Gen-ID und den vollständigen Namen des Zielgens anzeigt, um eine genaue Auswahl zu gewährleisten. Wählen Sie eine einzelne Guide-RNA aus, die auf die RORC-Sequenz abzielt, basierend auf der hohen kombinierten Rang- und Auswahlreihenfolge, um Off-Target-Übereinstimmungen zu minimieren und die On-Target-Wirksamkeit zu erhöhen. Wählen Sie die Non-Targeting-Single-Guide-RNA-Sequenz aus den Mouse Gecko V2-Bibliotheken aus.

Amplifizieren Sie die Single-Guide-RORC- und Single-Guide-Non-Target-kodierenden Sequenzen unter Verwendung der DNA-Polymerase in einer PCR mit Primern, die für die Singleguide-RNA- und Vektorsequenzregionen entwickelt wurden. Klonieren Sie die amplifizierten Sequenzen in den PMXU 6MCS-Vektor und platzieren Sie sie zwischen dem U6-Promotor und dem Guide-RNA-Gerüst im Rahmen mit dem fluoreszierenden mCherry-Protein. Richten Sie dann ein PCR-Programm für die Vektorkonstruktion ein.

Einen Tag vor der Transfektion säen Sie etwa achtmal 10 hoch sechs Plat-E-Zellen in einer 10-Zentimeter-Schale, die DMEM enthält, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen. Eine Stunde vor der Transfektion wird das Zellkulturmedium durch acht Milliliter warmes, reduziertes Serummedium ohne Phenolrot ersetzt, das 5 % FBS, aber kein Penicillin oder Streptomycin enthält.

Bereiten Sie die Transfektion vor, Mix 1 und Mix 2. Tropfen für Tropfen Mix 2 bis Mix 1 hinzufügen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie die Mischung 15 bis 20 Minuten lang bei 20 bis 25 Grad Celsius.

Während Sie die Platte vorsichtig schwenken, geben Sie die Transfektionsmischung Tropfen für Tropfen zu den Plat-E-Zellen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für sechs bis zwölf Stunden. Ersetzen Sie nach der Inkubation das Medium durch 10 Milliliter frisches Zellkulturmedium und inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Beurteilen Sie die Transfektionseffizienz in Plat-E-Zellen durch Nachweis des retroviralen Vektor-Tags mittels Fluoreszenzmikroskopie. Als nächstes zentrifugieren Sie den virushaltigen Kulturüberstand 10 Minuten lang bei 1.500 G, um Zellfragmente zu entfernen. Aliquotieren Sie den virushaltigen Überstand in Ein-Milliliter-Fläschchen.

Beschichten Sie zunächst jede Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte mit zwei Mikrogramm Anti-CD3-Epsilon pro Milliliter und vier Mikrogramm pro Milliliter Anti-CD28 in 500 Mikrolitern PBS. Wickeln Sie die Platte in Parafilm ein und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Entnahme der Milz der Maus mahlen Sie sie in FACS-Puffer mit sterilisiertem Mahlglas, um das Gewebe zu einer Einzelzellsuspension zu homogenisieren.

Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie die Milzzellsuspension fünf Minuten lang bei 800 g und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Erythrozytenlysepuffer. Lassen Sie die Mischung fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen.

Fügen Sie dann FACS-Puffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 Millilitern zu erreichen. Nach der Zentrifugation werden die Splenozyten in FACS-Puffer resuspendiert und durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb filtriert. Stellen Sie das endgültige Volumen mit FACS-Puffer auf einen Milliliter ein und isolieren Sie die CD4+T-Zellen mit handelsüblichen Reagenzien-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Markieren Sie die CD4+T-Zellen mit einer Mischung aus fluoreszierenden Antikörpern. Nachdem Sie die gefärbten Zellen mit FACS-Puffer gewaschen haben, isolieren Sie die naiven CD4+T-Zellen mit einem Durchflusszellensortierer. Nachdem Sie den plattengebundenen Stimulationsüberstand entfernt haben, spülen Sie nun jede Vertiefung einer 24-Well-Platte zweimal mit 500 Mikrolitern PBS.

Eins mal 10 hoch sechs naive CD4+T-Zellen in einen Milliliter Lymphozyten-Kulturmedium in jede Vertiefung geben und 18 bis 24 Stunden inkubieren. Sammeln Sie am nächsten Tag die aktivierten Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 800 g. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter der Infektionsmischung und geben Sie einen Milliliter der Mischung in die Vertiefungen einer 48-Well-Platte.

Wickeln Sie die Platte mit Parafilm ein und zentrifugieren Sie sie 90 Minuten lang bei 800 g bei 32 Grad Celsius, wobei die Beschleunigung und Verzögerung auf drei eingestellt sind. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Parafilm und inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang. Zur Herstellung von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) resuspendieren Sie die Splenozyten in einem Milliliter Lymphozyten-Kulturmedium, das 50 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin in einem 15-Milliliter-Röhrchen enthält.

Inkubieren Sie Milnozyten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie dann PBS zur 15-Milliliter-Marke und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 800 g. Resuspendieren Sie die Splenozyten in einem Milliliter Lymphozytenkulturmedium und zählen Sie die Zellzahl auf einer Zellzählermaschine.

Nach der retroviralen Infektion zentrifugieren Sie die transduzierten CD4+T-Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren die infizierten Zellen in 600 Mikrolitern PBS. 0,5 mal 10 hoch sechs transduzierte CD4+T-Zellen in einen Milliliter Lymphozyten-Kulturmedium mit 1,5 mal 10 hoch sechs APC-Zellen in eine Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte geben. Ergänzen Sie mit zwei Mikrogramm Anti-CD3-Epsilon pro Milliliter, zwei Mikrogramm pro Milliliter Anti-CD28 und einem Th17-Differenzierungscocktail.

Kultivieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach zwei Tagen zentrifugieren Sie die Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Lymphozytenkulturmedium, das drei Nanogramm pro Milliliter TGF Beta und 30 Nanogramm pro Milliliter Interleukin enthält 6. Übertragen Sie die Zellen für zwei Tage in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte.

Behandeln Sie die differenzierten Zellen mit 50 Nanogramm pro Milliliter PMA, 500 Nanogramm pro Milliliter Ionomycin und fünf Mikrogramm pro Milliliter Brefelden A in 500 Mikrolitern Lymphozytenkulturmedium in einer neuen Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie die behandelten Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter FACS-Puffer.

Nach der Zentrifugation färben Sie die Zellen 30 Minuten lang mit PBS, das ein fluoreszierendes Antikörpergemisch bei vier Grad Celsius enthält. Waschen Sie die gefärbten Zellen mit 300 Mikrolitern PBS, bevor Sie sie 60 Minuten lang mit 300 Mikrolitern 2%phosphatgepuffertem Formaldehyd bei vier Grad Celsius fixieren. Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, resuspendieren Sie sie in 600 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 800 g.

Färben Sie die Zellen mit Anti-Interleukin-17A-Antikörper in 100 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Die retrovirale Infektionseffizienz, wie sie durch mCherry-positive Zellen angezeigt wird, betrug etwa 40 %. Die Th17-Differenzierungseffizienz war in Zellen, die mit Single-Guide-RNA behandelt wurden, die auf das ROR Gamma T-Gen abzielte, signifikant reduziert. Die Expressionsniveaus von RORC und Interleukin 17A waren in Zellen, die mit Single-Guide-RNA-RORC behandelt wurden, signifikant verringert.