Name: Optimiertes Protokoll für intestinale Swiss Rolls und Immunfluoreszenzfärbung von in Paraffin eingebettetem Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Lernen Sie die Swiss-Roll-Technik für intestinale Gewebeproben und Immunfluoreszenzfärbung an Mausmodellen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse und detaillierte Visualisierung aller Darmregionen in einem einzigen Paraffinblock.

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Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) Grants K01 DK121869 an ACE unterstützt, und diese Veröffentlichung wurde teilweise von T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) und den HCS Cornerstone Grants für SAD & RS unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Startkapital von der Medical University of South Carolina (MUSC) bis ACE unterstützt und vom MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) und dem COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475) unterstützt. Die Bildgebung wurde mit dem Zell- und molekularen Bildgebungskern am MUSC durchgeführt.

Effiziente Swiss-Roll-Methode zur hochwertigen Immunfärbung von Darmgewebe

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Gewebefixierung mit der Swiss-Roll-Technik vor, um die Darmarchitektur zu erhalten und eine genaue Immunfärbung zu fördern. Einmal gemeistert, kann diese Technik zur Untersuchung einer Vielzahl von Forschungsfragen im Zusammenhang mit der Darmphysiologie und Zellbiologie verwendet werden19. Mehrere optimierte Schweizer Walzverfahren wurden publiziert und sind sehr nützlich20,21. Ein Vorteil dieser Technik ist die Leichtigkeit, den Darm auf Filterpapier genau zu öffnen. Dadurch kann das Gewebe flach fixiert werden, wodurch verhindert wird, dass sich das Gewebe beim Rollen nach innen krümmt, was besonders bei der Analyse von entzündetem Gewebe mit verdickter Muskulis hilfreich ist. Darüber hinaus ist es wichtig, die entscheidende Rolle des Gewebeschnitts bei der Erzielung zuverlässiger Ergebnisse hervorzuheben. Die richtige Schnittbildung gewährleistet die Erhaltung der Gewebearchitektur und erleichtert eine genaue Immunfärbung, was letztendlich zum Erfolg nachgelagerter Analysen beiträgt11. Der optimierte Ansatz ist im Vergleich zu anderen Protokollen weniger schwierig und führt zu konsistenten Ergebnissen bei verschiedenen Personen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Technik bietet auch eine gut erhaltene Gewebearchitektur, Vielseitigkeit und eine hochgradig reproduzierbare Immunfärbung mit verschiedenen Antikörpern.
Ein kritischer Aspekt dieses Protokolls ist die Fixierungs- und Verarbeitungszeit. Eine unsachgemäße Fixierung und Verarbeitung des Gewebes kann die histochemischen Analysen beeinträchtigen. Zu fixiertes Gewebe wird spröde, während unterfixiertes Gewebe zu weich bleibt. Sowohl über- als auch unterfixiertes Gewebe sind schwer zu schneiden und beeinträchtigen die Immunfärbung. Nach dem Präparieren auf Filterpapier sollte das Gewebe sofort in Formalin gelegt werden, um postmortale Veränderungen zu reduzieren22. Bei diesem Protokoll wird murines Gewebe über Nacht in Formalin fixiert. Mehrere Studien haben diese Fixationszeit verwendet 20,23,24. Boenisch et al. zeigten jedoch, dass die Immunfärbung in Gewebe, das bis zu 4 Tage lang mit Formalin fixiert war, konsistent ist25. Eine Optimierung der Fixierzeit und des Fixiermittels ist in Abhängigkeit von den gewünschten Analysen erforderlich. Zum Beispiel wird das Fixiermittel von Carnoy häufig für die Verfärbung von Schleimbevorzugt 26. Die Wahl der Fixiermittel und die Dauer der Fixierzeit sollten von jedem Forscher in Abhängigkeit von seinem experimentellen Ansatz optimiert werden. Die Verwendung eines automatisierten Gewebeprozessors wird empfohlen, um genaue und konsistente Verarbeitungszeiten zu gewährleisten. Unser Labor verwendet kleine Stifte, um das Darmgewebe als Rollen an Ort und Stelle zu halten. Ohne Stecknadeln kann sich das Gewebe während der Verarbeitung lösen. Da diese Stifte recht klein und scharf sind, müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Wir empfehlen die Verwendung eines Drahtschneiders, um das scharfe Ende des Stifts vor der Gewebeverarbeitung zu entfernen. Einige histologische Kerne akzeptieren kein Gewebe mit Stiften; Daher ist es am besten, vor der Verwendung zu überprüfen. Ein alternativer Ansatz besteht darin, Agar zu verwenden, um das Gewebe vor der Verarbeitung zu verankern27 oder Kassettenschwämme könnten in Kassetten verwendet werden, um die Walzen zu halten.
Die Immunfärbung ist ein Protokoll, das eine Optimierung für jeden Antikörper erfordert. Die Verwendung von Knockout-validierten Antikörpern wird empfohlen, wann immer dies möglich ist. Diese Methode zur Gewebefixierung und -verarbeitung führt zu einer klaren Färbung, die eine einfache Identifizierung der Antikörperbindung im Vergleich zum Hintergrundsignal ermöglicht, wenn nicht validierte Antikörper verwendet werden. Die Wahl des Fixiermittels, die Antigengewinnung und die Antikörperverdünnung können die Spezifität des Antikörpers beeinflussen. Wir empfehlen den Forschern, das Protokoll sorgfältig zu bewerten und zu optimieren, indem sie die Fixierung, die Antigengewinnung und die Inkubationszeit für jeden Antikörper anpassen. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten Antikörper in verschiedenen Verdünnungen getestet werden, um die optimale Konzentration zu bestimmen, und in verschiedenen Antigen-Retrieval-Puffern. Die Epitopgewinnung verbessert die Immunfärbung, indem sie Methylenbrücken aufbricht, die während der Fixierung gebildet werden. In diesem Protokoll wird die hitzeinduzierte Epitopgewinnung anstelle der proteolytisch induzierten Epitopgewinnung verwendet, da der Enzymverdau die Gewebemorphologie mit größerer Wahrscheinlichkeit stört28. Die gebräuchlichsten hitzeinduzierten Epitop-Retrieval-Puffer sind Citratpuffer, Tris-HCl und Tris-EDTA, wobei Citratpuffer am schonendsten für die Gewebemorphologieist 29. Die Wahl des Puffers variiert und sollte für jeden Antikörper bestimmt werden. Viele Antigen-Retrieval-Puffer, Blockierungslösungen und Antikörperverdünnungsmittel sind im Handel erhältlich. Diese Lösungen können jedoch extrem teuer und unerschwinglich sein. Wir stellten Rezepturen für gängige Antigen-Retrieval-Lösungen sowie Blockierungs- und Antikörperverdünnungslösungen zur Verfügung, um die Kosteneffizienz zu gewährleisten. 
Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Fixierung und Verarbeitung Gewebe- und Maskenepitope verändern kann. Ein alternativer Ansatz ist die Immunfärbung von frischem gefrorenem Gewebe. Frisches gefrorenes Gewebe wird schockgefroren, wodurch die Exposition gegenüber toxischen Fixiermitteln vermieden wird, die Proteinstruktur erhalten bleibt und die Zugänglichkeit einiger Epitope verbessert wird. Die Gewebearchitektur und -morphologie sind jedoch schlechter als die von fixiertem und paraffineingebettetem Gewebe. Zu den weiteren Herausforderungen bei frischem gefrorenem Gewebe gehören die Materialien und die Logistik, die für das Schneiden und Lagern von gefrorenen Blöcken und Objektträgern erforderlich sind. Die Analyse von Schweizer Rollen im Vergleich zu Streifen aus Darmgewebe zeigt Unterschiede in der Höhe und Breite der Zotten und Unterschiede in den Immunzellen in der Lamina propria, wie in einem früheren Berichtbeschrieben 30. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass intestinale Schweizer Brötchen einige Darmmerkmale verändern, was bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden sollte. Darüber hinaus ist eine Antikörper-Revalidierung erforderlich, da viele Antikörper, die spezifisch an formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe binden, in frischem gefrorenem Gewebe nicht gut abfärben31.
Die Immunfärbung von Darmgewebe kann zur Beantwortung einer Vielzahl von Fragen der gastrointestinalen Zellbiologie und Physiologie eingesetzt werden. Diese Technik wird häufig verwendet, um epitheliale Veränderungen im Rahmen von Darmentzündungen, nach bakteriellen Infektionen und während des Fortschreitens von Krebs zu identifizieren. Die hier vorgestellte Methode eignet sich hervorragend für die Konservierung von Darmgewebe, da sie kostengünstig, technisch nicht anspruchsvoll und hochgradig reproduzierbar ist. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, ermutigen wir zur Optimierung der in diesem Protokoll beschriebenen Schritte auf der Grundlage des Versuchsdesigns und der zu testenden Hypothese.

Die zelluläre Architektur des Darms stellt eine einzigartige Herausforderung für die Aufrechterhaltung seiner strukturellen Integrität dar, wenn Darmgewebe für die Immunfärbung konserviert wird. Der Dünndarm besteht aus länglichen, fingerartigen Strukturen, die als Zotten1 bekannt sind. Diese Zotten werden während der Einbettungsprozesse oft missgebildet. Für eine robuste experimentelleAnalyse ist es von entscheidender Bedeutung, sicherzustellen, dass die Forscher über Techniken zur korrekten Einbettung des Darms verfügen, um Querschnitte zu erzielen, die eine Visualisierung aller Regionen des Darms sowie der Schichten, aus denen der Darm besteht (d. h. Muscularis propria, Mukosa und die Serosa), ermöglichen. Eine unzureichende Fixierung, eine übermäßige Fixierung und eine unsachgemäße Handhabung des Gewebes beeinträchtigen die Integrität des Gewebes, was zu einer unbeabsichtigten Schädigung des Darmepithels führt 3,4. Eine Schädigung des Darmepithels während dieser Schritte kann die Qualität nachfolgender Analysen, wie z. B. der Immunfluoreszenz, erheblich beeinträchtigen, unabhängig von der Wirksamkeit der immunhistochemischen Protokolle und der verwendeten Antikörper.
Die Immunfärbung ist, wie die richtige Gewebefixierung, ein wichtiger Bestandteil der biomedizinischen Forschung. Wenn sie gut gemacht wird, kann die Immunfärbung bisher unbekannte Aspekte der Zellstruktur und -funktion beleuchten. Die Immunfluoreszenzfärbung von Paraffinschnitten kann aufgrund physikalisch-chemischer Modifikationen, die sich aus dem Fixierungs- und Paraffineinbettungsprozess ergeben, eine Herausforderung darstellen5. Die Fixierung und Paraffineinbettung führt zu einer Antigenmaskierung, die die Immunfluoreszenzdetektion von Epitopen von Interesse beeinträchtigen kann6. Eine verzögerte Fixierung kann zu einer proteolytischen Degradation führen, was zu einer geschwächten oder fehlenden Färbung kritischer Epitope führt7. Darüber hinaus sind Antikörper bei hohen Hintergrundwerten oft ungenau. Immunfärbeprotokolle, die eine konsistente und spezifische Antikörperbindung und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis fördern, können wertvolle Informationen für Forscher liefern. 
Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Verfügung, das entwickelt wurde, um qualitativ hochwertige Immunfluoreszenzbilder durch Fixierung des Darmgewebes, Schweizer Rollenvorbereitung8 und Immunfärbung zu erhalten. Das Protokoll legt den Schwerpunkt auf Richtlinien zur Erhaltung der Integrität des Darms und zielt darauf ab, den Forschern eine robuste Methodik an die Hand zu geben, um die Qualität und Zuverlässigkeit von Immunfluoreszenz-Bildgebungsstudien zu verbessern. Wir haben auch versucht, kostengünstige Ressourcen zu verwenden, darunter Filterpapier und hausgemachte Antigengewinnung, Blockierungslösungen und Antikörperverdünnungsmittel, um das Protokoll für Labore zugänglicher zu machen, die möglicherweise nur über begrenzte Mittel verfügen. Wie bei allen experimentellen Protokollen sollten Forscher das aktuelle Protokoll auf der Grundlage ihres experimentellen Ansatzes und ihrer Interessengebiete optimieren.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>Zellulose-Filterpapier</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>Dickes Whatman-Papier</td></tr><tr><td>Objektträger aus geladenem Glas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadeln Größe 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierhandschuhe</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>Objektträgerwärmer</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>64111-04</td><td>Clearing-Reagenz</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophober Stift</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>Große Kassetten</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Maus-auf-Maus-Blockierungsreagenz</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>Maus-auf-Maus-Block</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Schnellkochtopf</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Einbettmedium</td></tr><tr><td>Umkehrzange</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgergestell</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger-Färbeset</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>Lösungsmittelbeständiges Geschirr und Metallrahmen</td></tr><tr><td>Kleine Kassetten</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat-Dihydrat</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Tücher</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylole</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

optimiertes protokoll für intestinale swiss rolls und immunfluoreszenzfärbung von in paraffin eingebettetem gewebe

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

Der Darm ist ein komplexes Organ, das sich aus dem Dünn- und dem Dickdarm zusammensetzt. Der Dünndarm kann weiter in Duodenum, Jejunum und Ileum unterteilt werden. Jede anatomische Region des Darms hat eine einzigartige Funktion, die sich in Unterschieden in der Zellstruktur widerspiegelt. Um Veränderungen im Darm zu untersuchen, bedarf es einer vertieften Analyse verschiedener Geweberegionen und zellulärer Veränderungen. Um den Darm zu untersuchen und große Gewebestücke sichtbar zu machen, verwenden Forscher häufig eine Technik, die als Darmrollen bekannt ist. Bei dieser Technik wird der Darm in jede anatomische Region unterteilt und in einer flachen Ausrichtung fixiert. Anschließend wird das Gewebe sorgfältig gerollt und für die Paraffineinbettung verarbeitet. Die richtige Fixierung und Ausrichtung des Gewebes ist eine oft übersehene Labortechnik, die jedoch für die nachgelagerte Analyse von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus kann ein unsachgemäßes Rollen des Darmgewebes das empfindliche Darmepithel schädigen, was zu einer schlechten Gewebequalität für die Immunfärbung führt. Die Sicherstellung eines gut fixierten und richtig ausgerichteten Gewebes mit intakten Zellstrukturen ist ein entscheidender Schritt, um eine optimale Visualisierung der Darmzellen zu gewährleisten. Wir stellen eine kostengünstige und einfache Methode zur Herstellung von Schweizer Rollen vor, bei der alle Teile des Darms in einem einzigen, in Paraffin eingebetteten Block enthalten sind. Wir beschreiben auch eine optimierte Immunfluoreszenzfärbung von Darmgewebe, um verschiedene Aspekte des Darmepithels zu untersuchen. Das folgende Protokoll bietet Forschern einen umfassenden Leitfaden zur Gewinnung hochwertiger Immunfluoreszenzbilder durch Fixierung des Darmgewebes, Swiss-Roll-Technik und Immunfärbung. Die Anwendung dieser verfeinerten Ansätze bewahrt die komplizierte Morphologie des Darmepithels und fördert ein tieferes Verständnis der Darmphysiologie und Pathobiologie.

Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&amp;E) wurde, wie zuvor beschrieben, durchgeführt12. Mit der optimierten Methode enthielten die Darmrollen alle drei Segmente des Dünndarms und des Dickdarms auf einem einzigen Objektträger. Die Unterbringung des gesamten Darms auf einem Objektträger ermöglicht es den Forschern, Veränderungen in allen Teilen des Darms zu analysieren und Kosten für das Schneiden und Färben von Reagenzien zu sparen (Abbildung 1). Wenn bei der Immunfärbung alle Darmsegmente gleichzeitig denselben Lösungen ausgesetzt werden, können genaue Ergebnisse erzielt werden. Die H&amp;E-Mikroskopaufnahme zeigt die erhaltene Darmarchitektur aller Teile des Dünndarms und des Dickdarms (Abbildung 2). Die Messung der Zwölffingerdarmzotten zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Höhe der Zotten im ungeöffneten Darmgewebe im Vergleich zu dieser Swiss-Roll-Methode, was darauf hindeutet, dass die Öffnung des Darms die Gewebearchitektur nicht stört (Abbildung 2D). Die Immunfärbung von intestinalen Schweizer Rollen zeigt die verschiedenen Schichten des Darms sowie die gesamte Zottenkryptenachse. Die Fluoreszenzbilder zeigen niedrige Hintergrundwerte aus der Primär- und Sekundärantikörperfärbung und zeigen deutlich die einzelnen im Epithel vorhandenen Zellen. Abbildung 3 zeigt die Morphologie verschiedener Darmsegmente und die Färbung für Becherzellen (MUC2-positive Zellen)13, die apikale Membran (γ-ACTIN)14, die laterale Membran von Epithelzellen (E-CADHERIN)15 und Zellkerne. Dieses Protokoll eignet sich zur Identifizierung vieler verschiedener zellulärer Kompartimente, einschließlich proliferativer Zellen (PCNA)16, Interstitium (LAMININ; Abbildung 4A) 17, die lysosomale Domäne (LAMP1)14 und das Epithel (β-CATENIN; Abbildung 4B) 18. Urheberrecht
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Zubereitung und Verarbeitung von Schweizer Brötchen im Darm. (A) Die Darmsegmente werden mit einer Spritze mit PBS gespült und dann in PBS gewaschen. (B) Das feuchte Darmgewebe wird dann auf trockenes Filterpapier gelegt. (C) Der Darm wird auf Filterpapier in Längsrichtung aufgeschnitten und (D) sanft gespreizt. (E) Ein Stück Filterpapier wird auf den geöffneten Darm gelegt, und der Darm wird vorsichtig zwischen das Filterpapier gelegt und geheftet. Die Darmsegmente werden über Nacht fixiert und (F) wird mit einer Pinzette gerollt. (G) Der Darm wird sanft von der umgekehrten Pinzette gelöst und (H) hat ein rosettenförmiges Aussehen. (I, J) Das Darmgewebe wird festgesteckt und in eine große Kassette gelegt. (K) Alle vier Darmsegmente werden zur Gewebeaufbereitung und -einbettung in dieselbe Kassette gelegt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Hämatoxylin- und Eosin-Färbung aller vier Darmsegmente. (A) Das Kachelscannen demonstriert die Fähigkeit, den gesamten Darm in einem einzigen Objektträger mit einzelnen Schweizer Rollen des Zwölffingerdarms, des Jejunums, des Ileums und des Dickdarms zu visualisieren. (B) Mikroskopische Aufnahme einer intestinalen Schweizer Rolle und (C) Einsatz mit höherer Vergrößerung, um die Zotten und die Kryptenarchitektur zu zeigen. (D) Die Quantifizierung der Länge der Dünndarmzotten in der zeigt keinen signifikanten Unterschied zwischen Schweizer Rollengewebe und ungeöffnetem Gewebe. Maßstabsbalken = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> Abbildung 3: Immunfluoreszenzfärbung aller vier Darmsegmente. Adulte C57BL/6J-Kontrollmäuse wurden immungefärbt für Zellkerne (cyan), den lateralen Membranmarker, E-CADHERIN (grün), Becherzellen, die durch MUC2 (gelb) identifiziert wurden, und den apikalen Bürstenrandmarker, γ-ACTIN, (magenta). Maßstabsleisten = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung des Darms. (A) Eine repräsentative mikroskopische Aufnahme der Immunfluoreszenzfärbung des Darms von Mäusen hebt Zellkerne (cyan), proliferative Zellen, PCNA (grün) und Lamina propria, LAMININ (magenta) hervor. (B) Immunfluoreszenzbild zur Identifizierung von Zellkernen (cyan), des Zellmembranmarkers β-CATENIN (grün) und des Lysosomenmarkers LAMP1 (magenta) im Darm. Maßstabsleisten = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Der Darm ist wichtig für die Verdauung und Resorption. Jede Region - Duodenum, Jejunum, Ileum, Dickdarm - erfüllt aufgrund einzigartiger zellulärer Strukturen unterschiedliche Funktionen. Das Studium der Darmphysiologie erfordert eine sorgfältige Gewebeanalyse. Dieses Protokoll beschreibt die Gewebefixierung und -verarbeitung mit der Swiss-Roll-Technik, um eine genaue Immunfärbung durch die richtige Gewebekonservierung und -ausrichtung zu gewährleisten.

Optimiertes Protokoll für intestinale Swiss Rolls und Immunfluoreszenzfärbung von in Paraffin eingebettetem Gewebe

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Visualisierung von Darmbüschelzellen in frei schwebenden Jejunum-Kryosektionen von Mäusen. Innerhalb der Darmzotten deutet die Kolokalisation von grüner Fluoreszenz an der luminalen Spitze mit einer ausgedehnten roten Wurzelmasse auf das Vorhandensein von Büschelzellen hin.

Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Visualisierung von Büschelzellen in Jejunum-Kryosektionen

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mausmodelle

Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Epithelzellen entlang der Darmschleimhaut sind wesentlich unterschiedlichen Zelllinien zu definieren. Die richtige Darstellung von Darmgewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Identifizierung von Proteinexpressionsmuster mit maximaler Auflösung. Diese Studie hat zum Ziel, die optimalen Verfahren und Bedingungen für die Verarbeitung der Maus Darmgewebe zu beschreiben.

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Wir präsentieren Protokolle zur Isolierung der intestinalen 3D-Strukturen aus in-Vivo -Gewebe und in-vitro- Keller-Matrix eingebettet, Organellen, und Detail verschiedene Fixierung und Färbung Protokolle für Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli optimiert, centrosomal und Knoten Proteine sowie Handy-Marken einschließlich des Stammzell-Proteins Lgr5.

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

Kuga Et Al. entdeckt, dass Phosphorylierung-Status spezifische Antikörper gegen die Aktin bindende Protein girdin phosphoryliert an Tyrosin 1798 (pY1798) verwendet werden können, um Büschel Zellen (TCs) zu bezeichnen. Dieses Protokoll ermöglicht robuste Visualisierung von TCs mit immunofluorescent Färbung des frei schwebenden Jejunum Cryosections mit pY1798 Antikörpern.

Verwendung von Anti-Phospho-girdin Antikörper gegen Darm Büschel Zellen frei schwebenden Maus Jejunum Cryosections visualisieren

Die systematische Bewertung von Darmentzündungen mit einem freien computergestützten System ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um histopathologische Veränderungen in Kolitismodellen, die durch das Vorhandensein von Geschwüren und entzündlichen Veränderungen gekennzeichnet sind, quantitativ zu vergleichen. Die auswertung der histologischen Colitis-Score-Bewertung stärkt klinische Beobachtungen und erleichtert die Dateninterpretation.

Systematische Scoring-Analyse für Darmentzündungen in einem Murine Dextran Natriumsulfat-induzierte Colitis Modell

Dieses optimierte Protokoll beschreibt einen Workflow zur Erkennung und Abbildung von Bakterien in komplexen Gewebeproben, von der Fixierung des Gewebes bis zur Färbung von Mikroben mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung .

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.

Immunkompetentes Darm-on-Chip-Modell zur Analyse der Immunantworten der Darmschleimhaut

Dieses Protokoll beschreibt eine Immunfärbungsmethode für den ganzen Magen, die von der ursprünglich für den Mausdarm entwickelten "Swiss Roll"-Technik abgewandelt wurde.

Verbesserte räumliche Abbildung der Magenmuskelschichten der Maus mit einer modifizierten Swiss Roll-Technik

Lernen Sie die Swiss-Roll-Technik für intestinale Gewebeproben und Immunfluoreszenzfärbung an Mausmodellen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse und detaillierte Visualisierung aller Darmregionen in einem einzigen Paraffinblock.

Optimiertes Protokoll für intestinale Swiss Rolls und Immunfluoreszenzfärbung von in Paraffin eingebettetem Gewebe

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