Molekulare Bildgebung von Organoiden des menschlichen Gehirns mittels Massenspektrometrie

Wir untersuchten die Metabolomik des sich entwickelnden menschlichen Gehirns. Eine Herausforderung für die Untersuchung in vivo. Um dies zu adressieren, verwenden wir in vitro Gehirn-Organoidmodelle und fortschrittliche spezielle Metabolomik-Techniken.

Fortschrittliche, auf Mastertechnologie basierende Technologien wurden in den letzten Jahren schnell für die Charakterisierung von Organoiden eingesetzt, ein Trend, der sich voraussichtlich fortsetzen wird. Jüngste metabolomische Studien mit massenspektrometrischer Bildgebung oder MSI zeigen die Vorteile von Organoidmodellen beim Verständnis der molekularen Mechanismen der menschlichen Entwicklung und Krankheit, einschließlich seltener Erkrankungen, und Anwendungen in der personalisierten Medizin. Die Aufrechterhaltung der molekularen Integrität und Morphologie von Organoiden während der molekularen Bildgebung ist eine Herausforderung und erfordert eine präzise Probenhandhabung und -vorbereitung. Um dies zu adressieren, wurde eine spezielle Technik für die hochauflösende Multi-MALDI-MSI-Analyse von Gehirnorganoiden entwickelt. Es optimiert das Massenspektrum zwischen Bildgebungsbedingungen, Immatrikulation und Gewebekonservierung, um zuverlässige, qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten. Dieses umfassende Protokoll demonstriert das hochauflösende MSI-Potenzial und gibt den Forschern die Ressourcen, die sie benötigen, um diese Technologie vollständig zu nutzen, um die metabolomische Topographie von Organoiden im Detail zu untersuchen.

Unsere Forschung wird unser Verständnis der Neurogenese bekannt geben, eines Metaboliten, der mit bestimmten Zelltypen in Gehirnorganoiden assoziiert ist. Dieses detaillierte metabolische Profiling wird nicht nur die Rolle dieser Metaboliten in der Gehirnentwicklung beleuchten, sondern auch potenzielle Ziele für therapeutische Interventionen identifizieren, die neurologische Entwicklungsstörungen imitieren.

[Erzähler] Zu Beginn wird der Kolben mit den Hirnorganoiden, die aus den induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, aus dem Inkubator genommen. Übertragen Sie die Organoide mit breiten Spitzen aus dem Kolben in die Schale. Waschen Sie die Organoide dreimal mit DPBS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, um das Medium zu spülen. Spülen Sie dann schnell mit destilliertem Wasser ab, um alle Salze aus dem DPBS zu entfernen. 10 mg Gelatine aus kalter Fischhaut werden in einen Kolben mit 100 Millilitern DPBS gegeben. Erhitze und rühre die Mischung bei 70 bis 80 Grad Celsius zwei Stunden lang. Bringen Sie die Lösung dann für 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um Blasen zu entfernen. Stecken Sie das Organoid mit einer kleinen Pipettenspitze in die Mitte einer Kunststoffform. Gießen Sie die 10%ige Gelatine-Einbettlösung vorsichtig in die Form, bis das Organoid vollständig eingetaucht ist. Lege die Form in eine Petrischale, die 100% kaltes Ethanol auf Trockeneis enthält. Wenn er vollständig eingefroren ist, was sich in der Veränderung der Farbe zu festem Weiß zeigt, entfernen Sie den organoiden Gelatineblock aus der Petrischale. Wickeln Sie den Block in Alufolie ein oder legen Sie ihn in einen Blechbecher. Versiegeln und lagern Sie den Block bei minus 80 Grad Celsius, bis er für den Kryoschnitt bereit ist. Für den Kryoschnitt legen Sie die Kunststoffblöcke mit Organoiden für 10 bis 15 Minuten in die bei minus 20 Grad Celsius eingestellte Kryokammer. Teilen Sie dann die Organoide auf dem Kryotom in 14-Mikrometer-Abschnitte und montieren Sie sie auf mit Indiumzinnoxid beschichtete Glasobjektträger für die Massenspektrometrie-Bildgebung oder MSI. Lagern Sie die Objektträger bis zur Bildgebung bei minus 80 Grad Celsius. Entfernen Sie zunächst den mit Indiumzinnoxid beschichteten Objektträger, der mit Organoidschnitten des Gehirns montiert ist, bei minus 80 Grad Celsius. Legen Sie den Objektträger für 20 Minuten in ein Trockenmittel, um die Kondensation von atmosphärischem Wasser auf der Oberfläche zu minimieren. Nach der Trocknung werden mit einem beheizten pneumatischen Sprühgerät 10 Milligramm pro Milliliter NEFZ in 70%igem Methanol auf die Organoidabschnitte gesprüht. Um eine hochauflösende MALDI MSI-Plattform zur Visualisierung von Organoid-Metaboliten im Gehirn zu erreichen, mounten Sie die Ionenquelle mit einer Dual-Ionen-Trichter-Schnittstelle auf ein Massenspektrometer. Verwenden Sie einen angeschlossenen ND-Laser mit Q-Schaltfrequenz, verdreifachter Frequenz mit einer Wellenlänge von 349 Nanometern, einer Wiederholrate von einem Kilohertz und einer Pulsenergie von etwa 1,3 bis 1,4 Mikrojoule. Um Oversampling zu vermeiden, fokussieren Sie den Laser auf eine Punktgröße von ca. 15 Mikrometern Durchmesser. Befestigen Sie die Probe an der MALDI-Injektorstufe. Betrieb und Wartung des Hochdruck-Ionentrichters bei 7,4 bis 7,5 Torr und des Niederdruck-Ionentrichters bei 1,6 bis 1,8 Torr. Legen Sie Hochfrequenzspannungen von 780 Kilohertz bei 191 Volt Spitze bis Spitze bis zur Tiefe und 604 Kilohertz bei 80 Volt Spitze bis Spitze an die Hochdruck-Ionentrichter an. Um die Empfindlichkeit für kleine Metaboliten im niedrigen Massenbereich zu verbessern, reduzieren Sie die HF-Amplituden im Nieder- und Hochdrucktrichter der MALDIDMSI-Quelle auf etwa 20 bzw. 15 %. Legen Sie die Massenauflösung auf 70.000 fest. Wählen Sie dann den Bereich und die Pixelgröße von 25 Mikrometern pro Pixel aus. Stellen Sie den Master-Ladungsbereich zwischen 80 und 900 sowohl im negativen als auch im positiven Ionenmodus ein. Lassen Sie die automatische Verstärkungsregelung ausgeschaltet, stellen Sie dann die Injektionszeit auf 250 Millisekunden ein und erfassen Sie im Profilmodus schärfere Transformationsmassenspektren. Importieren Sie die massenspektrometrischen Spektraldaten direkt in die kompatible Software. Führen Sie eine Basislinienkorrektur mit dem Faltungsalgorithmus durch und normalisieren Sie die Daten anhand der Gesamtionenzahl. Generieren Sie die Merkmalsliste der Ionenbilder aus den Rohdatendateien mit einer Bin-Breite von 0,01 oder 5:00 PPM, um Bilder des Master-Ladungsverhältnisses basierend auf dem Massendefekt und der Pixelabdeckung zu unterscheiden. Erzeugen Sie Falschfarben- oder RGB-Bilder von einzelnen Metaboliten-Ionenspezies. Laden Sie die Liste der Rohdatendateien, die Sie von MALDI MSI erhalten haben, in die Human Metabolome Database hoch, um Metaboliten zu identifizieren. Krebszyklus-verwandte Metaboliten in 60 Tage alten menschlichen Gehirnorganoiden wurden mittels MSI mit Fischgelatine-Einbettung räumlich kartiert.