Assemblierung von Netzhaut-Organoiden mit Mikroglia

Zu Beginn erhalten Sie die humanen embryonalen Stammzellen im Stammzellmedium mit einer Zelldichte von 80 bis 90 %Nachdem Sie das verbrauchte Medium entfernt haben, spülen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einem Milliliter 1X DPBS. Inkubieren Sie die Stammzellkolonien in jeder Vertiefung mit einem Milliliter 0,5 Millimolar EDTA für etwa fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Morphologie der Kolonie, um sicherzustellen, dass die Ränder leicht zusammengerollt sind und lose Lücken aufweisen.

Aspirieren Sie das EDTA und inkubieren Sie die Zellen erforderlichenfalls weitere ein bis zwei Minuten bei 37 Grad Celsius, jedoch nicht länger als acht Minuten. Spülen Sie die Zellen in jeder Vertiefung vorsichtig mit sechs Millilitern Medium A, das sechs Mikroliter 10 millimolare ROCK-Inhibitorlösung Y-27632 enthält. Klopfen Sie vorsichtig auf den Boden der Schüssel, um die Zellen abzuspülen.

Beobachten Sie nach 24 Stunden die Zellen unter dem Mikroskop, um die Bildung des Embryokörpers zu bestätigen. Sammeln Sie die Embryokörper mit einer 10-Milliliter-Pipette in einem 15-Milliliter-Zentrifugalröhrchen und warten Sie, bis sich die Embryokörper fünf Minuten lang am Boden abgesetzt haben. Aspirieren Sie dann vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Embryokörper in sechs Millilitern frischem Medium A. Übertragen Sie sie in eine neue Vertiefung mit geringer Adhäsion einer Sechs-Well-Platte und kultivieren Sie sie in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Am vierten Tag beschichten Sie eine 10 Zentimeter große Schale mit drei Millilitern 0,1 %iger Fischgelatinelösung und inkubieren Sie mindestens eine Stunde lang in einem 5 %igen Kohlendioxid-Inkubator mit 37 Grad Celsius. Entfernen Sie dann die Gelatinelösung und spülen Sie die Schale einmal mit fünf bis sechs Millilitern 1X DPBS aus. Sammeln Sie die Embryokörper vorsichtig in ein 15-Milliliter-Zentrifugalröhrchen und warten Sie, bis sich die Embryokörper in fünf Minuten am Boden abgesetzt haben.

Resuspendieren Sie die Embryokörper vorsichtig mit 15 Millilitern Medium B und geben Sie sie in die beschichtete 10-Zentimeter-Schale. Nach 49 Tagen eine Woche lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid kultivieren. Die Zellen werden bei 200 x g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Den Überstand vorsichtig aspirieren und die Zellen mit zwei Millilitern frischem Medium C resuspendieren. In eine neue Vertiefung mit geringer Adhäsion einer Sechs-Well-Platte überführen. Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie an Tag 56 das verbrauchte Medium durch zwei Milliliter Medium C pro Vertiefung.

Untersuchen Sie die Platte unter einem Mikroskop, um die verzweigten Mikroglia zu identifizieren, die am Boden der Vertiefung mit geringer Adhäsion haften. Um Mikroglia für die Co-Kultivierung zu ernten, ersetzen Sie vorsichtig das Medium C in jeder Vertiefung durch einen Milliliter Accutase und inkubieren Sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie die Mikrogliazellen mit einer Fünf-Milliliter-Pipette in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 x g.

Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Mikroglia mit einem Milliliter Medium E.