Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen
27. September 2024
Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.
Eine Dysfunktion der Mitochondrien wird mit vielen Krankheiten in Verbindung gebracht, insbesondere mit neurodegenerativen und metabolischen Erkrankungen. Wenn wir also verstehen können, wie Mitochondrien durch Lysosomen reguliert werden, hilft dies, neue therapeutische Strategien zu entwickeln. In diesem Protokoll haben wir eine zweifarbige CLEM-Methode zur Visualisierung des mitochondrialen Lysosomenkontakts demonstriert.
Die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie ist ein bildgebendes Verfahren, das die Vorteile der Lichtmikroskopie und der Elektronenmikroskopie vereint. In diesem Protokoll maximieren wir den Vorteil von CLEM mit zweifarbigen Sonden, um den Kontakt mit mitochondrialen Lysosomen sichtbar zu machen. Es ist schwierig, den Abbau von Mitochondrien innerhalb von Lysosomen mit herkömmlichen elektronenmikroskopischen Probenahmemethoden eindeutig zu unterscheiden.
Diese Studie präsentiert ein hochauflösendes CLEM-Ergebnis, das die Effektordomäne von Lysosomen und Mitochondrien deutlich zeigt. Die Dual-Color-Take-Methode wurde verwendet, um Mitochondrien-Effektoren innerhalb der Lysosomen genau zu unterscheiden. Unsere Forschung hat gezeigt, dass die Mitochondrien mit den Lysosomen interagieren.
Unsere Forschung hat gezeigt, dass Mitochondrien auf unterschiedliche Weise mit Lysosomen interagieren, um auf verschiedene äußere Belastungen zu reagieren. Durch die Untersuchung der Ursachen und Regulatoren dieser Phänomene werden wir Einblicke in das Verständnis der intrazellulären mitochondrialen Qualitätskontrolle gewinnen. Kultivieren Sie zunächst HeLa-Zellen mit einer Dichte von eins mal 10 hoch fünf in 35-Millimeter-Kulturschalen mit Glasgitterboden.
Am nächsten Tag werden die Zellen bei 30 % bis 40 % Konfluenz mit Plasmiden unter Verwendung des Transfektionsreagenzes co-transfiziert. Behandeln Sie die Zellen nach der Transfektion 18 Stunden lang mit Dimethylsulfoxid oder U18666A und Bafilomycin A1. Für die konfokale Bildgebung entfernen Sie das Nährmedium und fügen Sie sofort 250 Mikroliter warme Fixierlösung bei 30 bis 37 Grad Celsius hinzu.
Entfernen Sie sofort das Fixiermittel. Ersetzen Sie es durch 1,5 Milliliter frisches Fixiermittel und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Waschen Sie dann die Zellen dreimal für jeweils 10 Minuten mit einem Milliliter eiskaltem 0,1 molaren Natriumcacodylat-Puffer.
Fügen Sie als nächstes einen Milliliter kalte 20-Millimolar-Glycinlösung hinzu, um den Aldehyd zu löschen. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis inkubiert haben, waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten in kaltem 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Geben Sie dann 500 Mikroliter Amplex rote Lösung in die Probenschale und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis.
Entfernen Sie anschließend die rote Amplex-Lösung und spülen Sie die Zellen dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um den Bereich um die interessierenden Zellen im Drei-mal-Drei-Kachelscan-Modus abzubilden. Erfassen Sie sowohl differentielle Interferenzkontrast- als auch Fluoreszenzsignale, um das Raster und die Buchstaben auf der Gitterschüssel mit einem 40-fach-Objektiv zu identifizieren und aufzuzeichnen.
Bilden Sie die Zielzellen bei hoher Vergrößerung mit einem 40-fachen Objektiv ab und nehmen Sie ein Z-Stapel-Bild auf. Nach der Bildgebung der rot gefärbten Amplex-Zellen mit einem konfokalen Mikroskop fügen Sie einen Milliliter 1 % reduziertes Osmiumtetroxid bei vier Grad Celsius hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang. Spülen Sie die Probe dann dreimal für jeweils 10 Minuten mit destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius.
In einer abgestuften Ethanolserie jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur dehydrieren. Mischen Sie nun Ethanol mit Epoxidharz in Volumenverhältnissen von drei zu eins, eins zu eins und eins zu drei und bereiten Sie insgesamt 300 Mikroliter jeder Mischung vor. Gießen Sie jede Epoxidharzmischung in die Schale und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.
Bereiten Sie als Nächstes die Einbettkapsel vor, indem Sie sie mit frischem Epoxidharz füllen. Drehen Sie das Röhrchen oder die Kapsel im interessierenden Bereich auf den Kopf und stellen Sie es für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius in einen Ofen, um zu polymerisieren. Tauchen Sie dann das untere Glas und den Polymerblock in flüssigen Stickstoff, um sie zu trennen.
Legen Sie den Probenblock in den Probenhalter des Ultramikrotoms und setzen Sie ihn in den Trimmblock ein. Verwende eine Rasierklinge, um das Harz in eine rechteckige oder trapezförmige Form um das Objekt des Interesses zu trimmen. Legen Sie den beschnittenen Probenblock in den Probenhalter und stellen Sie die Diamanttrennscheibe ein.
Schneiden Sie mit einem Ultramikrotom ultradünne Schnitte von etwa 60 bis 70 Nanometern aus den flachen eingebetteten Zellen. Sammeln Sie die Serienprofile auf einem Formvar-beschichteten Schlitzgitter, bevor Sie sie auf einer Heizplatte trocknen. Anschließend färben Sie die Abschnitte zwei Minuten lang mit Kontrastmittel und eine Minute lang mit Bleicitrat.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie die Linie aus, montieren Sie alle Bilder in dieser Ebene und elastische nichtlineare Blockkorrespondenzen. Klicken Sie dann auf OK, um die Standardwerte für die verbleibenden Parameter zu übernehmen. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste und wählen Sie Exportieren, gefolgt von Flachbild erstellen, um ein zusammengefügtes Bild zu erstellen.
Klicken Sie dann auf Datei und Speichern unter, um das Bild zu speichern. Um die Größe des Fluoreszenzbildes zu ändern, öffnen Sie die Fotovergrößerungssoftware. Klicken Sie auf Datei, öffnen Sie es und wählen Sie das Bild aus.
Geben Sie die Breite und Höhe ein. Zur Anpassung an die Größe des elektronenmikroskopischen Bildes. Wählen Sie den Algorithmus aus, der in der resize-Methode angewendet werden soll.
Klicken Sie dann auf das Dropdown-Menü, um das fluoreszenzmikroskopische Bild als bewegtes Bild und das elektronenmikroskopische Bild als Zielbild auszuwählen. Mit Funktionen wie Zoomen, Drehen und Verschieben des Bildes können Sie die Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischen Bilder vergleichen. Drücken Sie die Leertaste auf der Tastatur, um in den Orientierungsmodus zu wechseln, und drücken Sie die linke Maustaste, um mindestens drei Orientierungspunkte zu markieren, die in beiden Bildern identifiziert wurden.
Nachdem Sie alle identifizierten Orientierungspunkte markiert haben, gehen Sie zu Datei, exportieren Sie das bewegte Bild und klicken Sie auf OK. Ein neues Popup-Fenster mit dem transformierten Fluoreszenzmikroskopbild wird angezeigt. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um das transformierte fluoreszenzmikroskopische Bild zu speichern.
Klicken Sie auf Bild, Farbe und Kanäle zusammenführen. Um die Bilder zu kombinieren. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um das CLEM-Bild zu speichern.
Mitochondrien, die in Lysosomen gefangen waren, wurden in mit Bafilomycin A1 behandelten Zellen beobachtet, was auf eine gehemmte Autophagie und eine Verringerung der mitochondrialen Qualität hinweist, während Kontrollzellen Mitochondrien zeigten, die mit Lysosomen interagierten, aber nicht von ihnen verschlungen wurden, zeigte die in Kontrollzellen beobachtete mitochondriale Störung, dass Mitochondrien Lysosomen umgaben, anstatt von ihnen verschlungen zu werden. U18666A-behandelte Zellen zeigten erhöhte Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen, wobei einige Lysosomen von Mitochondrien verschlungen wurden.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Anwendung korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) zur Visualisierung der Interaktionen zwischen Mitochondrien und Lysosomen unter Verwendung von Dual-Farb-Sonden. Durch das Verständnis, wie Mitochondrien durch Lysosomen reguliert werden, können Erkenntnisse für die Entwicklung therapeutischer Strategien für Krankheiten gewonnen werden, die mit mitochondrialer Dysfunktion assoziiert sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mikroskopietechniken
Hintergrund
- Mitochondriale Dysfunktion steht im Zusammenhang mit vielen Krankheiten, insbesondere neurodegenerativen Störungen.
- Das Verständnis der Regulierung von Mitochondrien durch Lysosomen kann therapeutische Strategien vorantreiben.
- Traditionelle Methoden zur Bildgebung dieser Interaktionen können wichtige Details verschleiern.
- Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie bietet eine Möglichkeit, Bildgebungstechniken zu kombinieren.
Zweck der Studie
- Visualisierung mitochondrialer-lysosomaler Interaktionen mittels hochauflösender Bildgebung.
- Unterscheidung der Interaktionen unter verschiedenen äußeren Belastungen.
- Verbessertes Verständnis der mitochondrialen Qualitätskontrolle innerhalb von Zellen.
Verwendete Methoden
- Zellkultur von HeLa-Zellen wurde in 35-mm-Glas-Rasterbodenschalen durchgeführt.
- Zellen wurden mit Plasmiden co-transfiziert und später mit pharmakologischen Wirkstoffen behandelt.
- Sowohl konfokale als auch Transmissionselektronenmikroskopie wurden zur Bildgebung der Zellen verwendet.
- CLEM wurde mit Dual-Farb-Sonden durchgeführt, um die Visualisierung von Mitochondrien innerhalb von Lysosomen zu erleichtern.
- Spezifische Inkubations- und Waschschritte wurden durchgeführt, um Proben für die Bildgebung vorzubereiten.
Hauptergebnisse
- Die Studie zeigt klare Interaktionen zwischen Mitochondrien und Lysosomen unter verschiedenen Bedingungen.
- Hochauflösende Bildgebung hob zelluläre Strukturen und deren Reaktionen auf äußere Belastungen hervor.
- Mechanistische Einblicke in die mitochondriale Regulation durch Lysosomen wurden gewonnen.
- Validierungsergebnisse wiesen auf zuverlässige Bildgebungsmethoden für die Untersuchung von Organellen-Interaktionen hin.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt die Wirksamkeit der Dual-Farb-CLEM zur Untersuchung von Organellen-Interaktionen.
- Verbesserungen in der Bildgebungstechnik bieten neue Möglichkeiten für die Forschung zur mitochondrialen Qualitätskontrolle.
- Die aus dieser Forschung gezogenen Schlussfolgerungen können Auswirkungen auf das Verständnis und die Behandlung von Krankheiten haben, die mit mitochondrialer Dysfunktion assoziiert sind.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Dual-color correlative light and electron microscopy (CLEM) enables high-resolution visualization of mitochondria-lysosome interactions, addressing a critical gap in understanding organelle dynamics relevant to disease mechanisms. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in early discovery, particularly for programs focused on mitochondrial quality control and cellular stress responses. Integrating CLEM into discovery pipelines enhances predictive confidence for portfolio decisions involving organelle-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of organelle contact sites, supporting functional target validation.
- Clarifies mechanistic pathways of mitochondrial regulation by lysosomes under stress conditions.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing distinct interaction phenotypes in response to pharmacological perturbation.
- Supports predictive confidence for advancing mitochondrial quality control targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated imaging outputs for downstream assay development and compound screening.
- Enables reproducible quantification of organelle interactions using dual-color labeling.
- Supports standardization of imaging-based readouts for screening platforms targeting organelle dynamics.
- Improves reliability of phenotypic screening for compounds modulating mitochondria-lysosome crosstalk.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular stress models for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in fixed cells.
- Provides risk-adjusted data for advancing organelle-targeted interventions in preclinical models.
- Enhances predictive de-risking for mitochondrial dysfunction programs.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-color CLEM method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation, enabling robust hypothesis testing and pathway clarification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of organelle interactions and quality control mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution, dual-modality data for comparative analysis of cellular responses to stressors.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by modeling disease-relevant organelle dynamics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse organelle-targeted research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organelle-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across research teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial and lysosomal targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and dual-color probe labeling.
- Demands access to confocal and electron microscopy infrastructure with image registration capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptation to other cell types or disease models may require probe optimization.
- Potential artifacts from fixation and sectioning must be carefully controlled and interpreted.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:49
Cell Transfection and Confocal Imaging for Observing the Interactions Between Mitochondria and Lysosomes in Fixed Cells
4:05
Sample Preparation for Electron Microscopy Block, Sectioning and Transmission Electron Microscopy (TEM) Imaging
6:34
Image Processing and Generation of the CLEM Image using ImageJ Fiji
8:00
Landmark-Based Image Registration with the Big Warp Plugin
9:43
Representative Results
