Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie zur Visualisierung und Aufzeichnung von sich ausbreitenden Depolarisationen bei Mäusen
4. Oktober 2024
Dieses Protokoll demonstriert die Kombination von Bildgebung und Elektrophysiologie, um sich ausbreitende Depolarisationen bei erwachsenen Mäusen nach einem leichten Schädel-Hirn-Trauma zuverlässig zu erkennen.
Ziel unserer Forschung ist es, den Zusammenhang zwischen sich ausbreitenden Depolarisationen und leichten traumatischen Hirnverletzungen anhand von Hirnmodellen zu verstehen. Unsere Gruppe und andere haben kürzlich gezeigt, dass sich ausbreitende Depolarisationen bei leichten Verletzungen des geschlossenen Schädels bei Mäusen auftreten. Häufig verwendete in vivo-Elektrophysiologie-Verstärker filtern die langsamen extrazellulären Verschiebungen heraus, die mit der Ausbreitung der Depolarisation verbunden sind, so dass es nahezu unmöglich ist, die sich ausbreitende Depolarisation zu erkennen.
Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass sowohl die Bildgebung als auch die In-vivo-Elektrophysiologie genutzt werden können, um das Fehlen oder Vorhandensein von sich ausbreitenden Depolarisationen nach einer leichten traumatischen Hirnverletzung zu bestätigen. Wir haben begonnen zu verstehen, welche Rolle die Ausbreitung von Depolarisationen bei akutem Verhalten, Pathologie und langfristigen kognitiven Defiziten im Zusammenhang mit MTBIs spielt. Zu Beginn legen Sie das betäubte Tier in einen stereotaktischen Rahmen und halten die Körpertemperatur des Tieres mit einem Heizkissen aufrecht.
Machen Sie mit einer Skalpellklinge der Nummer 10 einen Schnitt entlang der Mittellinie von rostral nach kaudal. Und tragen Sie sofort Cyanacrylatkleber auf den Einschnitt auf. Spreizen Sie dann die Haut seitlich, um den Schädel freizulegen.
Geben Sie ein oder zwei zusätzliche Tropfen Cyanacrylatkleber über den Schädel, um zusätzlichen Schutz zu bieten. Während der Kleber trocknet, verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um die Schnittgröße über dem Kleinhirn zu erhöhen. Bohren Sie anschließend mit einem 0,8-Millimeter-Bohrer Pilotlöcher durch den Schädel und drehen Sie die Schrauben in den Schädel.
Wickeln Sie überschüssigen Draht um die Schraube und lassen Sie etwas Spielraum für die spätere Platzierung des Kopftisches. Sobald alle Schädelschrauben an Ort und Stelle sind, stecken Sie alle goldenen Stifte in den gewünschten Kopfstufenstecker. Halten Sie den Steckverbinder mit dem stereotaktischen Arm fest und positionieren Sie die Steckerstifte dicht über den Schraubenköpfen, ohne dass der Draht berührt wird.
Versiegeln Sie den gesamten Bereich mit Cyanacrylatkleber und stellen Sie sicher, dass der Bildgebungsbereich vor den Schädelschrauben ungestört bleibt. Bauen Sie Zahnzement um die Basis der Goldstifte auf und stellen Sie sicher, dass die Goldstifte von den Schädelschrauben nicht mit denen im Kopfstadium verbunden sind. Lassen Sie den Zahnzement aushärten, bevor Sie den Kopfstufenverbinder entfernen.
Schalten Sie zunächst den IOS-Computer und die LED-Panel-Platine ein. Montieren Sie das elektrodenimplantierte anästhesierte Tier in einem Aufprallbett unter der Kamera. Und stellen Sie den Fokusring so ein, dass er die kortikale Oberfläche abdeckt.
Drücken Sie nach dem Laden des intrinsischen optischen Signals oder der IOS-Einstellungen die Live-Taste, um die Maus anzuzeigen und den Schädel des Tieres unter der Kamera zu zentrieren. Drücken Sie dann Multi-D-Erfassung, um auf die Erfassungseinstellungen zuzugreifen und die gewünschten Zeitpunkte auszuwählen. Speichern Sie Bilder im angegebenen Dateipfad mit dem entsprechenden Namenspräfix.
Verbinden Sie die goldenen Stifte vom Tier mit dem Kopftischstecker und dann mit dem Kopftisch. Schalten Sie den Elektrophysiologie-Computer ein und verbinden Sie den Computer mit dem Elektrophysiologie-Gerät. Nachdem Sie die Einstellungen für die Intan-Software geladen haben, klicken Sie auf das Symbol Dateiformat auswählen und wählen Sie im Popup-Fenster One File Per Signal Type Format aus.
Wählen Sie dann im Reiter BW unter Hardwarebandbreite die Verstärkerbandbreite von 0,13 bis 500 Hertz aus. Wählen Sie unter Filteranzeigeauswahl die Option Breit aus. Nachdem Sie die Tief- und Hochpassfilter eingestellt haben, klicken Sie auf das Symbol Dateiname auswählen, um den gewünschten Dateipfad zum Speichern auszuwählen.
Schalten Sie für den Aufprall den elektromagnetischen Impaktor ein und betätigen Sie den Hebel, um zu prüfen, ob die Spitze richtig ein- und ausfährt. Legen Sie das Tier schnell auf ein Schaumstoffbett und schieben Sie das Bett unter die Spitze des Schlagkörpers. Richten Sie die Schlagkörperspitze an der Mittellinie aus und positionieren Sie sie einen Millimeter rostral des Bregmas.
Senken Sie dann die Schlagdüse ab, bis sie die Oberseite des Kopfes des Tieres fest berührt. Drücken Sie den Hebel, um die Schlagdüse zurückzuziehen, und senken Sie sie dann manuell um fünf Millimeter ab, bevor Sie den Schlaghebel aktivieren. Nehmen Sie das Tier sofort aus dem Schaumstoffbett und legen Sie es innerhalb von fünf Sekunden zur Bildgebung unter die Kamera.
Klicken Sie auf Erfassen, um das IOS-Imaging im Fenster Mehrdimensionale Erfassung zu starten. Nehmen Sie Bilder vier Minuten lang auf, um das gesamte sich ausbreitende Depolarisationsereignis aufzuzeichnen. Um die elektrophysiologische Aufzeichnung zu starten, klicken Sie auf das Aufnahmesymbol in der Intan-Software.
Ziehen Sie nach Abschluss der Aufnahme den Netzstecker des Tieres von der Kopfstufe und dem Anschluss und setzen Sie es wieder in seinen Käfig ein. Um den Bildstapel zu öffnen, klicken Sie auf Datei, gefolgt von Importieren und Bildreihenfolge. Zeichnen Sie mit dem Cursor ein Quadrat und definieren Sie den interessierenden Bereich, um das Diagramm der sich ausbreitenden Depolarisation zu erstellen.
Navigieren Sie zu Bild, gefolgt von Stapel und Z-Achsen-Profil plotten, um das Diagramm zu zeichnen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Live. Klicken Sie im generierten Diagramm auf Liste, um eine Liste mit Werten zu generieren. Konvertieren Sie das Graustufenbild zur Visualisierung mit einer Fire-Lookup-Tabelle.
Es wurden sich ausbreitende Depolarisationen beobachtet, die sich über den Kortex und große Blutgefäße durch das Fenster ausbreiteten. Die hochfrequente Aktivität in den elektrophysiologischen Aufzeichnungen zeigte eine schnelle Rückkehr bei Scheintieren nach der Isofluranentfernung. Bei depolarisierten Tieren blieb die hochfrequente Aktivität jedoch mehrere Minuten lang unterdrückt, bevor sie sich erholte.
Die Leistungsdiagramme zeigten unter beiden Bedingungen einen deutlichen Anstieg der Leistung nach der Wiederherstellung von der Unterdrückung.
Übersicht
Diese Studie untersucht den Zusammenhang zwischen sich ausbreitenden Depolarisationen und leichten traumatischen Hirnverletzungen unter Verwendung erwachsener Mäuse als Modell. Durch die Kombination von Bildgebungsverfahren mit in-vivo-Elektrophysiologie zielt das Protokoll darauf ab, sich ausbreitende Depolarisationen zuverlässig nachzuweisen und deren Bedeutung für akutes Verhalten sowie langfristige kognitive Defizite im Zusammenhang mit leichten traumatischen Hirnverletzungen aufzuklären.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Ausbreitende Depolarisationen können bei leichten Schädelhirntraumen mit geschlossenem Schädel bei Mäusen auftreten.
- Häufig verwendete in-vivo-Elektrophysiologie-Methoden können versagen, langsame extrazelluläre Verschiebungen, die mit diesen Depolarisationen verbunden sind, zu detektieren.
- Diese Studie zielt darauf ab, Bildgebung und Elektrophysiologie zu kombinieren, um die Detektion ausbreitender Depolarisationen zu verbessern.
- Die Forschung trägt zum Verständnis akuten Verhaltens, der Pathologie und kognitiver Ergebnisse nach leichtem traumatischem Hirnverletzungen bei.
Zweck der Studie
- Eine Methode zu demonstrieren, die Ausbreitungsdepressionen in einem Mausmodell einer leichten traumatischen Hirnverletzung zuverlässig erfasst.
- Die möglichen Auswirkungen von Ausbreitungsdepressionen auf Verhalten und kognitive Defizite zu untersuchen.
- Die derzeit durch gängige elektrophysiologische Praktiken eingeschränkten Detektionsmethoden zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Die Studie verwendet ein Protokoll, das Bildgebung mit Elektrophysiologie bei adulten Mäusen kombiniert.
- Die Mäuse erfahren eine leichte traumatische Hirnverletzung, im Anschluss an die beide, Bildgebung und elektrophysiologische Ableitungen, durchgeführt werden, um sich ausbreitende Depolarisationen zu identifizieren.
- Zu den wichtigsten Schritten gehören die Anästhesie der Tiere, die chirurgische Vorbereitung sowie die sorgfältige Integration der Bildgebungs- und Elektrophysiologiegeräte.
- Die elektrophysiologischen Daten werden nach der Verletzung aufgezeichnet und mit den Ergebnissen der Bildgebung korreliert, um Depolarisationsereignisse zu analysieren.
Hauptergebnisse
- Ausbreitende Depolarisationen wurden beobachtet, die als Reaktion auf eine leichte traumatische Hirnverletzung über die Großhirnrinde wanderten.
- Elektrophysiologische Ableitungen zeigten eine verminderte Aktivität im Hochfrequenzbereich bei depolarisierten Tieren, wobei signifikante Verzögerungen der Erholung deutlich wurden.
- Leistungsspektren zeigten deutliche Unterschiede in den Erholungsmustern zwischen Schein-behandelten und verletzten Tieren.
- Der kombinierte Ansatz ermöglichte eine effektivere Detektion und Analyse ausbreitender Depolarisationen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert erfolgreich ein neuartiges Protokoll zum Nachweis ausbreitender Depolarisationen nach Verletzung.
- Die Ergebnisse vertiefen das Verständnis der neuronalen Mechanismen, die mit kognitiven Beeinträchtigungen und Verhaltensänderungen nach leichten traumatischen Hirnverletzungen assoziiert sind.
- Die kombinierte Nutzung von Bildgebung und Elektrophysiologie liefert entscheidende Erkenntnisse über die Bedeutung ausbreitender Depolarisationen im Kontext von Hirnverletzungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Ein zuverlässiger Nachweis von sich ausbreitenden Depolarisationen (SDs) ist entscheidend für das Verständnis akuter und langfristiger neurologischer Folgen nach einer Hirnverletzung. Die Integration bildgebender Verfahren mit in-vivo-Elektrophysiologie erhöht die Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von SDs und unterstützt die Aufklärung von Wirkmechanismen sowie die Validierung von Zielstrukturen in der Neurotraumaforschung. Dieser Ansatz mit zwei Messmodalitäten stärkt die frühe Entdeckung und die translationale Kontinuität zur Weiterentwicklung von CNS-Wirkstoffportfolios.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine robuste Untersuchung von SDs als mechanistische Faktoren in der posttraumatischen Pathologie.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem das Vorhandensein oder Fehlen von SDs in krankheitsrelevanten Modellen bestätigt wird.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit für die Testung nachgeschalteter therapeutischer Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung validierter In-vivo-Modelle für die Wirkstoffscreening-Untersuchung der SD-Modulation.
- Bietet quantitative bildgebende und elektrophysiologische Ausgabewerte zur Standardisierung von Assays.
- Ermöglicht die reproduzierbare Detektion von SDs und unterstützt damit die zuverlässige Bewertung von kandidatenbasierten Interventionen.
Translationale und präklinische Forschung
- Bringt präklinische Modelle in Einklang mit menschlichen Verletzungsmechanismen, indem die Ausbreitung von SD visualisiert wird.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem SDs mit funktionellen Ergebnissen verknüpft werden.
- Reduziert Risiken bei der translationellen Weiterentwicklung, indem mechanistische Endpunkte in vivo bestätigt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses kombinierte Protokoll aus Bildgebung und Elektrophysiologie verortet die Detektion von SD an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung, Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und präklinischer Forschung in Modellen zentralnervöser Verletzungen.
- Entdeckungsbiochemie: Bestätigt mechanistische Hypothesen bezüglich der Beteiligung von Spreading Depression (SD) an akuten und chronischen Hirnschäden.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Messgrößen zur Bewertung von SD-modulierenden Substanzen.
- Analytik: Liefert synchronisierte bildgebende und elektrophysiologische Daten für einen robusten statistischen Vergleich experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungen mit präklinischen Endpunkten, die für die Entwicklung von ZNS-Wirkstoffen relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein breit anwendbares Protokoll, das an verschiedene Modelle von Neurotrauma und neurovaskulären Erkrankungen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Forschung zu ZNS-Verletzungen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Detektion von Spreading Depression (SD) durch skalierbare, reproduzierbare Arbeitsabläufe, die für multizentrische Studien geeignet sind.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Beteiligung von SD an der Zielpathologie geklärt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von ZNS-Wirkstoffen basierend auf validierten, mechanistischen Endpunkten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse sowohl in der In-vivo-Bildgebung als auch in elektrophysiologischen Techniken.
- Benötigt Zugang zu synchronisierter Bildgebung und elektrophysiologischer Aufzeichnungsinfrastruktur.
- Erfordert die Standardisierung von Datenerfassungs- und Analyseprotokollen über Teamgrenzen hinweg.
- Kann auf verschiedene Nagetiermodelle übertragen werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung der Protokolle für unterschiedliche Verletzungsarten.
- Hängt von der Verfügbarkeit kompatibler Verstärker und Bildgebungssysteme für eine zuverlässige Erfassung von Streifendurchgängen (SD) ab.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Preparing the Skull for Imaging and Electrophysiology to Monitor Spreading Depolarizations in Injured Mouse Brain
2:52
Detecting the Spreading Depolarizations in Mouse Brain Injury Model with Intrinsic Optical Signal Imaging and AC-Electrophysiology
