Name: Langzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs in hochdifferenzierten und polarisierten retinalen Pigmentepithelkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Langzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs in retinalen Pigmentepithelkulturen mit dem Resipher-Gerät. Diese Methode ermöglicht detaillierte bioenergetische Profilierung über Wochen unter optimalen Kulturbedingungen.

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Wir danken Dr. Daniel Hass und Jim Hurley für die Idee, die Löslichkeit von O2 in neuen versus konditionierten Medien als Kontrolle zu testen. Wir danken Dr. Magali Saint-Geniez für die redaktionelle Mitarbeit an dem Manuskript. Wir danken Scott Szalay von Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, für die Nachrüstung der Hypoxiekammer mit dem Resipher USB-Kabel. Für die HFT-Forschung wurden keine Bundesmittel verwendet. Der Electronic Services Core wird durch P30 EY007003 des National Eye Institute unterstützt. Diese Arbeit wird durch ein uneingeschränktes Department-Grant von Research to Prevent Blindness (RPB) unterstützt. J.M.L.M. wird unterstützt von der James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration, der E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, einem Eversight Eye-Bank Grant, einem K08EY033420 Grant des National Eye Institute und Unterstützung von Dee und Dickson Brown sowie der David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation. D.Y.S. wird vom UNSW Scientia Programm unterstützt. L.A.K. wird unterstützt durch den Iraty Award, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, ein R01EY027739 Stipendium des National Eye Institute und das Department of Defense Army Medical Research Acquisition Activity VR220059.

Neuartiges OCR-Monitoring-System für differenzierte RPE-Kulturen

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
<li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li>
<li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).</li>
</ol>

Richard A. Bryan und Kin Lo sind Mitarbeiter von Lucid Scientific, dem Hersteller des Resipher-Systems.

Der mitochondriale Metabolismus des RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese häufiger erblindender Netzhauterkrankungen, einschließlich AMD und PVR. Die Modellierung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels in vitro ermöglicht es, seinen Stoffwechselzustand von dem des umgebenden Gewebes zu isolieren und das Gewebe auf kontrollierte Weise verschiedenen krankheitssimulierenden Beleidigungen auszusetzen. Eine solche in vitro-Modellierung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels wurde durch das Aufkommen von humanen Primär- und iPSC-RPE-Kulturen mit hoher Genauigkeit erleichtert, die den richtigen Differenzierungszustand und die richtige Polarität erreichen, die für eine enge Annäherung an RPE in vivo erforderlich sind. Während die Überwachung des Sauerstoffverbrauchs (OCR) in solchen Kulturen eine ideale Methode zur Überwachung des mitochondrialen Stoffwechsels ist, schließt das Setup für die OCR-Überwachung oft aus, Kulturen unter den Bedingungen zu züchten, die für eine stark polarisierte und vollständig differenzierte RPE erforderlich sind. Hier beschreiben wir Resipher als ein neuartiges System zur Überwachung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels durch Echtzeit-Langzeitbewertung der OCR in hochdifferenzierten und polarisierten RPE-Kulturen.
Andere Methoden wurden verwendet, um OCR in RPE zu überwachen. Der Seahorse XF Analyzer wurde entwickelt, um OCR über kurze Zeiträume mit akuten Manipulationen der Mitochondrienfunktion zu überwachen. Seahorse-Assays erfordern jedoch, dass Zellen auf speziellen Platten gezüchtet werden, die nicht förderlich für die Unterstützung einer hohen RPE-Polarität und -Differenzierung sind21. Calton, Vollrath und Kollegen adaptierten das Seahorse für die Beurteilung von hochdifferenzierten RPE-Kulturen, die auf mikroporösen Trägern gezüchtet wurden, indem sie die mikroporöse Membran in Stücke schnitten und in die Seahorse-Platte legten, aber diese Methode funktioniert immer noch nur für die kurzfristige Endpunktüberwachung von Kulturen, da die Zellen keinen Zugang zu CO2 haben Während des Assays kann der Assay nur unter unsterilen Bedingungen durchgeführt werden, und das Schneiden des mikroporösen Trägers führt im Laufe der Zeit zum Tod und zur Funktionsstörung des Randteils des mikroporösen Trägers22. Die Barofuse ist ein pumpenloses Perfusionssystem, bei dem RPE-Streifen, die auf mikroporösen Trägern gewachsen sind, in das Perfusionssystem geladen werden können, wodurch die OCR in Echtzeit überwacht werden kann23. Ähnlich wie bei dem modifizierten Aufbau für das Seahorse von Calton, Vollrath und Kollegen sind die Haupteinschränkungen der RPE-Bewertung mit Barofuse die Notwendigkeit, die mikroporösen Stützen zu schneiden, und der kurzfristige Endpunktcharakter des Assays. Der Oxygraph ist auch für schnelle kinetische Veränderungen der OCR als Reaktion auf metabolische Manipulationen ausgelegt24. Es wurde bisher nicht für RPE-Kulturen verwendet und würde bei der Bewertung stark polarisierter und differenzierter RPE-Kulturen die gleichen Einschränkungen aufweisen wie das Seepferdchen und das Barofuse-Kulturen.
Im Gegensatz zu diesen anderen Verfahren ermöglicht das hier beschriebene OCR-System die Überwachung der OCR, während RPE in Standard-Zellkulturplatten/-substraten unter Standardbedingungen mit Standard-RPE-Medien in einem Standard-Zellkultur-CO 2-Inkubator kultiviert wird, was eine einfache und bequeme Sondierung von hochdifferenzierten und polarisierten RPE-Kulturen ermöglicht. Zusätzlich zur Generierung von Daten über Echtzeit-OCR-Änderungen durch das System können dieselben Zellen für zusätzliche Assays am Ende des OCR-Überwachungszeitraums verwendet werden. Dies ermöglicht hochflexible Experimente, bei denen die Wirkung einer Intervention auf die OCR über einen Zeitraum von Wochen wiederholt getestet wird (z. B. - RPE-EMT-Induktion in Abbildung 5) oder bei denen die langfristige Erholung von einer Intervention getestet werden kann (z. B. - Erholung von der mitochondrialen Entkopplung in Abbildung 3) oder bei denen kaskadierende metabolische Veränderungen als Reaktion auf eine erste Intervention überwacht werden können (z. B. - Auswirkungen des Serums auf die OCR, sobald die Mediennährstoffe erschöpft sind in Abbildung 2). Das OCR-System in diesem Artikel eignet sich besonders gut für die Messung von OCR in stark polarisierten und differenzierten RPE-Kulturen. Solche Kulturen sind funktionell postmitotisch, mit dichter Packung und starker Pigmentierung. Das bedeutet, dass jede Vertiefung nahezu identische Zellnummern9 enthält, wodurch eine Normalisierung der OCR auf die Zellzahl für die meisten Experimente entfällt. Selbst wenn eine Normalisierung auf die Zellzahl erforderlich ist, ermöglichen die starke RPE-Pigmentierung und die gut abgegrenzten Zellgrenzen die Normalisierung mit einer nicht-invasiven einfachen Zellzählung auf der Grundlage von Hellfeld-Bildgebung. Bei Experimenten mit undifferenziertem RPE und RPE-Proliferation, wie z. B. den EMT-Experimenten in Abbildung 5, ist eine Normalisierung der Per-Well-OCR auf die Zellzahl erforderlich, um zu wissen, was die OCR "pro Zelle" ist.
Außerhalb des retinalen Bereichs wurde das System eingesetzt, um die Zellatmung und die Stoffwechselaktivität in verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, darunter Pankreas-Inselzellen25, Skelettmuskulatur26, Eierstockkrebs27, Kardiomyozyten28 und sogar ganze Organismen wie C. elegans29. Die Echtzeit-Langzeitüberwachung der OCR mit dem hier beschriebenen OCR-System lieferte wichtige Erkenntnisse über bioenergetische Verschiebungen und mitochondriale Dysfunktion in diesen verschiedenen Krankheitsmodellen.
Das Resipher-System hat Einschränkungen. Die Methode zur Bestimmung der OCR unterscheidet sich grundlegend von der des Seahorse Analyzers, BaroFuse oder Oxygraph. Es erfordert die Einrichtung eines O2 -Gradienten, um die OCR zu berechnen, und es kann Stunden dauern, bis der Gradient festgelegt ist. Schnelle kinetische Experimente, wie sie in den anderen Systemen möglich sind, sind mit diesem System daher nicht möglich. Darüber hinaus verfügt Resipher im Gegensatz zu den anderen Systemen über keine Injektionsöffnungen für die schnelle Abgabe kleiner Moleküle oder die Sammlung von Metaboliten. Stattdessen muss der Sensordeckel in einer Zellkulturhaube entfernt werden, wobei die Medikamente eingespießt oder das Medium ausgetauscht werden muss, zusammen mit der manuellen Entnahme der zu analysierenden Metaboliten.
Zum Einrichten und Beheben von Problemen mit dem in diesem Dokument beschriebenen OCR-System wird Folgendes empfohlen. Erstens: Minimieren Sie die Verdunstung. Denken Sie daran, dass derO2-Gradient in der Medienspalte über der RPE-Monoschicht stark von der Höhe der Spalte9 abhängt und das System die OCR basierend auf demO2-Gradienten berechnet. Wenn es also während des Experiments zu einer deutlichen Absenkung der Mediensäule aufgrund von Verdunstung kommt, ändert sich derO2-Gradient, was sich auf die OCR-Messwerte auswirkt. Es ist wichtig, die Wasserschale für den Inkubator voll zu halten, aber es wird auch empfohlen, Wasser in alle ungenutzten Vertiefungen der 96-Well-Platte zu geben. Darüber hinaus weisen die Vertiefungen am Rand der Platte höhere Verdampfungsraten auf, so dass diese Vertiefungen in typischen Experimenten, die oben vorgestellt wurden, leer von Zellen bleiben. Der Feuchtigkeitssensor des OCR-Systems kann bei der Überwachung der Luftfeuchtigkeit des Inkubators helfen. In Abbildung 8A deutet der Abfall der Luftfeuchtigkeit während des Experiments darauf hin, dass die Wasserschale des Inkubators leer ist. Wenn sich die Verdunstung im Bohrloch beschleunigt, steigen die O2-Konzentrationsmesswerte für das Bohrloch an und "flachen" schließlich bei der atmosphärischenO2-Konzentration (~200 μM) ab (Abbildung 8A).
Vergewissern Sie sich zweitens, dass das "Sandwich" des OCR-Systems ordnungsgemäß zusammengebaut ist. Die Metallkontaktpunkte an der Unterseite des Geräts und an der Oberseite des Sensordeckels sollten sauber sein, ohne Schmutz, der den vollen Kontakt behindert. Das Gerät und der Sensordeckel sollten vollständig bündig und gleichmäßig ausgerichtet auf der 96-Well-Platte angebracht werden, ohne dass es zu Neigungen kommt. Das USB-Kabel, das das Gerät mit dem Hub verbindet, sollte nicht unter Spannung stehen, was zu einem Drehmoment des "Sandwiches" und einer Einschränkung der ordnungsgemäßen Bewegung des Geräts führen kann.
Drittens: Stellen Sie sicher, dass die Sensoren des Geräts und des Sensordeckels kalibriert sind. Abbildung 2B zeigt, wie zu Beginn jedes Experiments schnell die korrekte Sensorfunktion überprüft werden kann. Viertens: Stellen Sie sicher, dass ein bestimmtes Bohrloch vor der experimentellen Manipulation keinen Ausreißer-OCR aufweist. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Sensoren funktionieren, kann die Bestimmung der OCR-Ausgangswerte für alle Wells mit Zellen dabei helfen, festzustellen, ob bestimmte Wells ungesunde Zellen enthalten. Abbildung 8B zeigt mehrere Bohrlöcher, die einer OCR-Basisbewertung unterzogen werden, wobei die blau gefärbte Bohrung eindeutig eine niedrigere OCR (und damit eine hoheO2-Konzentration ) aufweist. Diese Vertiefung ist ein Ausreißer und sollte von experimenteller Manipulation ausgeschlossen werden.
Fünftens: Minimieren Sie Umgebungsmanipulationen während aktiver OCR-Messungen. DerO2-Gradient reagiert sehr empfindlich auf Änderungen der Temperatur, der Luftfeuchtigkeit, des CO2 - Gehalts des Inkubators und des Atmosphärendrucks. Das Öffnen der Inkubatortür beeinflusst diese Faktoren erheblich und führt zu vorübergehenden Unterbrechungen der OCR-Messwerte, bis derO2-Gradient der Mediensäule wieder ins Gleichgewicht zurückkehrt (Abbildung 8C). Parameter, die sich auf die OCR auswirken, können in der Online-Oberfläche des Systems unter der Registerkarte "Umgebung" überwacht werden (Abbildung 8A).
Sechstens: Bestimmen Sie das optimale Medienvolumen für das Experiment. Während ein unzureichendes Medienvolumen Artefakte durch übermäßige Verdunstung (siehe erste Fehlerbehebungsmaßnahme oben) oder vorzeitige Erschöpfung der Nährstoffe im Medium erzeugen kann, begrenzt ein übermäßiges Medienvolumen die Verfügbarkeit von O2 in der RPE-Monoschicht und löst Hypoxieaus 9. Abbildung 7 ist ein Screenshot des Online-Rechners, der zur Bestimmung des Einflusses des Medienvolumens auf dieO2-Konzentration an der RPE-Monoschicht zur Verfügung steht. Die maximal mögliche OCR für ein bestimmtes Medienvolumen ist in Abbildung 9A dargestellt. Wenn die OCR-Rate für ein gegebenes Experiment mit einem gegebenen Volumen annähernd der in Abbildung 9A gezeigten Rate entspricht, dann nähert sich dieO2-Konzentration in der RPE-Monoschicht der Anoxie (0%) und ein geringeres Medienvolumen ist erforderlich. Im Allgemeinen sollten Experimente mit mitochondrienintensiven Prozessen in RPE-Kulturen Medienvolumina von nicht mehr als 75 μl pro 96-Well-Kultur aufweisen.
Siebtens: Führen Sie eine geeignete Normalisierung durch, um die Auswirkungen eines experimentellen Eingriffs auf die OCR zu isolieren. Da verschiedene Wells unterschiedliche OCR-Ausgangswerte aufweisen können, ist es wichtig, vor einem experimentellen Eingriff für jedes Well OCR-Basiswerte zu erhalten. Subtrahieren Sie die OCR zu Studienbeginn von der OCR nach der experimentellen Intervention, um die "Delta-OCR" zu erhalten, die die Wirkung der experimentellen Intervention auf die OCR zeigt. Die Methode zum Abrufen von "Delta OCR" ist in Abbildung 3 und Abbildung 9B dargestellt. Wenn man sich für die Auswirkungen einer experimentellen Intervention auf die Fähigkeit einer anderen experimentellen Intervention zur Induktion von OCR interessiert, ist ein zusätzlicher Normalisierungsschritt, die "Delta-Delta-OCR", erforderlich. Ein solches Beispiel ist in Abbildung 9B dargestellt, wo die Fähigkeit von Palmitat (eine experimentelle Intervention), eine erhöhte OCR (durch Induktion der β-Oxidation) zu induzieren, von der Art des Mediums für die RPE-Kultur (eine zweite experimentelle Intervention) abhängt.
Minimieren Sie schließlich das Risiko einer Kontamination. Das System überwacht die OCR, indem es einen Sauerstoffsensor in das Medium über den Zellen einführt. Dadurch steigt die Ansteckungsgefahr. Unerwartete Einbrüche der OCR während des Experiments oder unerwartet niedrige OCR zu Beginn des Experiments könnten Anzeichen für eine Infektion sein. Die Platten müssen unter einem Zellkulturmikroskop aktiv auf Infektionen überwacht werden. Eine Kreuzkontamination zwischen 96-Well-Platten kann auftreten, wenn ein Sensordeckel wiederverwendet wird. Um eine solche Kreuzkontamination zu minimieren, sollte man den gesamten Deckel nach Abschluss eines Experiments 20 Minuten lang in 70%iges Ethanol zur Dekontamination tauchen, bevor der Messdeckel in einem neuen Experiment wiederverwendet wird (siehe Protokollabschnitt 1.2.15).
Abschließend wird ein Protokoll für die Echtzeit-Langzeitüberwachung des mitochondrialen Metabolismus in High-Fidelity-RPE-Kulturen durch Bewertung der OCR unter Verwendung eines neuartigen Systems namens Resipher vorgestellt. Es kann für zahlreiche Anwendungen an hochpolarisierten und differenzierten RPE-Kulturen eingesetzt werden, insbesondere zur Untersuchung physiologischer metabolischer Eigenschaften von isoliertem RPE sowie eines veränderten RPE-Metabolismus in in vitro-Modellen von Netzhauterkrankungen, einschließlich AMD und PVR.

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus funktionell postmitotischen, hochpolarisierten Epithelzellen, die eine Barriere zwischen lichtempfindlichen Photorezeptoren in der Netzhaut und deren Durchblutung bilden, ein Kapillarbett, das als Choriokapillaris bezeichnet wird. Wie die Rolle der Glia-unterstützenden Neuronen erfüllt das RPE unzählige Funktionen zur Unterstützung von Photorezeptoren, einschließlich der Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren, des Transports von Nährstoffen und der metabolischen Unterstützung der Photorezeptoren sowie der Sekretion essentieller Wachstumsfaktoren, die alle für die Aufrechterhaltung der Sehfunktion entscheidend sind.
Die Degeneration des RPE liegt mehreren häufigen degenerativen Erkrankungen des Sehvermögens zugrunde. Bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer der häufigsten Ursachen für unheilbaren Sehverlust weltweit, stirbt das RPE ab, und die darüber liegenden Photorezeptoren erleiden daher eine sekundäre Degeneration. Bei der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR) verlässt das RPE stattdessen seinen normalerweise ruhenden postmitotischen Zustand, proliferiert sich und dedifferenziert sich in einen mesenchymalen Zustand (einen sogenannten epithelial-mesenchymalen Übergang [EMT]) mit Veränderungen in seinem Stoffwechsel. Die RPE-Dedifferenzierung führt zu einem Verlust der RPE-Unterstützung für Photorezeptoren und löst gleichzeitig einen fibrotischeren Zustand aus. Dies führt sowohl zu einer Degeneration der Photorezeptoren als auch zu einer RPE-induzierten Narbenbildung, die beide einen Sehverlust auslösen 1,2.
Ein großer Teil der Unterstützung der Photorezeptoren durch RPE ist metabolisch, und metabolische Dysregulation ist ein kritischer Faktor bei zahlreichen Netzhauterkrankungen, einschließlich AMD und PVR. Das RPE dient als regulatorische Barriere zwischen den Photorezeptoren und ihrer Sauerstoff- und Nährstoffquelle, der Choriokapillaris. Daher bestimmt das, was das RPE metabolisiert, im Vergleich zu dem, was das RPE von der Choriokapillaris zu den Photorezeptoren durchdringt, stark den Photorezeptorstoffwechsel und das Überleben. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das RPE für seine normale Gesundheit stark vom mitochondrialen Stoffwechsel abhängig ist und dass die Photorezeptoren stattdessen stark auf die Glykolyse angewiesensind 3. Dadurch wurde das Konzept komplementärer, miteinander verflochtener Stoffwechselzustände zwischen Photorezeptoren und dem RPE eingeführt. Insbesondere reduziert das RPE seinen Metabolismus von bevorzugten Photorezeptor-Stoffwechselsubstraten und nutzt stattdessen die Nebenprodukte des Photorezeptorstoffwechsels in Kombination mit den Metaboliten, die Photorezeptoren nicht verbrauchen. Bei Krankheiten wie PVR und AMD deuten Hinweise stark darauf hin, dass das RPE glykolytischer und weniger abhängig vom mitochondrialen Stoffwechsel wird; Diese Verschiebung hin zur RPE-Glykolyse kann dazu führen, dass die Photorezeptoren die benötigten Metaboliten verlieren, was zu einer Degeneration führt 4,5,6. Angesichts der gegenseitigen Abhängigkeit von RPE und Photorezeptorstoffwechsel und der Tatsache, wie stark ein veränderter Stoffwechsel der Netzhauterkrankung zugrunde liegt, besteht ein starkes Interesse an der Modellierung und Manipulation des RPE-Stoffwechsels für therapeutische Zwecke.
Während die Untersuchung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels in vivo ideal ist, können viele Aspekte des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels nur in einem in vitro-Kultursystem praktisch untersucht werden. In den letzten Jahrzehnten wurden erhebliche Fortschritte auf dem Weg zu High-Fidelity-RPE-Kulturen erzielt, so dass die am sorgfältigsten gepflegten RPE-Kulturen heute in klinischen Studien am Menschen für die Zellersatztherapie verwendet werden7. Um solche High-Fidelity-Kulturen zu erhalten, muss das RPE vor dem Experimentieren monatelang auf bestimmten Substraten in bestimmten Medien gezüchtet werden. Unter diesen Bedingungen sind RPE-Kulturen maximal differenziert und polarisiert, was sich dem in vivo RPE annähert. Leider gibt es derzeit keine Geräte, die den mitochondrialen Stoffwechsel spezifisch aus dem RPE in vivo messen können. Während die Sauerstoffüberwachung des retinalen Kapillarnetzwerks in vivo mit Hilfe der Elektronen-Paramagnetischen Resonanz (EPR)-Oximetrie8 durchgeführt wurde, ist dies bei der RPE-Analyse nicht möglich. Unterschiede zwischen dem RPE-Metabolismus in vivo und in vitro sind nicht gut beschrieben, aber es wurde gezeigt, dass RPE-Kulturen eine hohe mitochondriale Aktivität aufweisen, ähnlich wie RPE in vivo 3,9, was darauf hindeutet, dass mit Hilfe von High-Fidelity-RPE-Kulturen signifikante Einblicke in den mitochondrialen RPE-Stoffwechsel gewonnen werden können.
Da jeder mitochondriale Stoffwechsel zu einem Sauerstoffverbrauch führt, ist die Messung der RPE-Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) ein zuverlässiger Indikator für den mitochondrialen Stoffwechsel. Die Messung von OCR in RPE-Kulturen erwies sich als schwierig, da die Bedingungen, die eine maximale RPE-Polarisation und -Differenzierung begünstigen, mit derzeit verfügbaren Techniken wie dem Seahorse Analyzer oft langfristige genaue OCR-Messungen ausschließen. In diesem Methodenpapier wird ein neuartiges Gerät, der Resipher (im Folgenden als "das System" bezeichnet), vorgestellt, das eine kontinuierliche Messung der OCR über Wochen in RPE ermöglicht, die unter Bedingungen angebaut werden, die die Polarisation und Differenzierung maximal fördern. Die Leichtigkeit, mit der OCR von diesem System unter RPE-Kulturbedingungen gemessen werden kann, die die RPE-Differenzierung und Polarisation maximal fördern, ist einzigartig unter den bestehenden OCR-Messgeräten.
Dieses Dokument enthält Tipps und Tricks für die Verwendung des Systems mit RPE-Kulturen, gefolgt von einer Demonstration von zwei speziellen Anwendungen. Erstens wird die RPE-EMT, die den PVR nachahmt, durch das Engagement gegenüber dem transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGFβ)1,10,11,12 ausgelöst. Das System wird verwendet, um zu überwachen, wie sich der RPE-Stoffwechsel während des EMT-Prozesses entwickelt. Zweitens wird die Rolle von Hypoxie im RPE-Stoffwechsel anhand dieses Systems untersucht. Hypoxie ist ein wichtiger Faktor für die Pathogenese der AMD, da die Choriokapillaris mit dem Altervon 13,14 Jahren dünner wird. Die Kombination dieses Systems mit Hypoxiekammern ermöglicht es, den veränderten mitochondrialen RPE-Stoffwechsel mit der subtilen Hypoxie, die mit dem Altern einhergeht, zu modellieren. Schließlich wird ein Online-Rechner mit Resipher-Daten eingeführt, mit dem man bestimmen kann, ob sich RPE-Kulturen in hypoxischen, normoxischen oder hyperoxischen Bedingungen befinden. Solche Informationen sind entscheidend, um Rückschlüsse auf den RPE-Metabolismus aus In-vitro-RPE-Kulturstudien zu ziehen.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>#25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-Trijod-L-thyronin-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32-Kanal Resipher Deckel</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A für Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A aus Streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>Inhibitor des Komplexes III der Elektronentransportkette</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>Entkopplungsmittel zur Erhöhung der mitochondrialen Atmung</td></tr><tr><td>DMSO, Zellkulturqualität</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>Vehikel zur Rekonstitution von mitochondrialen Wirkstoffen</td></tr><tr><td>Extrazelluläre Matrix-Beschichtungssubstrate: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>Extrazelluläre Matrix für hfRPE</td></tr><tr><td>Extrazelluläre Matrix-Beschichtungssubstrate: Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>Extrazelluläre Matrix für iPSC-RPE</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td>Entkopplungsmittel zur Erhöhung der mitochondrialen Atmung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (Bio-Techne S11550H)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison-Cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxie-Kammer</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 Media Supplement</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140050 O2-Sensor</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sensit-Technologie oder Forensik-Detektoren</td><td>P100 oder FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TGF&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>Transformation des Wachstumsfaktors beta-2 zur Induktion des epithelial-mesenchymalen Übergangs</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>Inhibitor des Komplexes I der Elektronentransportkette</td></tr><tr><td>Systemkompatible Platte</td><td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM (Alpha-Modifikation von Eagle's Media)</td><td>Corning</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

langzeitüberwachung des sauerstoffverbrauchs in hochdifferenzierten und polarisierten retinalen pigmentepithelkulturen

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

Der mitochondriale Stoffwechsel ist entscheidend für die normale Funktion des retinalen Pigmentepithels (RPE), einer Monoschicht von Zellen in der Netzhaut, die für das Überleben der Photorezeptoren wichtig ist. Die mitochondriale Dysfunktion von RPE ist ein Kennzeichen der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, und der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR), einer erblindenden Komplikation von Netzhautablösungen. RPE-degenerative Erkrankungen wurden durch RPE-Kultursysteme, die hochdifferenziert und polarisiert sind, um in vivo RPE nachzuahmen, gut modelliert. Die Überwachung der Sauerstoffverbrauchsraten (OCR), eines Indikators für die mitochondriale Funktion, erwies sich in solchen Kultursystemen jedoch als schwierig, da die Bedingungen, die eine ideale RPE-Polarisation und -Differenzierung begünstigen, keine einfachen OCR-Messungen ermöglichen. 
Hier stellen wir ein neuartiges System, Resipher, vor, um OCR wochenlang in gut differenzierten RPE-Kulturen zu überwachen, während das RPE auf optimalen Wachstumssubstraten und physiologischen Kulturmedien in einem Standard-Zellkultur-Inkubator gehalten wird. Dieses System berechnet die OCR, indem es den Sauerstoffkonzentrationsgradienten misst, der in den Medien über den Zellen vorhanden ist. Wir diskutieren die Vorteile dieses Systems gegenüber anderen Methoden zur Erkennung von OCR und wie man das System zur Messung von OCR in RPE-Kulturen einrichtet. Wir behandeln wichtige Tipps und Tricks für die Verwendung des Systems, Vorsicht bei der Interpretation der Daten und Richtlinien für die Fehlerbehebung bei unerwarteten Ergebnissen. 
Wir bieten auch einen Online-Rechner zur Extrapolation des Hypoxie-, Normoxie- oder Hyperoxie-RPE-Niveaus an, die auf dem Sauerstoffgradienten in den Medien über den vom System erkannten Zellen basieren. Schließlich untersuchen wir zwei Anwendungen des Systems, die Messung des Stoffwechselzustands von RPE-Zellen in einem PVR-Modell und das Verständnis, wie sich das RPE metabolisch an Hypoxie anpasst. Wir gehen davon aus, dass die Verwendung dieses Systems an hochpolarisierten und differenzierten RPE-Kulturen unser Verständnis des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitszuständen verbessern wird.

Wir stellen ein neuartiges Gerät zur Messung des Sauerstoffverbrauchs (OCR) in retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) vor. Das Gerät kann die OCR wochenlang an RPE messen, das auf Standard-Zellkulturplatten mit Standardmedien gezüchtet wurde, während sich die Platten in einem Standard-Zellkulturinkubator befinden.

Langzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs in hochdifferenzierten und polarisierten retinalen Pigmentepithelkulturen

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung und Immunfluoreszenzfärbung von Netzhaut-Flachhalterungen und Analysen von Mäusen. Auch die Verwendung der Fluoresceinfundusangiographie (FFA) bei Mäusewelpen und die Bildverarbeitung werden ausführlich beschrieben.

Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Der Stoffwechselstatus menschlicher retinaler Pigmentepithelzellen (H-RPE) spiegelt deren Gesundheit und Funktion wider. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung des Echtzeit-Stoffwechselflusses von H-RPE mittels hochauflösender Respirometrie vorgestellt.

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Dieses Protokoll beschreibt ein Lipofuszin-Akkumulationsmodell in hochdifferenzierten und polarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) und einen verbesserten Phagozytose-Assay des äußeren Segments (OS), um die gesamte OS-Verbrauchs-/Abbaukapazität des RPE zu bestimmen. Diese Methoden überwinden die Einschränkungen bisheriger Lipofuszin-Modelle und klassischer Puls-Chase-Phagozytose-Assays im äußeren Segment.

Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen

Die Echtzeitanalyse von lebendem Gewebe liefert wichtige funktionelle und mechanistische Daten. In diesem Artikel werden die Protokolle und kritischen Variablen beschrieben, um eine genaue und reproduzierbare Generierung von Daten durch ein neuartiges und pumpenfreies Mehrkanal-Fluidiksystem zu gewährleisten, das eine breite Palette von Gewebe- und Zellmodellen pflegt und bewertet.

Erhaltung und Beurteilung verschiedener Gewebe- und Zelltypen des Auges mit einem neuartigen pumpenlosen Fluidiksystem

Diese Studie bezieht sich auf die Entwicklung und Standardisierung eines wertvollen methodischen Protokoll, um langfristig (14 Tage) letale Toxizität von chemischen Substanzen, industrielles Abwasser oder Abwasser und flüssigen Umweltproben auf dem Salzwasser Krustentier ausgeübt zu...

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Chirp ist eine neuartige und schnelle Technik, um genomische Bindungsstellen der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) abzubilden. Die Methode nutzt die Spezifität der anti-sense-Oligonukleotide Fliesen um die Auszählung von lncRNA-gebundene genomische Stellen zu ermöglichen.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Die microRNA (miRNA)-Profile der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (iPS-RPE) und fetale RPE abgeleitet, wurden verglichen.

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

Erfahren Sie die Langzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs in retinalen Pigmentepithelkulturen mit dem Resipher-Gerät. Diese Methode ermöglicht detaillierte bioenergetische Profilierung über Wochen unter optimalen Kulturbedingungen.

Langzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs in hochdifferenzierten und polarisierten retinalen Pigmentepithelkulturen

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