Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten durch Messung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten Blutplättchen

Die Bildung von Blutplättchen-Prokoagulanzien ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Blutstillung. Dieser Prozess beinhaltet die Expression von Phospholipiden und die Freisetzung von Mikrovesikeln an der Thrombozytenoberfläche, die für die Gerinnungsschritte unerlässlich ist. Die Bewertung dieses Prozesses hat neue Daten darüber geliefert, wie die Thrombozyten-Prokoagulanzien-Reaktionen bei verschiedenen menschlichen Krankheiten ablaufen.

Die Durchflusszytometrie war ein Eckpfeiler und hat sich bei der Bewertung der Phosphatidylserin-Expression auf Blutplättchen und der Mikrovesikelfreisetzung durchgesetzt. Die Isolierung und Analyse von gereinigten Blutplättchen ist zeitaufwändig und erfordert spezielle Laborgeräte und steht daher derzeit nicht für die klinische Routinediagnostik zur Verfügung. Die Analyse der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung ist aufgrund ihrer geringen Größe und der geringen Anzahl positiver Ereignisse für interessante Marker ebenfalls eine Herausforderung.

Zu Beginn entnehmen Sie peripheres venöses Blut in Entnahmeröhrchen, die das aktive Antikoagulans Trinatriumcitrat mit Zitronensäure und Dextrose enthalten. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um das Blut mit dem Antikoagulans zu vermischen, und lassen Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen. Zählen Sie die Blutplättchen mit einem automatisierten Zellzähler, um die richtige Geschwindigkeit für die Zentrifugation zu bestimmen.

Um das plättchenreiche Plasma herzustellen, zentrifugieren Sie das Blut bei 250 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, ohne die Pause einzulegen. Fügen Sie dann 1 Milliliter ACDA und 6,25 Mikroliter Apyrase zu 9 Millilitern des plättchenreichen Plasmas hinzu. Die Mischung bei 1.100 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Entfernen Sie mit einer Pasture-Pipette den Überstand mit plättchenarmem Plasma und suspendieren Sie das Thrombozytenpellet vorsichtig wieder in 1 Milliliter Waschpuffer. Geben Sie dann 3 bis 4 Milliliter Waschpuffer in das Röhrchen und zentrifugieren Sie es erneut. Nach Entfernen des Überstands das Pellet in 1 Milliliter Waschpuffer wieder suspendieren.

Übertragen Sie 150 Mikroliter der Thrombozytensuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, um die Zellen in einem automatisierten Zellzähler zu zählen. Fügen Sie der verbleibenden Suspension 3 bis 4 Milliliter Waschpuffer hinzu, um eine zusätzliche Wäsche durchzuführen, wie zuvor gezeigt. Als nächstes wird das Plättchenpellet im Reaktionspuffer wieder suspendiert, um eine Endkonzentration von 5 x 10 hoch 11 Blutplättchen pro Liter zu erreichen.

Zu Beginn erhalten Sie gewaschene Blutplättchen im gewünschten Puffer für die Durchflusszytometrie. Bereiten Sie alle Agonisten und Fluorochrome im Reaktionspuffer vor. Für interne Assays geben Sie 100 Mikroliter gewaschene Blutplättchen in einer Konzentration von 50 x 10 hoch 9 Blutplättchen pro Liter in verschiedene Behandlungsröhrchen.

Schütteln Sie jedes Aliquot vorsichtig und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann 5 Mikroliter unverdünntes Annexin V-FITC in jedes Mikroröhrchen und inkubieren Sie. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Reaktionspuffer in jedes Röhrchen, um den Prozess zu stoppen.

Gatet die Thrombozytenpopulation mit Forward Scatter oder FSC und verwendet Dichtediagramme, um jede Population unabhängig voneinander zu identifizieren. Legen Sie den negativen Grenzwert ganz rechts von der Thrombozytenpopulation im Ruhezustand fest. Klassifizieren Sie nach der Aktivierung Ereignisse rechts von diesem Grenzwert als Blutplättchen, die Phosphatidylserin freisetzen.

Zur Unterscheidung von Mikrovesikeln setzen Sie den Cutoff auf den niedrigsten FSC-Wert, der in der ruhenden Thrombozytenpopulation beobachtet wurde. Nach der Aktivierung sind positive Ereignisse mit Phosphatidylserin unterhalb dieser Schwelle als Mikrovesikel zu klassifizieren. Ausgangsmessungen zeigten, dass weniger als 2,9 % der nicht aktivierten Blutplättchen eine Phosphatidylserin-Exposition aufwiesen.

Bei der Aktivierung wurden 26,7 % der Blutplättchen mit Kollagen, 9,1 % mit Thrombin und 36,2 % mit Kollagen und Thrombin phosphatidylserinpositiv. Die Behandlung mit Ionophor führte zu 49,6 % Phosphatidylserin-positiven Blutplättchen. Der Ausgangsanteil an Mikrovesikeln betrug 0,3 %Signifikante Anstiege wurden nur bei Kollagen und Thrombin zusammen bei etwa 11,4 % und mehr bei Ionophoren bei 44 % beobachtet