Name: Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten durch Messung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten Blutplättchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Phosphatidylserin-Exposition und Mikrovesikelfreisetzung bei humanen Blutplättchen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen prokoagulärer Thrombozytenaktivität.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analyse der Freisetzung von Thrombozyten, Phosphatidylserin und Mikrovesikeln

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>ACD-A Blutentnahmeröhrchen</td><td>BD Vacutainer</td><td>366645</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-V FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>560931</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase Grad VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0.25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure-Monohydrat</td><td>Merck</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen&nbsp;</td><td>Stago</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>Glukose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ionophor&nbsp;</td><td>Calbiochem/VWR</td><td>100105</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydrogencarbonat</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Thrombin&nbsp;</td><td>Hyphen Biomed</td><td>EZ 006 A</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat-Dihydrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2O</td></tr><tr><td>&alpha; IIb Integrin (CD41, GPIIb) PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von prokoagulanzien-thrombozyten durch messung der phosphatidylserin-exposition und der mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten blutplättchen

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

Die Quantifizierung von gerinnungsfördernden Thrombozyten und Mikrovesikeln erfolgt mittels Annexin-V-Färbung, wobei mindestens 50.000 Ereignisse pro Probe aufgezeichnet werden. Wie in Schritt 2.2 beschrieben, wurden die Thrombozytenaggregationshemmungen zu Studienbeginn an Proben durchgeführt, die mit Reaktionspuffer inkubiert worden waren, wie in Abbildung 1A dargestellt. Die Thrombozytengrößen wurden anhand des medianen Forward-Scatter-Werts (FSC) gemessen. Obwohl die FSC von verschiedenen Faktoren beeinflusst wird, bleibt sie ein gängiger Proxy für die Schätzung der Zellgröße, einschließlich der von Blutplättchen. Dichtediagramme der Fläche (Abbildung 1A) wurden verwendet, um ruhende Thrombozyten und freigesetzte Mikrovesikel zu identifizieren und zu gaten.
Bei den nicht aktivierten Blutplättchen wiesen weniger als 2,9 % Phosphatidylserin (PS) auf, das durch Annexin-V-Färbung bestimmt wurde. Bei Aktivierung der gewaschenen Blutplättchen entweder mit Kollagen allein oder in Verbindung mit Thrombin oder Calciumionophor gab es einen beobachtbaren Anstieg der PS-Exposition. Kollagen allein führte zu einem Anstieg der PS-positiven Blutplättchen um 26,7 %. Thrombin hatte nur minimale Auswirkungen auf die PS-Exposition (9,1 %), aber in Verbindung mit Kollagen erhöhte es den Prozentsatz der PS-exponierten Blutplättchen auf 36,2 %. Zum Vergleich: Die Behandlung mit 2 μM Ionophor führte dazu, dass 49,6 % der Blutplättchen prokoagulant wurden.
Abbildung 1 zeigt, dass der Ausgangsanteil von Mikrovesikeln aus gewaschenen Blutplättchen bei einer gesunden Person minimal war (0,3 %). Während Thrombin und Kollagen die Mikrovesikelbildung minimal erhöhten, stieg die Mikrovesikelbildung erst mit der Kombination von Kollagen und Thrombin signifikant an (Abbildung 1D; 11,4%). Die Zugabe von 2 μM Ionophor führte dazu, dass 44,0 % der Mikrovesikel, die von den Kontrollplättchen gebildet wurden, PS-exponiert waren.
Abbildung 2 gibt Aufschluss über die Variation, Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit, die von diesem Prozess zu erwarten ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg"> 
Abbildung 1: PS-Exposition und Mikrovesikelbildung in ruhenden und aktivierten Kontrollthrombozyten. Die Blutplättchen waren entweder aktiviert oder nicht aktiviert (Ruhe) (A), mit 30 μg/ml Kollagen (B), mit 0,5 U/ml Thrombin (C), mit Kombinationen aus Kollagen und Thrombin (D) mit 2 μM Ionophor. Repräsentative Punktdiagramme zeigen die Thrombozytengröße (Forward Scatter (FSC log)) im Vergleich zur Annexin-V-Bindung. Horizontale und vertikale Linien (E) markieren die plättchennegative Population. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit der PS-Exposition und der Mikrovesikelbildung nach Inkubation mit Ionophor. Analyse der PS-Exposition und der Mikrovesikelbildung nach Inkubation mit entweder 2 μM oder 5 μM Ionophor in gewaschenen Blutplättchen, behandelt oder unbehandelt mit Citrat (einem Calciumchelator): (A) von 4 verschiedenen gesunden Kontrollen; (B) von einer gesunden Kontrollgruppe, die 5 Mal wiederholt wird; und (C) aus zwei gesunden Kontrollen, die von zwei verschiedenen Technikern erstellt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Thrombozytenzahl im Vollblut (10,9 pro ml)</td>
			<td>Relative Zentrifugalkräfte (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;30</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-50</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51-100</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-300</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-600</td>
			<td>290</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt;600</td>
			<td>340</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Relative Zentrifugalkräfte für die Präparation von plättchenreichem Plasma in Bezug auf die Thrombozytenzahl im Vollblut.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zitronensäure-Monohydrat (C6H8O7. H2O, 38 mM)</td>
			<td>8 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinatriumcitrat-Dihydrat (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)</td>
			<td>ca. 180 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukose (C6H12O6, 136 mM)</td>
			<td>ca. 24,6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Der pH-Wert der Lösung sollte nicht angepasst werden. Halten Sie die Lösung bei 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Herstellung einer 1 L wässrigen Lösung von Säure-Citrat-Dextrose (ACD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zitronensäure-Monohydrat (C6, H, 8,O, 7. H2O, 36 mM)</td>
			<td>7,56 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2,6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 ein. Halten Sie die Lösung bei 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 3: Zubereitung der Stammlösung von Waschpuffer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Rinderserumalbumin (BSA)</td>
			<td>583 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Traubenzucker</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>31,5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 4: Herstellung einer 50 mL Magistrallösung von Waschpuffer aus der Stammlösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2,7 mM)</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2,6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (5 mM)</td>
			<td>ca. 1,19 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (12 mM)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H 2O; 0,3 mM</td>
			<td>0,05 Gramm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Halten Sie die Lösung bei 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 5: Herstellung einer Stammlösung von Reaktionspuffer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Rinderserumalbumin (BSA)</td>
			<td>167 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Traubenzucker</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 6: Herstellung einer 50 mL Magistrallösung von Reaktionspuffer aus der Stammlösung.

Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten durch Messung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten Blutplättchen

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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