Radiosynthese, Qualitätskontrolle und Positronenemissionstomographie von ^{Kleintieren Bildgebung von 68}Ga-markierten Nanomolekülen

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Radiopharmazie, also die Herstellung neuer Radiopharmazeutika für Tier und Mensch. Am Ende wollen wir Aspekte einer bestimmten Krankheit, in unserem Fall Krebs, visualisieren und so die Behandlung in der Klinik unterstützen. Wir setzen jetzt auf mehr als nur Bildgebung.

Stattdessen entwickeln wir Theranostika, Verbindungen, die sowohl für die Bildgebung als auch für die Therapie verwendet werden können, indem einfach das radioaktive Isotop umgeschaltet wird, das in den Tracer eingebaut ist. Die primäre Technologie, die im Bereich der Nuklearmedizin eingesetzt wird, ist die Positronen-Emissions-Tomographie, kurz PET, die sowohl für kleine Labortiere als auch für die klinische Praxis zur Verfügung steht. Mit Hilfe von PET können wir die Akkumulation eines radioaktiven Tracers in einem Körper quantifizieren und lokalisieren, was uns wiederum ermöglicht, die Machbarkeit neuer Tracer in kleinen Labortiermodellen auf ihre Machbarkeit im klinischen Einsatz hin zu bewerten.

Die größte experimentelle Herausforderung besteht darin, ein Radiopharmakon zu haben, das für eine intravenöse Injektion geeignet ist. Zusätzlich gibt es eine Herausforderung im Tiermodell. Auf der einen Seite wollen wir ein Tiermodell, das die menschliche Situation nachahmt.

Und auf der anderen Seite wollen wir ein Tiermodell, das reproduzierbar und vorhersagbar ist, und das ist eine schwierige Kombination. Auch in Zukunft wird sich unser Labor auf die nicht-invasive Bildgebung und Therapie von Brustkrebs konzentrieren. Trotz mehrerer Fortschritte auf dem Gebiet der Onkologie in den letzten Jahren gibt es immer noch eine hohe Sterblichkeitsrate und Inzidenz bei Brustkrebs.

Besonders schwierig wird es, wenn diese Krebsart metastasiert ist, und mit nicht-invasiver molekularer Bildgebung möchten wir die Diagnostik für diese Patienten verbessern. Und auch mit Hilfe der Strahlentherapie möchten wir ihre Überlebensraten erhöhen. Messen Sie zunächst die Aktivität der radioaktiv markierten Nanobody-Chelator-Konjugatprobe im Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Aktivitätsmessgerät in der richtigen Einstellung.

Platzieren Sie eine Probe von 10 bis 15 Mikrolitern auf dem pH-Teststreifen, um den pH-Wert zu messen. Einen Mikroliter des radioaktiven Reaktionsgemisches auf einen mit Siliziumdioxid imprägnierten DC-Streifen auftragen und eine Minute trocknen lassen. Füllen Sie die DC-Kammer mit Zitronensäure als mobiler Phase und lassen Sie den Streifen laufen, bis die Flüssigkeit die Oberseite des Streifens erreicht.

Legen Sie den DC-Streifen auf einen Funk-TLC-Scanner und messen Sie ihn gemäß dem Protokoll des Herstellers. Berechnen Sie die Radiomarkierungsausbeute der Reaktion mit Hilfe des Radiochromatogramms, dividieren Sie den integrierten Bereich unter der Kurve von RF durch die Gesamtfläche unter der Kurve und multiplizieren Sie ihn mit 100. Nachdem Sie die HPLC-Leitungen 10 Minuten lang mit dem richtigen Lösungsmittel geflutet haben, passen Sie die Einstellung für die Messung mit dem isokratischen Fluss einer 50-50-Mischung aus Acetonitril als Lösungsmittel A und einer Mischung aus 0,9%iger Natriumchloridlösung in Kombination mit Trifluoressigsäure und Citratlösung als Lösungsmittel B an. Messen Sie die UV-Absorption bei 280 Nanometern.

Verdünnen Sie fünf Mikroliter des Produkts mit 15 Mikrolitern 0,9% Natriumchlorid. Injizieren Sie 15 Mikroliter des Gemisches in die analytische Radio-HPLC. Messen Sie mit den zuvor beschriebenen Einstellungen das radioaktive Signal und die UV-Absorption des Produkts bei 280 Nanometern.

Die geringfügige Verschiebung der Retentionszeiten zwischen dem UV- und dem Gamma-Kanal ist auf das HPLC-Design zurückzuführen. Als nächstes bestimmen Sie die radiochemische Reinheit, indem Sie die Peaks in den Gammakanal integrieren. Integrieren Sie alle anderen Peaks in den Gammakanal und werten Sie sie als Verunreinigungen aus.

Bereiten Sie eine Verdünnung des Produkts von eins zu 20 mit einem Endvolumen von 150 Mikrolitern unter Verwendung von zertifiziertem Endotoxin-freiem Wasser vor. Setzen Sie eine handelsübliche Einweg-Endotoxin-Kartusche mit allen erforderlichen Reagenzien in das Endotoxin-Testgerät ein. Laden Sie 25 Mikroliter des verdünnten Produkts in jede Kartuschenkammer.

Nachdem der Test 15 Minuten lang durchgeführt wurde, umfasst der PTS interne Positiv- und Negativkontrollen. Das Produkt gilt als endotoxinfrei, wenn der Endotoxingehalt weniger als 8,7 Endotoxineinheiten pro Milliliter bei einem maximalen Volumen von 20 Millilitern beträgt. Die HPLC-Analyse bestätigte die chemische und radiochemische Reinheit des Radiopharmakons bei 98,2 % und zeigte einen geringen Unterschied in der Retentionszeit zwischen dem radioaktiven Produkt und der nicht-radioaktiven Referenzverbindung.

Das DC-Chromatogramm zeigte eine scheinbare radiochemische Reinheit von 99,9 % für den 68-Gallium-markierten Nanobody NM02. Beginnen Sie damit, die Spritze je nach Verabreichungsweg mit dem radioaktiven Tracer zu füllen. Messen Sie die Radioaktivität des Tracers mit dem Aktivitätsmesser.

Um einen 30-Gauge-Katheter vorzubereiten, entfernen Sie den metallischen Nadelschaft von der 30-Gauge-Nadel, indem Sie ihn entweder mit einer Metallschere abschneiden oder vom Kunststoff wegbiegen. Führen Sie manuell ein PE-10-Rohr mit einem Durchmesser von 0,3 Millimetern in den Teil der Welle ein, der von der Nabe entfernt wurde. Füllen Sie den 30-Gauge-Katheter mit 0,9 % Natriumchloridpuffer.

Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen einer anästhesierten Maus auf, um ein Austrocknen während der Sedierung zu verhindern. Nachdem Sie die Vene aus dem Schwanz ausgewählt haben, drehen Sie den Schwanz leicht, um die ausgewählte Vene in Kontakt mit der Heizmatte zu bringen, und lassen Sie sie eine Minute lang erweitern. Drehen Sie dann die Maus in die seitliche Position, so dass die ausgewählte Vene nach oben zeigt.

Fixiere die Spitze und den Ansatz des Schwanzes mit Klebeband. Nehmen Sie den 30-Gauge-Katheter mit der dominanten Hand und legen Sie den Zeigefinger der nicht-dominanten Hand vorsichtig auf die ausgewählte Vene, um einen Blutstau im Inneren zu erzeugen und einen kleinen Höcker zu bilden. Platzieren Sie mit der dominanten Hand den 30-Gauge-Katheter parallel zum Schwanz mit Blick auf den Höcker der Vene.

Bewegen Sie die dominante Hand nach vorne, um eine direkte Venenpunktion zu gewährleisten. Im Inneren der Vene wird der Blutrückfluss in der Kunststoffröhre sichtbar. Fixieren Sie den Kunststoffschlauch, um sicherzustellen, dass sich die Nadel während der Injektion nicht in der Vene bewegt.

Führen Sie am freien Ende des Schlauchs die Tracer-Spritze ein, die mit einer 30-Gauge-Nadel verbunden ist. Injizieren Sie den Inhalt der Prüfspritze langsam 10 Sekunden lang. Während die 30-Gauge-Nadel mit dem Kathetersystem verbunden bleibt, entfernen Sie nur die Tracerspritze und schließen Sie eine Spritze mit 0,9 % Natriumchloridpuffer an, um den Katheter zu spülen.

Entfernen Sie den 30-Gauge-Katheter aus der Schwanzvene und verwenden Sie eine sterile Baumwollkompresse, um die Blutung zu stoppen. Berechnen Sie die übrig gebliebene Aktivität, indem Sie die Aktivität des 30-Gauge-Katheters, der Pufferspritze, der leeren Tracerspritze und der Wattekompresse mit einem Aktivitätsmesser messen. Legen Sie die sedierte Maus in Bauchlage auf das Tierbett und befestigen Sie sie am PET-Scanner.

Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz der Maus während des Scans zwischen 75 und 50 Atemzügen pro Minute liegt. Fixieren Sie die Maus hinter dem Hals mit medizinischem Klebeband am Tierbett. Stellen Sie die Aufnahmezeit auf 45 Minuten ein und wählen Sie den Bereich aus, der Sie untersuchen möchten.

Geben Sie die Menge der injizierten Aktivität und den Zeitpunkt der Injektion ein. Wählen Sie dann 68-Gallium als Studienisotop aus und starten Sie den Scan. Das CT-Bild grenzte die Nieren von Mäusen eindeutig ab und ermöglichte eine Knochenbeurteilung.

Das PET-Bild, das eine standardisierte Aufnahmewertskala von null bis 5,0 verwendete, zeigte eine bemerkenswerte Tumoraufnahme in der linken Flanke der Maus und eine renale Clearance des Tracers. Das PET-CT-Fusionsbild ermöglichte eine umfassende Bewertung der Tracer-Biodistribution. Die Hochprojektion der maximalen PET-Intensität zeigte die Aktivität der Harnblase, was die renale Clearance des Tracers verstärkte.