Name: Verbesserung der Studienergebnisse mit einer anpassungsfähigen kursbasierten Forschungserfahrung im Grundstudium zum molekularen Klonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Erfahren Sie, wie ein anpassungsfähiges Gibson-Assembly-Modul in einer kursbasierten Forschungserfahrung das Verständnis und die Selbstwirksamkeit von Studierenden im molekularen Klonen verbessert.

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<meta charset="utf8"></head><body>Implementierung der Gibson-Assemblierung zur Verbesserung der molekularbiologischen Ausbildung und Fähigkeiten

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
</ol>

Die Ausbildung von Studenten in grundlegenden molekularbiologischen Konzepten und Labortechniken ist für ihre wissenschaftliche und berufliche Entwicklung von entscheidender Bedeutung, da diese Methoden in verschiedenen Forschungsbereichen, einschließlich Hochschulen und Industrie, üblich sind. Daher müssen Studierende der Hauptfächer Biologie (Konzentration Molekular- und Zellbiologie) und Biochemie an der California Polytechnic State University, San Luis Obispo (Cal Poly) einen molekularbiologischen Laborkurs der Oberklasse belegen, um diese Themen zu erlernen und anzuwenden (CHEM/BIO 475). Zuvor wurde ein Basiscurriculum für diesen Kurs entwickelt, in dem die Studierenden eine Topoisomerase-basierte (TOPO) Klonierung durchführen, um ein Aktin-haltiges Plasmid zusammenzusetzen, das aus einer Hefe-Komplementär-DNA (cDNA)-Vorlagehergestellt wird 1. Die Schülerinnen und Schüler entwerfen Experimente auf der Grundlage von Fragen, die authentische Forschungshypothesen nachahmen, und erhöhen so ihre Vertrautheit mit Laborpraktiken und forschendem Lernen. Die kontinuierliche Weiterentwicklung auf dem Gebiet der Molekularbiologie erfordert eine Anpassung der entsprechenden Lehrpläne, um die Studierenden mit modernen Kompetenzen auf die Arbeitswelt vorzubereiten. Insbesondere die Verwendung der Gibson-Assembly hat sich in der wissenschaftlichen Gemeinschaft immer mehr durchgesetzt; Während die Methode ursprünglich zur Synthese künstlicher Chromosomen2 etabliert wurde, haben zum Zeitpunkt dieses Berichts über 5.000 Veröffentlichungen auf die ursprüngliche Arbeit von Gibson et al. verwiesen. Die Gibson-Assemblierung ist im Vergleich zu herkömmlichen Klonierungsmethoden einzigartig: Sie ist hochgradig anpassbar und kann problemlos mehrere lineare DNA-Fragmente ligieren, ohne dass Restriktionsstellen zur Herstellung der Verbindungen erforderlich sind. Daher sahen wir die Möglichkeit, das CHEM/BIO 475-Curriculum zu überarbeiten, um moderne molekulare Klonierungstechniken einzubeziehen und das forschungsbasierte Kursmodell zu verbessern.
Es wurde festgestellt, dass studentische Forschungserfahrungen zu einem verbesserten konzeptionellen Verständnis, zur Entwicklung von Fähigkeiten und zu einem besseren Durchhaltevermögen in der Wissenschaftbeitragen 3, aber nicht alle Studenten im Grundstudium haben die Möglichkeit, direkt an einem Forschungslabor teilzunehmen. Um der Herausforderung der begrenzten studentischen Kapazitäten in Forschungslabors zu begegnen, wurden kursbasierte Forschungserfahrungen (CUREs) entwickelt und eingesetzt, um den Zugang zu Wissenschaft durch authentische Forschung im Klassenzimmer zu verbessern. Während CUREs in ihrer Umsetzung unterschiedlich sind, haben sich gemeinsame Praktiken etabliert, die sich mit den fünf Grundsätzen der wissenschaftlichen Forschung befassen. In einem gut konzipierten CURE werden die Studierenden 1) wissenschaftliche Praktiken anwenden, 2) an einem Forschungsprojekt mitarbeiten, 3) versuchen, neue Entdeckungen zu machen, 4) zu einer außerhalb des Klassenzimmers relevanten Arbeit beitragen und 5) Hypothesen und Methoden im Falle eines experimentellen Scheiterns neu bewerten und überarbeiten4. Ähnlich wie bei herkömmlichen Forschungserfahrungen von Schülern in einem Labor hat sich gezeigt, dass CUREs das Vertrauen der Schüler in die Wissenschaft, die wissenschaftlichen Fähigkeiten, die Projektverantwortung und die Beharrlichkeit in den Bereichen Mathematik, Informatik, Naturwissenschaften und Technik (MINT) stärken5. Während CUREs, die molekulare Klonierung beinhalten, bereits zuvor berichtet wurden 6,7,8,9,10,11,12,13, sind uns keine bekannt, die die Anpassungsfähigkeit der Gibson-Assemblierung zur Erstellung einer Bibliothek authentischer Forschungsplasmide betonen.
Hier berichten wir über eine Erweiterung des aktuellen forschungsbasierten CHEM/BIO 475-Curriculums an der California Polytechnic State University, San Luis Obispo, mit zwei wesentlichen Verbesserungen: praktische Erfahrungen mit der Gibson Assembly und studentische Teilnahme an einem CURE, das originelle Plasmidkonstrukte für Forschungsprojekte bereitgestellt hat, die von der National Science Foundation finanziert wurden (NSF-1708919 und NSF-2300890). In drei Implementierungen dieses Curriculums haben die Studierenden zu zwei unterschiedlichen Forschungsprojekten beigetragen, die sich auf die Naturstoffbiosynthese von bioaktiven Molekülen konzentrieren, die von Actinomycetota produziert werden. Naturstoffe enthalten häufig Pharmakophore mit antibiotischen, antimykotischen und/oder krebshemmenden Wirkungen, was diesen kleinen Molekülen Bedeutung für die Wirkstoffforschung und Potenzial für klinische Relevanz verleiht14. Diese Forschung erfordert die Erstellung von Plasmidbibliotheken, um sowohl die Funktion als auch das technische Potenzial bakterieller biosynthetischer Enzyme untersuchen zu können. In diesem CURE entwarfen und führten die Studierenden Gibson-Assembly-Experimente durch, um die einzigartigen Plasmidbibliotheken zu klonen, die für diese Forschungsprojekte relevant sind (Abbildung 1). Darüber hinaus zeichnen sich das Format und das Design des Moduls dadurch aus, dass es leicht anpassbar ist, um beliebige Plasmide zu erzeugen, die für andere Forschungsprojekte von Interesse sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
Abbildung 1: Überblick über die Rolle der Gibson-Montage in unserem Forschungslabor. Actinomycetota stellen niedermolekulare Naturstoffe mit klinisch relevanten Bioaktivitäten her, indem sie Gencluster verwenden, die für biosynthetische Enzyme kodieren. In unserer Forschung werden Plasmide, die ein biosynthetisches Gen enthalten, über Gibson-Assemblierung assembliert, um die Funktion des kodierten Enzyms nachgelagert zu untersuchen. Wissenschaftsikonen aus Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Übersicht über das Labor
Das Molecular Biology Laboratory ist ein Oberstufenkurs, der für Biochemie-Hauptfächer und Biologie-Hauptfächer mit einem Schwerpunkt auf Molekular- und Zellbiologie erforderlich ist. Andere Studierende, die die Voraussetzungen erfüllen, sind herzlich eingeladen, den Kurs als Wahlfach der Oberstufe zu belegen. Der Kurs ist gemeinsam mit dem Fachbereich Chemie und Biochemie und dem Fachbereich Biologie an der Cal Poly gelistet. Dozenten beider Fachbereiche wechseln sich in jedem Semester ab (zwei Viertel Biologie, ein Viertel Chemie und Biochemie).
Die Klasse trifft sich zweimal pro Woche für 170 Minuten und einmal pro Woche für eine 50-minütige Vorlesung im Labor. Laborabschnitte umfassen maximal 16 Studierende und jedes Quartal werden 2-3 Laborabschnitte angeboten. Der Kurs dauert 10 Wochen, und die Abschlussprüfung wird während des letzten Termins in Woche 10 durchgeführt. In der Vorlesungszeit wird die Theorie hinter vielen der im Labor durchgeführten experimentellen Techniken sowie aktuelle Themen der Molekularbiologie diskutiert, die im Labor nicht behandelt werden. Der Kernlehrplan des Labors umfasst den Prozess der Klonierung des Aktin-Gens aus Hefe1, der etwa 7 Wochen (13-14 Laborsitzungen) dauert. Zu den Techniken gehören Mikropipettieren, Hefe-RNA-Isolierung, Amplifikation eines Hefegens mittels reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), TOPO-Klonierung, Blau-Weiß-Screening, Plasmidisolierung und Verifizierung des Inserts durch Restriktionsverdau und PCR, In-silico-Analyse von Klonen und DNA-Sequenzanalyse. Der Lehrplan für die letzten 3 Wochen des Kurses liegt im Ermessen des Dozenten, beinhaltet jedoch die Durchführung eines "unabhängigen Projekts" mit undefinierten Ergebnissen.
Übersicht über Experimente
Ein Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe sind die Biosynthesewege in Actinomycetota. Bei der Konzeption des unabhängigen Projekts sahen wir vor, dass die Studenten Plasmide durch Gibson Assembly herstellen sollten, die in unseren Forschungsprojekten zur Untersuchung der Biosynthese von Naturstoffen verwendet werden sollten. Während die Iterationen des Kursmoduls, die hier bewertet werden, speziell für Plasmide waren, die die Manipulation von Biosynthesewegen ermöglichen, ist der Gibson-Assembly-Workflow enorm anpassbar für andere molekulare Klonierungsprojekte (Abbildung 2). Der Arbeitsablauf wurde in drei verschiedene Experimente (A, B und C) aufgeteilt, die über zwei Vorlesungsstunden und sechs Laborstunden (insgesamt 3 Wochen) durchgeführt wurden (siehe Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2). Den Experimenten gingen Arbeitsblätter voraus, um die Vorbereitung der Schüler zu unterstützen und das Verständnis der Schüler zu bewerten (Ergänzende Akte 3, Ergänzende Akte 4 und Ergänzende Akte 5). Der Workflow wird in einem Format dargestellt, das flexibel auf die Bedürfnisse und Interessen eines Kursleiters zugeschnitten ist.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
Abbildung 2: Arbeitsablauf des Gibson Assembly-Moduls. Tag 1 und Tag 4 sind Vorlesungszeiten, in denen die Studierenden die In-silico-Sequenzanalyse und die Versuchsplanung durchführen. Die Tage 2–3 und 5–8 sind Laborbesprechungen, in denen die Schritte zur Klonierung neuartiger Plasmide mittels Gibson-Assemblierung durchgeführt werden, gefolgt von Isolierung und Screening. Das bildliche Flussdiagramm ist nach den drei Experimenten gruppiert, die die Schülerinnen und Schüler durchführen (A, B und C). Ausführlichere Anweisungen und Protokolle finden Sie in den Dozenten- und Schülerhandbüchern, die als ergänzende Datei 1 bzw. ergänzende Datei 2 bereitgestellt werden. Wissenschaftsikonen aus Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das unabhängige Projektmodul Gibson Assembly wurde erstmals im Frühjahrsquartal 2019 in der CHEM/BIO 475 pilotiert. In den Jahren 2020 und 2021 wurde der Kurs aufgrund der SARS-CoV-2-Pandemie online unterrichtet. Als der Präsenzunterricht im Frühjahr 2022 und 2023 wieder aufgenommen wurde, wurden die Studierenden des Kurses eingeladen, an einer Studie teilzunehmen, in der die Lernergebnisse eines unabhängigen Projekts der Gibson Assembly bewertet wurden, bei dem originale, forschungsrelevante Plasmide kloniert werden sollten. Im Jahr 2019 erstellten die Studierenden eine Bibliothek von Plasmiden, die aus Genkassetten aus dem Genom von Micromonospora echinospora ATCC 15837 bestand, die in pKC1132 kloniert wurden (Abbildung 3). Diese Plasmidbibliothek wird in unserem Forschungslabor verwendet, um Gene von Interesse in einem mutmaßlichen biosynthetischen Gencluster für den Naturstoff TLN-0522015 zu inaktivieren. Um unsere Geninaktivierungsstudien zu ergänzen, klonierten die Studierenden im Jahr 2022 eine kleine Bibliothek von Genen aus dem mutmaßlichen TLN-05220-Gencluster in pUC19 (Abbildung3); Unsere Forschungsgruppe hat diese Plasmide zur Subklonierung von Genen in Expressionsvektoren, einschließlich pET28b, für die Überexpression und Reinigung von Proteinen verwendet. Die Studierenden des Jahrgangs 2023 trugen zu den laufenden Arbeiten an einem Biosynthese-Engineering-Projekt zur Epoxomicin-Synthetase16 bei. In Teams von 3 bis 4 Klonierten die Studierenden manipulierte Domänen von nicht-ribosomalen Peptidsynthetase17-Modulen in verschiedene Proteinexpressionsvektoren, um die Überexpression und Reinigung dieser Enzyme in unserem Forschungslabor zu optimieren (Abbildung 3). Redundanz wurde in den Klonierungsplan für jede Kohorte eingebaut. Zum Beispiel enthielt die Kohorte 2019 44 Studenten, und 15 Plasmide wurden der Klasse für die Klonierung zugewiesen. Daher wurde die Klonierung jedes Plasmids zwei- oder dreimal versucht.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
Abbildung 3: Zusammenfassung der klonierten Plasmide und der teilnehmenden Studenten während der unabhängigen Projektiterationen 2019, 2022 und 2023. Das Gibson Assembly-Projekt wurde bereits dreimal eingesetzt. In jedem Angebot klonierten die studentischen Teilnehmer eine andere Bibliothek von Plasmiden, die in Forschungsprojekten zur Erforschung von Biosynthesewegen verwendet werden sollen. Projekte in den Jahren 2019 und 2022 unterstützten unsere laufenden Arbeiten am Naturstoff TLN-0522015 mit zwei Fragmenten (eine Genkassette bzw. ein Gen und ein Vektor) Gibson Assemblierungsreaktionen. Das Projekt aus dem Jahr 2023 befasste sich mit dem Domänentausch innerhalb der Module 1 und 2 eines nicht-ribosomalen Peptidsynthetase (NRPS)-Enzyms, das an der Epoxomicin-Biosynthese beteiligt ist16. Die schraffierten Fragmente stellen zwei verschiedene Mutanten der vertauschten Domäne dar, und Volltonfarben stellen Domänen dar, die nicht vertauscht wurden. Insgesamt wurden acht verschiedene Genfragmente (vier für Modul 1 und vier für Modul 2) mit Überhängen erzeugt, die für die Gibson-Assemblierung kompatibel sind. Für jedes Modul wurden zwei verschiedene Kombinationen von drei Genfragmenten mit einem von zwei verschiedenen Vektoren (pBAD33 und pET28, insgesamt vier Fragmente pro Assemblierung) assembliert, um das Potenzial zu haben, acht manipulierte NRPS-Plasmide zu erzeugen. Wissenschaftsikonen aus Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Übersicht über die Bewertung
Mindestens 1 Woche vor Beginn des unabhängigen Gibson Assembly-Projekts wurden die Studierenden der Kohorten 2022 und 2023 eingeladen, an einer Lernergebnisuntersuchung teilzunehmen, die ähnlich wie eine Studie konzipiert war, die im Rahmen einer Umfrage im Biochemie-Laborkurs an der Cal Poly18 durchgeführt wurde. Die studentischen Teilnehmer füllten einen Multiple-Choice-Fragebogen im Lab-Meeting vor Beginn des unabhängigen Projekts und einen Multiple-Choice-Post-Fragebogen während des abschließenden Lab-Meetings (d.h. nachdem sie das Gibson-Assembly-Modul absolviert hatten) aus. Die Vor- und Nachfragebögen bestanden aus 28 identischen Fragen mit zwei zusätzlichen Fragen im Nachfragebogen (insgesamt 30). Es wurden zehn inhaltliche Fragen verfasst, um das Wissen der Schülerinnen und Schüler über Enzyme und Mechanismen zu bewerten, die an der molekularen Klonierung beteiligt sind (z. B. Polymerase-Kettenreaktion [PCR], Gibson-Assemblierung, Transformation, Blau-Weiß-Screening). In den folgenden sieben Fragen wurden die Studierenden aufgefordert, ihre Vertrautheit mit Begriffen der molekularen Klonierung (z. B. DNA-Polymerase, Exonuklease, Ligase) selbst einzuschätzen. Die nächsten 10 Fragen ermöglichten es den Studierenden, ihre Fähigkeit zur Durchführung molekularer Klonierungstechniken (z. B. DNA-Sequenzanalyse, Restriktionsverdaureaktionen, Agarosegelelektrophorese) selbst einzuschätzen. Die Studierenden berichteten auch, ob sie aufgrund ihres Wissens über molekulare Klonierungstechniken eine Karriere in der Molekularbiologie anstreben würden. Im Nachfragebogen wurden zwei zusätzliche Fragen gestellt, mit denen die Studierenden selbst beurteilen konnten, wie sehr sie sich für das Lernen im Kurs engagieren und ob der Kurs eine wertvolle Lernerfahrung war (Ergänzende Akte 6 und Ergänzende Akte 7). Alle Daten aus den Vor- und Nachfrageantworten der Studierenden aus den Jahren 2022 und 2023 wurden für die Analyse kombiniert und sind in der ergänzenden Tabelle S1 verfügbar.

<table><tbody><tr><td>Desoxyribonukleotidtriphosphat (dNTPs, 10&nbsp; mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td>hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td>hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>1000 Einheiten</td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Mikrobiologischer Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Isotemp Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>S28124</td><td></td></tr><tr><td>GelRotes Nukleinsäure-Gel Färben</td><td>Biotium</td><td>NC9594719</td><td>10.000X</td></tr><tr><td>GeneJET Gelextraktion und DNA-Aufreinigung Micro Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERK0831</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA-Leiter</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERSM0314</td><td>100 Anwendungen</td></tr><tr><td>LB Brühe, Miller</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9723-500 500</td><td>g</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td>Hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus X2 Gradient Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 16 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Micromonospora echinospora bakterien</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellenherd</td><td>General Electric&nbsp;</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>Molekularbiologie Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Nanodrop One Microvolume Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td>20 x 0,05 mL</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621S</td><td>10 Reaktionen</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 40 Tisch-Orbitalschüttler</td><td>New Brunswick</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Fisher BioReagenzien</td><td>BP248450</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr><tr><td>Phusion DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr><tr><td>Tragbare Waage</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 Vektor</td><td>New England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 Reaktionen</td></tr><tr><td>T5 Exonuklease</td><td>Epizentrum</td><td>T5E4111K</td><td>Hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1137918</td><td>Hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Thermo Wissenschaftliche</td><td>FERR1161</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Hausgemachte MasterMix-Komponente</td></tr></tbody></table>

verbesserung der studienergebnisse mit einer anpassungsfähigen kursbasierten forschungserfahrung im grundstudium zum molekularen klonen

Improving Student Outcomes with an Adaptable Molecular Cloning Course-Based Undergraduate Research Experience

Verbesserung der Studienergebnisse mit einer anpassungsfähigen kursbasierten Forschungserfahrung im Grundstudium zum molekularen Klonen

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

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