Name: CIRCLE-Seq zur Abfrage von Off-Target-Gen-Editing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie CIRCLE-seq Off-Target-Effekte in CRISPR-Cas9-Genomeditierungen mit hoher Sensitivität identifiziert. Diese Methode verbessert die Sicherheit von Gentherapien durch präzise Kartierung unbeabsichtigter Schnittstellen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Detektion von Off-Target-CRISPR-Cas9-Spaltungsereignissen mit CIRCLE-Seq

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and beta-thalassemia.</a> N Engl J Med. 384 (3), 252-260 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+treatment+inserted+directly+into+the+body+for+first+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR treatment inserted directly into the body for first time.</a> Nature. 579 (7798), 185(2020).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385 (6), 493-502 (2021).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
<li>Hong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+base+editing+and+prime+editing+of+COL7A1+mutations+in+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic base editing and prime editing of COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Mol Ther. 30 (8), 2664-2679 (2022).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+prime+editing+via+xrRNA+motif-joined+pegRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancement of prime editing via xrRNA motif-joined pegRNA.</a> Nat Commun. 13 (1), 1856(2022).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+editing+with+genuine+Cas9+nickases+minimizes+unwanted+indels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels.</a> Nat Commun. 14 (1), 1786(2023).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3143-3150 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Has, C., Kiritsi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+inherited+skin+fragility+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Therapies for inherited skin fragility disorders.</a> Exp Dermatol. 24 (5), 325-331 (2015).</li>
<li>Murnane, J. P., Yezzi, M. J., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+events+during+integration+of+transfected+DNA+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells.</a> Nucleic Acids Res. 18 (9), 2733-2738 (1990).</li>
<li>Hsieh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndrome+unrelated+to+lentiviral+vector+in+a+patient+treated+with+gene+therapy+for+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndrome unrelated to lentiviral vector in a patient treated with gene therapy for sickle cell disease.</a> Blood Advances. 4 (9), 2058-2063 (2020).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 187-197 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Lensing, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSBCapture%3A+In+situ+capture+and+sequencing+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DSBCapture: In situ capture and sequencing of DNA breaks.</a> Nat Methods. 13 (10), 855-857 (2016).</li>
<li>Crosetto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-resolution+DNA+double-strand+break+mapping+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing.</a> Nat Methods. 10 (4), 361-365 (2013).</li>
<li>Yan, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLISS+is+a+versatile+and+quantitative+method+for+genome-wide+profiling+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks.</a> Nat Commun. 8, 15058(2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digenome-seq%3A+Genome-wide+profiling+of+CRISPR-Cas9+off-target+effects+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Digenome-seq: Genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.</a> Nat Methods. 12 (3), 237-243 (2015).</li>
<li>Cameron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+genomic+landscape+of+CRISPR-Cas9+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.</a> Nat Methods. 14 (6), 600-606 (2017).</li>
<li>Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+off-target+detection+with+DISCOVER-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1143157(2023).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Lazzarotto, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+CRISPR-Cas9+genome-wide+nuclease+activities+with+CIRCLE-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq.</a> Nat Protoc. 13 (11), 2615-2642 (2018).</li>
<li>Butterfield, K. T., McGrath, P. S., Han, C. M., Kogut, I., Bilousova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+with+the+constitutive+EGFP+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line with the constitutive EGFP reporter.</a> Methods Mol Biol. 2155, 11-21 (2020).</li>
<li>Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+viral+delivery+of+Cas9+into+human+safe+harbor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor.</a> Sci Rep. 10 (1), 21474(2020).</li>
<li>Kogut, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA-based+reprogramming+of+human+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts.</a> Nat Commun. 9 (1), 745(2018).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+The+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li>
<li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nat Protoc. 16 (1), 10-26 (2021).</li>
<li>Cromer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+CRISPR+off-target+discovery+tools+following+ex+vivo+editing+of+CD34%28%2B%29+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of CRISPR off-target discovery tools following ex vivo editing of CD34(+) hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Mol Ther. 31 (4), 1074-1087 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,2 ml dünnwandige Röhrchen und Schieberkappen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB1114</td><td></td></tr><tr><td>1,5 % PippinHT-Kassette</td><td>Sage Science</td><td>HTC1510</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische Pipetten&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>12567603</td><td></td></tr><tr><td>konisches 15-ml-Röhrchen</td><td>FisherScientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>150 x 25 mm Gewebekulturschale</td><td>FisherScientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Reagenzreservoir&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>2138127C</td><td></td></tr><tr><td>2x Kapa KiFi HotStart Ready Mix&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serologische Pipetten&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>konisches 50-ml-Röhrchen</td><td>FisherScientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE-Elektrophorese-Puffer&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Reagenz, 60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Mikrozentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5400002</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puffer QX1</td><td>Qiagen</td><td>20912</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Nuklease, Streptococcus Pyogenes&nbsp; </td><td>New England BioLabs</td><td>M0386M</td><td></td></tr><tr><td>CIRCLE-seq Bibliotheksvorbereitung und NGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-qualifizierte Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Extrazelluläre Matrix (ECM) für die Kultivierung von iPSCs</td></tr><tr><td>ddPCR SuperMix für Sonden&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863010</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Patronenhalter&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Patronen&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Dichtungen&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>Hergestellt von Invitrogen</td></tr><tr><td>Tröpfchenerzeugungsöl für Sonden&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Tröpfchen-Leseöl</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), pH 8,0, RNasefreier</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Hergestellt von Invitrogen</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; ThermoMischer&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol, reiner</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Exonuklease I&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293L</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Filtereinheit&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Gefilterte sterile Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fokussiertes Ultraschallgerät&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>ME220</td><td></td></tr><tr><td>Genomische DNA-Isolierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genomische DNA-Scherung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Core Kit</td><td>Qiagen</td><td>158043</td><td></td></tr><tr><td>gRNAs</td><td>Synthego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS Tri-gas Befeuchteter Gewebekultur-Inkubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030411</td><td>Bedarf an der Kultivierung und Expansion von iPSCs (37 &deg; C/5% CO2/5% O2)</td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 DNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 Reagenzien</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>HTP Library Preparation Kit&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8235</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Antibiotikum Antimykotische Lösung</td><td>Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>IDTE pH 8,0 (1x TE Lösung)</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>11050204</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td></td><td></td><td>Bedarf an der Bildgebung von iPS-Kolonien in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen iPSC-Kultur</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Exonuklease&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262L</td><td></td></tr><tr><td>Ladespitzen, 10er-Pack</td><td>Agilent</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Magnum FLX Enhanced Universal Magnetplatte&nbsp;</td><td>Alpaqua</td><td>A00400</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>31104051</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen AFA Faser Vorschlitz Schnappkappe&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 5x Supplement</td><td>StemCell Technology</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 Basalmedium (400 mL)</td><td>StemCell Technology</td><td>85851</td><td>Medium zur Aufrechterhaltung von iPSC in Kultur</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000 Spektralphotometer&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex-Oligos für Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primer Set 1</td></tr><tr><td>Optische Tubenstreifenkappen, 8x Streifen</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Optische Tubenstreifen, 8x Streifen</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Andere Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Sealer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>Modellnummer PX1</td></tr><tr><td>PEG/NaCl SPRI-Lösung&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0536L</td><td></td></tr><tr><td>Durchstechbare Folien-Heißsiegelung&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Plasmidsichere ATP-abhängige DNase&nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>E3110K</td><td></td></tr><tr><td>Primer, Adapter und Sonden</td><td>IDT-Sequenzen</td><td></td><td>sind in Tabelle 1</td></tr><tr><td>aufgeführt. Proteinase K&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAxcel Gel-Analysesystem&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001941</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Röhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay-Kit&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay-Kit&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchen-Digital-PCR-System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td>Enthält einen QX200-Tröpfchengenerator und einen QX200-Tröpfchenleser</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Platte mit halbem Rand&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>SeqPlaque GTG Agarose&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50110</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Sicherer DNA-Gel-Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Kolben&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>7202000</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler mit programmierbarer Temperaturstufenfunktion</td><td>Bio-Rad C1000 Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Basis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec PCR Platte&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E951020346</td><td>96 Brunnen, halbumrandet, grünes</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>USER Enzym&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M5505L</td><td></td></tr></tbody></table>

circle-seq zur abfrage von off-target-gen-editing

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Hier wird CIRCLE-seq verwendet, um die Nuklease-induzierten Spaltstellen von Cas9 in einem Komplex mit der gRNA zu untersuchen, der auf die Adeno-assoziierte Virusintegrationsstelle 1 (AAVS1) abzielt, wobei DNA verwendet wird, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) isoliert wurde. Diese gRNA wurde bereits in unserer Publikationbeschrieben 27. Etwa 25 μg gDNA wurden aus iPS-Zellen isoliert, durch fokussierte Ultraschalluntersuchung geschert und die Größe mittels AMPure XP Bead-Aufreinigung ausgewählt, um Fragmente von ca. 300 bps zu erhalten. Von diesen 25 μg DNA wurden ca. 2-5 ng DNA für die in vitro Cas9:gRNA-Spaltung erfolgreich zirkuliert. Die gesamte Vorgehensweise ist in Abbildung 1 dargestellt.
Nach einem CIRCLE-seq-Verfahren und einer Analyse unter Verwendung unseres Berechnungsworkflows ist in Abbildung 2A eine Visualisierung aller detektierten On- und Off-Target-Spaltstellen dargestellt. Die CIRCLE-seq-Pipeline lieferte auch "Merged Reads", die mit der statistischen Software R analysiert wurden, um ein Manhattan-Diagramm zu erhalten, das die detektierten Nuklease-induzierten Spaltstellen entlang jedes Chromosoms zeigt (Abbildung 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schaltpläne des CIRCLE-seq-Workflows. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig02.jpg"> 
Abbildung 2: CIRCLE-seq-Visualisierung und Manhattan-Plot. (A) Ausrichtung von Off-Target-Stellen gegen das beabsichtigte Ziel für den AAVS1-Locus. Die Zielsequenz wird oben angezeigt, wobei die Off-Targets nach der Anzahl der Lesevorgänge in absteigender Reihenfolge geordnet sind. Unterschiede in den ursprünglichen Zielsequenzen werden durch farbige Nukleotide dargestellt. Eine Stichprobe der wichtigsten unbeabsichtigten Spaltstellen für den AAVS1-Locus ist dargestellt. (B) Manhattan-Diagramm, das die entdeckten unbeabsichtigten Spaltstellen für den AAVS1-Locus veranschaulicht. Die Balkenhöhen stellen die Leseanzahl für jede Chromosomenposition dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibel</td>
			<td>Sequenz (5'-3')</td>
			<td>Kommentare/Beschreibung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Einzelne Guide-RNA (sgRNA)</td>
			<td>GGGGCCACUAGGGACAGGAU</td>
			<td>Für den fluoreszierenden Protein-Knock-in des AAVS1-Locus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Forward Primer</td>
			<td>GCTCTGGGCGGAGGAATAT</td>
			<td>Für den gRNA-In-vitro-Spaltungstest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1 Reverse Primer</td>
			<td>ATTCCCAGGGCCGGTTAATG</td>
			<td>Für den gRNA-In-vitro-Spaltungstest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1288</td>
			<td>/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaT</td>
			<td>CIRCLE-seq Haarnadel-Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1274</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAG</td>
			<td>TruSeq F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1275</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT</td>
			<td>TruSeqF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1310</td>
			<td>/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/</td>
			<td>TruSeq-Sonde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1311</td>
			<td>/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/</td>
			<td>TruSeq-Sonde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Sequenzen von gRNA und Primern, die für die CIRCLE-seq-Analyse des AAVS1-Locus verwendet wurden.

CIRCLE-Seq zur Abfrage von Off-Target-Gen-Editing

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

circle-seq-for-interrogation-of-off-target-gene-editing

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Genom-Editing-Tools wie das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) haben die Effizienz des Gen-Targetings in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erheblich verbessert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Generierung eines linienspezifischen hiPSC-Reporters unter Verwendung der CRISPR/Cas-System-unterstützten homologen Rekombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow eines CRISPR/Cas9-basierte Gens editing-System für die Reparatur von Punktmutationen in Säugetierzellen. Hier verwenden wir einen kombinatorischen Ansatz zur gen Bearbeitung mit einer detaillierten Follow-on experimentelle Strategie zur Messung von Indel Bildung an die Ziel-Site-Analyse im Wesentlichen vor-Ort-Mutagenese.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Gezielte gen bearbeiten CRISPR/Cas9 hat das Verständnis der biologischen Funktionen der Gene erheblich erleichtert. Hier nutzen wir die CRISPR/Cas9-Methodik zu Modell Calreticulin Mutationen in hämatopoetischen Zellen Zytokin-abhängige um ihre onkogenen Aktivität zu studieren.

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

CRISPR-Cas ist eine leistungsstarke Technologie, die komplexe Genome von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. Hier zeigen wir ein Protokoll, das menschliche Genom mit verschiedenen Cas jedoch effizient zu bearbeiten. Wir markieren wichtige Überlegungen und Design-Parameter zur Optimierung der Bearbeitung Effizienz.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die CRISPR/Cas9-Technologie mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay integriert, um Kandidatengene zu identifizieren, die für die abnormale proliferative Kapazität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen entscheidend sind.

Bewertung abnormer wachstumsbezogener Gene von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Kombination der CRISPR/Cas9-Technologie mit der Zellzählung

Die Effizienz der I-GONAD-Methode (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) ist vergleichbar mit der herkömmlichen Mikroinjektion, bei der Zygotenentnahme von Spenderinnen und die Übertragung auf pseudoschwangere Frauen erforderlich ist. Dieses Protokoll demonstriert seine Wirksamkeit durch die Einführung von CRISPR/Cas9-induzierten Mutationen in den ROSA26-Locus auf Chromosom 6.

Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

Die Abgabe von Genomeditoren als RNAs ist ein besonders wirkungsvolles Mittel zur Modifikation der Genome primärer Säugetierzellen und -zelllinien. Ziel dieses Protokolls ist es, Genom-Editoren als mRNA in primäre Säugetierzellen und -zelllinien zu liefern, gefolgt von gezielter Illumina-Sequenzierung und Analyse zur Quantifizierung der Editierergebnisse.

Genom-Editierung in primären Säugetierzellen mittels Elektroporation von Editor-RNA

Erfahren Sie, wie CIRCLE-seq Off-Target-Effekte in CRISPR-Cas9-Genomeditierungen mit hoher Sensitivität identifiziert. Diese Methode verbessert die Sicherheit von Gentherapien durch präzise Kartierung unbeabsichtigter Schnittstellen.

CIRCLE-Seq zur Abfrage von Off-Target-Gen-Editing

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