CIRCLE-Seq zur Abfrage von Off-Target-Gen-Editing

Unser Team widmet sich der Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen, iPSC-Therapien, für schwere, derzeit unheilbare Hautkrankheiten wie die rezessive dystrophische Epidermolysis bullosa. Unser Ziel ist es, herauszufinden, ob eine präzise Gen-Editierung in Verbindung mit der Differenzierung von iPSC in Hautzellen eine praktikable Behandlungsoption für diese Erkrankungen bieten kann. Die Genom-Editierung in somatischen Zellen und iPSCs mithilfe der CRISPR-Cas9-Technologie verändert die regenerative Medizin, indem sie personalisierte Therapien für verschiedene Krankheiten, einschließlich genetischer Hauterkrankungen, ermöglicht.

Zu den aktuellen Herausforderungen in der Gentechnik gehören Off-Target-Effekte von Geneditoren. Das Therapeutikum erfordert Geneditoren, die das interessierende Gen präzise korrigieren, ohne andere Stellen im Genom zu verändern. Unsere Herausforderung besteht darin, zu zeigen, dass Geneditoren keine unbeabsichtigten Bearbeitungen über das Zielgen hinaus vornehmen.

Das CIRCLE-seq-Protokoll ermöglicht die Identifizierung von bonafide potenziellen Off-Target-Stellen, die andere ähnliche Techniken möglicherweise übersehen würden. Eine umfassende Analyse dieser Off-Target-Stellen liefert wertvolle Einblicke in die Aktivität von Genomeditoren und erhöht die Sicherheit von Gentherapien, einschließlich unserer IPSC-basierten Therapie für Hautkrankheiten. Nachdem Sie fünf Tage lang induzierte pluripotente Stammzellen gezüchtet haben, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie sie in 10 Millilitern PBS.

Mischen Sie sechs Mikroliter Zellsuspension mit sechs Mikrolitern Trypanblau für die Zellzählung. Nach dem Zählen aliquotieren Sie zweimal mal 10 hoch sieben Zellen pro Röhrchen. Die Zellen werden bei 300 G drei Minuten lang bei 25 Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand verworfen.

Bereiten Sie das fokussierte Ultraschallgerät vor, indem Sie den Querlenker referenzieren. Füllen Sie das Reservoir mit gereinigtem, entionisiertem Wasser. Greifen Sie auf dem Laptop der Kontrollstation auf das Wasserwerk zu und klicken Sie auf Füllen, um mit dem Befüllen des Systems zu beginnen.

Stellen Sie die Temperatur auf 4,5 Grad Celsius ein. Übertragen Sie 25 Mikrogramm genomische DNA, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen isoliert wurde, in ein Mikroröhrchen. Füllen Sie das Röhrchen bis zu einem Gesamtvolumen von 130 Mikrolitern mit TE-Puffer.

Legen Sie die Bedingungen für das Scheren der DNA auf eine durchschnittliche Länge von 300 Basenpaaren, eine Dauer von 10 Sekunden, eine Spitzenleistung von 70, einen Tastfaktor von 20 und einen Burst-Zyklus von Zyklen auf 50 fest. Teilen Sie die gescherte genomische DNA in zwei Portionen zu je 65 Mikrolitern auf. Reinigen Sie die Proben mit dem 1,8-fachen Volumen der XP-Kügelchen, gefolgt von einer magnetischen Rack-Trennung.

Übertragen Sie den Überstand auf eine neue PCR-Platte und messen Sie die DNA-Menge mit einem Spektralphotometer. Zum Schluss lassen Sie einen Mikroliter der angedeuteten Schergenom-DNA auf einer Bandstation laufen. Zu Beginn resuspendieren Sie oSQT1288 und den Hairpin-Adapter auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolar in TE-Puffer.

Mischen Sie für das Adapterglühen 40 Mikroliter oSQT1288, 10 Mikroliter 10X STE und 50 Mikroliter nukleasefreies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen. Mischen Sie nach dem Adapterglühen 10 Mikroliter 5X-Ligationspuffer, fünf Mikroliter DNA-Ligase und fünf Mikroliter geglühten Haarnadeladapter. Pipettieren Sie 20 Mikroliter des Adapterligations-Mastermixes in jede eluierte DNA-Probe, die Kügelchen enthält. Legen Sie die Proben eine Stunde lang bei 20 Grad Celsius in einen Thermocycler und halten Sie sie dann unbegrenzt bei vier Grad Celsius.

Als nächstes übertragen Sie 50 Mikroliter PEG/NaCl-Sprühlösung auf die adapterligierte DNA. Reinigen Sie die Proben mit XP-Kügelchen und magnetischer Rack-Trennung. Eluieren Sie die Proben mit 30 Mikrolitern TE-Puffer pH acht und dekantieren Sie die Überstände in eine neue PCR-Platte mit halbem Rand.

Kombinieren Sie die Proben und quantifizieren Sie die DNA mit dem dsDNA BR-Assay. Um den Zirkularisierungs-Mastermix zuzubereiten, kombinieren Sie acht Mikroliter nukleasefreies Wasser, 10 Mikroliter 10X TD4 DNA-Ligase-Puffer und zwei Mikroliter T4 DNA-Ligase für ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Pipettieren Sie 20 Mikroliter des Zirkularisierungs-Mastermixes auf 80 Mikroliter 500 Nanogramm DNA, die mit Benutzer-PNK behandelt wurde.

Inkubieren Sie die Probe in einem Thermocycler bei 16 Grad Celsius für 16 Stunden. Fügen Sie am nächsten Tag 100 Mikroliter XP-Kügelchen zur zirkulierten DNA hinzu und reinigen Sie die Proben, wie zuvor gezeigt. Eluieren Sie die Probe mit 38 Mikrolitern TE-Puffer und dekantieren Sie den Überstand in eine neue PCR-Platte mit halbem Rand.

Um gereinigte zirkularisierte genomische DNA zu spalten, bereiten Sie einen In-vitro-Spaltungs-Mastermix her, indem Sie fünf Mikroliter 10X Cas9-Puffer, 4,5 Mikroliter Streptococcus pyogenes Cas9 und 1,5 Mikroliter genomische RNA für ein Gesamtvolumen von 11 Mikrolitern kombinieren. Inkubieren Sie den Dekolleté-Mastermix 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. um die Cas9 gRNA RNP-Komplexe zu bilden.

Verdünnen Sie 125 Nanogramm plasmidsicherer DNase-behandelter genomischer DNA auf ein Endvolumen von 39 Mikrolitern in nukleasefreiem Wasser. Fügen Sie dann 11 Mikroliter des Spaltungs-Mastermixes zu den 39 Mikrolitern DNA hinzu, um ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern zu erhalten. Inkubieren Sie die Mischung in einem Thermocycler eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und halten Sie sie unbegrenzt bei vier Grad Celsius.

Nach der Inkubation fügen Sie 50 Mikroliter XP-Kügelchen zu der in vitro gespaltenen DNA hinzu und reinigen Sie die DNA auf einem Magnetgestell. Eluieren Sie die gereinigte DNA in 42 Mikrolitern TE-Puffer. Für die Analyse von Next-Generation-Sequencing-Daten installieren Sie Python Version 2.7, Burrows-Wheeler Aligner und SAMtools.

Laden Sie das Referenzgenom von der angegebenen Website herunter. Definieren Sie die FASTA-Datei des Referenzgenoms, das Ausgabeverzeichnis für die Analyse und die Pfade zu den Befehlen BWA und SAMtools. Geben Sie die Zielsequenzen und die Pfade zu den demultiplexierten FASTQ-Dateien sowohl für die Nuklease-gespaltenen Proben als auch für die Kontrollproben an.

Führen Sie die standardmäßige referenzbasierte Analyse mit dem folgenden Befehl aus. Wenn Sie die vollständige Pipeline ausführen, suchen Sie die Ausgabeergebnisse der einzelnen Schritte in einem separaten Ausgabeordner, der für diesen bestimmten Schritt vorgesehen ist.