Name: Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Erfahren Sie, wie der Proximity-Liganden-Assay Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen in U2OS-Zellen visualisiert. Diese Methode ermöglicht räumlich-zeitliche Analysen für die Krebsforschung und therapeutische Entwicklung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der Proteininteraktion und -lokalisation bei DNA-Schäden

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
<li>DNA damage, aging, and cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Schwarze 384-Well-Platten</td><td>Perkin Elmer Zellträgerplatten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esel &nbsp; Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo Link Esel Anti Maus Minus</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Antikörper Verdünnungsmittel</td><td>Sigma</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Blockierungslösung 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Detektion Reagenz Far Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Esel Anti Ziege plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Esel Anti Kaninchen plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Etoposid</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti Nek4</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>SC-5517</td><td>Ziege Anti Nek4 wurde in 1:50 Verdünnung verwendet</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0,6 &Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Leica DMI Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus anti Ku70</td><td>Thermo</td><td>MA5-13110</td><td>Maus anti Ku70 wurde bei einer Verdünnung von 1:100 verwendet</td></tr><tr><td>Maus anti TOPII&beta;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Kaninchen anti Nek5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Kaninchen anti Y H2AX</td><td>Cell Signalling</td><td>9718S</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>U2OS Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

proximity-liganden-assay zur lokalisierung von proteinen in dna-schadensstellen

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

Wir haben eine Nek4-Ku70-Wechselwirkung in Abwesenheit einer Etoposidbehandlung beobachtet. Diese Wechselwirkung kann jedoch auch außerhalb des Zellkerns stattfinden (Abbildung 1A). Die Nek4-Ku70-Wechselwirkung nimmt nach DNA-Schäden zu und konzentriert sich im Zellkern (Abbildung 1A). Im Fall der Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ)-Interaktion, die in diesem Assay als Positivkontrolle auf der Grundlage von Literaturergebnissenverwendet wurde 18, wird die Interaktion durch die Etoposidbehandlung stark erhöht (Abbildung 1B).
Die Etoposid-Behandlung bewirkt einen Zuwachs von fast 40 % (durchschnittlich 9 Punkte/Zellkern in Vehikel-behandelten Zellen gegenüber 12 - 14 Punkten/Zellkern in mit Etoposid behandelten Zellen). Die Interaktion von Nek4 und Ku70 schließt DNA-Schädigungsbedingungen nicht aus. Tatsächlich zeigten Nguyen et al.12 , dass diese Proteine ohne den zellulären Stoß interagieren können und nicht von der DNA abhängig sind, was bedeutet, dass die Interaktion nicht immer an DNA-Schadensstellen stattfindet.
Die γ-H2AX-Färbung fehlt unter Kontrollbedingungen, nimmt aber nach 20 Minuten der Etoposidbehandlung zu und hält bis 3 Stunden der Behandlung an (Abbildung 1C). Einige der Wechselwirkungspunkte liegen nahe an der γ-H2AX-Färbung (Abbildung 1C). Nach 1 Stunde Behandlung sind die meisten Nek4-Ku70-Interaktionspunkte in DNA-Schadensherden konzentriert (Abbildung 1C).
Der Knockdown für Nek4 liegt bei etwa 70% (Daten nicht angegeben), was bedeutet, dass das Signal nicht vollständig eliminiert wird. Wir glauben, dass der Unterschied in der Anzahl der Punkte/Kerne nicht gleichbedeutend mit einer Proteinverarmung ist, da das erinnernde Protein für die DNA-Schadensantwort zuständig ist und dann mit Ku70 interagiert. Der Durchschnitt der Punkte/Zellkerne, die in Nek4-Knockdown-Zellen gefunden wurden, die 3 Stunden lang mit Etoposid behandelt wurden, beträgt 10, was eine Reduktion von etwa 30 % im Vergleich zu Kontroll-PLKO-Zellen unter der gleichen Bedingung bedeutet. Wenn wir bedenken, dass Etoposid die Nek4-Ku-Interaktion in 40% im Zusammenhang mit Vehikel-behandelten Zellen erhöht und wir 70% des Nek4-Knockdowns haben, weisen Knockdown-Zellen etwa 10 Punkte/Zellkern auf. Die Interaktion von Nek4 und Ku70 schließt die Reaktion auf DNA-Schäden nicht aus, und obwohl sie nach DNA-Schäden erhöht ist, liegt die größte Veränderung in der Lokalisation der Interaktion.
Die hier gezeigten Ergebnisse stellen ein wichtiges Werkzeug dar, um die Interaktion von Proteinen im Kontext der DNA-Schadensantwort zu lokalisieren. Nek4 und Ku70 wurden bereits mit DDR in Verbindung gebracht, und Nek4 scheint wichtig für die Rekrutierung von Ku70/Ku80 zu den DNA-Schadensherden12 zu sein. Die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften dieser Wechselwirkung können jedoch mit PLA gleichzeitig mit der γ-H2AX-Färbung untersucht werden.
Andere Techniken, wie z. B. Co-Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz, können ähnliche Informationen liefern, jedoch getrennt. Die Verwendung des γ-H2AX-Markers als Referenz ermöglicht eine zeitliche und räumliche Überwachung der Wechselwirkung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> Abbildung 1: Nek4 - Ku70-Interaktion unter DNA-Schädigungsbedingungen. (A) U2OS-Zellen wurden mit Etoposid (25 μM) für 20 min, 1 h und 3 h inkubiert. DMSO (0,05% für 3 h) wurde als Vehikel verwendet. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit eiskaltem Methanol fixiert, und die PLA wurde mit Ziegen-Anti-Nek4 und Maus-Anti-Ku70 als Primärantikörper durchgeführt. Der Zellkern wurde mit Hoechst 33342 angefärbt und ist blau dargestellt; PLA-Punkte werden in Rot dargestellt. Bei den Kontrollzellen handelte es sich um Zellen, die 1 h lang mit Etoposid behandelt und nur mit einem primären Antikörper (Ziegen-Anti-Nek4) und beiden Sekundärantikörpern inkubiert wurden. Die biologische Kontrolle bestand aus Nek4-Knockdown-Zellen (shRNA Nek4), die 3 h lang mit Etoposid behandelt wurden. (B) Positivkontrolle des Assays auf der Grundlage von Literaturergebnissen: U2OS-Zellen wurden 1 h lang mit 25 μM Etoposid inkubiert, und die PLA wurde mit Maus-Anti-Nek5 und Kaninchen-Anti-TOPIIβ durchgeführt. Die Grafik ist repräsentativ für ein Experiment und stellt den Durchschnitt plus Standardfehlermittelwert (REM) aller Zellen dar, die in mindestens 4 verschiedenen Feldern enthalten sind (mindestens 35 Zellen für die Kontrolle und 50 Zellen für alle anderen Bedingungen). Die Signifikanz wurde unter Verwendung des t-Tests und *: p&lt;0,05, **p&lt;0,01 und *** p&lt;0,001 im Vergleich zum DMSO-Fahrzeug ermittelt. (C) Nach PLA wurden die in (A) vorgestellten Zellen mit PBS gewaschen und mit Kaninchen-Anti-γ-H2AX-Antikörpern inkubiert. Nach 1 h Inkubation wurde der Sekundärantikörper gegen Kaninchen zum Nachweis von DNA-Schadensherden verwendet und ist grün dargestellt. Die Bereiche, die eine Co-Färbung von PLA und γ-H2AX enthalten, werden vergrößert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Ordnerstruktur. Die Bilder von Nucleus und PLA sollten in verschiedenen Ordnern abgelegt werden, wie hier gezeigt. Die Dateinamen sollten mit einem bestimmten Präfix beginnen (z. B. DAPI, PLA) und in jedem Ordner ein entsprechendes Bild haben (z. B. DAPI_control1.tif und PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Fenster Makroparameter. Nach dem Öffnen/Ausführen des Makros in ImageJ/FIJI wird der Benutzer aufgefordert, Datenordner auszuwählen und die Parameter einzugeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 1: Makrodatei, die für ImageJ erstellt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

proximity-ligand-assay-to-localize-proteins-in-dna-damage-sites

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt den Proximity-Ligation-Assay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Nematodenzellen. Die unmittelbare Nähe der interessierenden Proteine erzeugt das zirkuläre DNA-Template mit Hilfe einer PLA-Sonde, die an einen Sekundärantikörper gebunden ist. Die Sonde wird mit der Amplifikationslösung weiter amplifiziert, die eine lange einzelsträngige DNA erzeugt, gefolgt von der Hybridisierung der Detektorsonde, die die Lokalisierung von...

Proximity-Ligationsassay zur Untersuchung von In-situ-Protein-Wechselwirkungen

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

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Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

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Das Ziel dieses Protokolls ist, die Reparatur von definierten DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmid DNA zu quantifizieren. Lesioned Plasmide sind in Säugetieren Empfängerzelle Linien und niedermolekularen Gewicht geerntet mehrere Zeit Punkte nach Transfektion transfiziert. DNA Reparatur Kinetik werden quantifiziert, gefolgt von qPCR Strang-spezifische Primer-Erweiterung verwenden.

Ein einfacher, rasches und quantitativen Assay zur Maßnahme Reparatur von DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmide transfiziert in Säugerzellen

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Während Replikationsgabelkollisionen mit DNA-Addukten Doppelstrangbrüche induzieren können, ist über die Interaktion zwischen Replisomen und blockierenden Läsionen weniger bekannt. Wir haben den Proximity-Ligations-Assay verwendet, um diese Begegnungen zu visualisieren und die Konsequenzen für die Replisomenzusammensetzung zu charakterisieren.

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Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Erfahren Sie, wie der Proximity-Liganden-Assay Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen in U2OS-Zellen visualisiert. Diese Methode ermöglicht räumlich-zeitliche Analysen für die Krebsforschung und therapeutische Entwicklung.

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

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