Name: Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie CRISPR-Cas9 zur Untersuchung kompensatorischer Signalwege in Malariaparasiten eingesetzt wird. Die Studie zeigt, dass die gleichzeitige Hemmung zweier Kinasen Resistenzen verhindern kann.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Identifizierung der Neuverdrahtung von Kinasen in Malariaparasiten: Ein chemisch-genetischer Ansatz

<table><tbody><tr><td>1x Phosphatinhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST-Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall Legend Micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge ( Zum Pelletieren von Bakterienzellen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge ( Zum Pelletieren/Verarbeiten von Parasiten)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (TX-400 Rotor)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS kompetente Zellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a Kompetente Zellen</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvetten, 0,2 cm Abstand</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP Chemilumineszenz-Reagenz</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, freie Säure</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthin</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion-HD-Klonierungskit</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, dephosphoryliert</td><td>&nbsp; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nukleobond Xtra Maxi EF&nbsp; &nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel und PCR-Aufreinigung Mini-Kit</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>p-Nitrobenzylmesylat (PNBM)</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA-Polymerase</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Qiaprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL ortsgerichtetes Mutagenese-Kit</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Erststrang-Synthesekit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>Thiophosphatester-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

verständnis der entwicklung von kompensationswegen in einem mutierten malariaparasiten mit hypomorphem allel pflanzenähnlicher kinasen

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

Rekombinantes WT CDPK1 wird als Fusionsprotein mit einem N-terminalen Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag exprimiert und mittels GST-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Das gereinigte CDPK1-Protein wurde durch Western Blot unter Verwendung von Anti-CDPK1- und Anti-GST-Antikörpern nachgewiesen (Abbildung 1). Der Threonin-Gatekeeper-Rest (T145) in WT CDPK1 wurde durch Met und Ser ersetzt, wobei eine ortsgerichtete Mutagenese verwendet wurde, um CDPK1T145M bzw. CDPK1T145S mutierte rekombinante Proteine zu erzeugen (Abbildung 2). In vitro wurde ein Kinase-Assay durchgeführt, um die Kinaseaktivität aller rekombinanten CDPK1-Proteine zu bewerten. Die Kinaseaktivität wurde unter Verwendung eines halbsynthetischen Epitop-Tagging-Ansatzes34 getestet, indem die Thiophosphatestergruppe mit einem spezifischen Antikörper in einem Western-Blot-Format nachgewiesen wurde (Abbildung 3). Der Einfluss der Gatekeeper-Substitution auf die Autophosphorylierungsaktivität von CDPK1 und die Transphosphorylierung von MBP, das als exogenes Substrat von CDPK1 verwendet wird, wurde durch Quantifizierung der Intensität der jeweiligen Autophosphorylierungs- und Transphosphorylierungsbanden bewertet. Die Mutante CDPK1 mit Methionin-Gatekeeper behielt ~ 53% Transphosphorylierungsaktivität bei, während das Vorhandensein eines Serins an der Gatekeeper-Position zu einer vollständigen Aufhebung der Substrattransphosphorylierung führte (Abbildung 3). SNPs, die zu einer Gatekeeper-Substitution von Thr zu Met (T145M) führen, wurden im endogenen cdpk1-Locus durch CRISPR-Cas9 unter Verwendung eines Zwei-Plasmid-Systems modifiziert (Abbildung 4 und Abbildung 5). Mutierte Parasiten mit T145S-Substitution konnten nicht erzeugt werden, möglicherweise aufgrund der tödlichen Wirkung des Ser-Gatekeepers auf die CDPK1-Aktivität. Die CDPK1T145M mutierten Parasiten wurden unter Verwendung der limitierenden Verdünnungsmethode subkloniert, und die Gatekeeper-Substitution wurde durch Sanger-Sequenzierung bestätigt, um die Erzeugung des CDPK1T145M mutierten Parasiten zu verifizieren. Die Transkriptspiegel von 11 verschiedenen Kinasen, darunter 7 Mitglieder der CDPK-Familie und 4 weitere Kinasen, die an der späten schizogonischen Entwicklung des Parasiten beteiligt sind, wurden mittels real-time PCR getestet (Abbildung 6). Die Expressionsniveaus von 11 verschiedenen Kinasen wurden zwischen den CDPK1T145M mutierten und Wildtyp-Parasiten (WT) verglichen, normiert auf die Housekeeping-Gene. Die Transkriptexpression von Mitgliedern der CDPK-Familie war in der CDPK1T145M Mutante im Vergleich zum WT-Parasiten verändert (Abbildung 6). Transkripte, die eine höhere Expression in der CDPK1T145M Mutante zeigen, könnten die Funktion von CDPK1 im CDPK1T145M mutierten Parasiten kompensieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> Abbildung 1: Charakterisierung des rekombinanten Wildtyps (WT) PfCDPK1 in voller Länge. Das WT CDPK1-Protein in voller Länge, das mit dem N-terminalen Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag fusioniert ist, wurde mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und auf 10% SDS-PAGE abgetrennt. CDPK1 migrierte auf die vorhergesagte Molekülmasse von ~ 87 kDa, wie im Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbten Polyacrylamidgel gezeigt. Rekombinantes Protein, das auf der SDS-PAGE abgetrennt wurde, wurde auf eine PVDF-Membran übertragen und für die Western-Blot-Analyse mit Anti-CDPK1- und Anti-GST-Antikörpern verarbeitet. Mit beiden Antikörpern wurde eine Bande nachgewiesen, die der rekombinanten CDPK1 in voller Länge auf SDS-PAGE entspricht, was die Identität des Proteins bestätigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> Abbildung 2: Charakterisierung von aufgereinigten rekombinanten CDPK1-Gatekeeper-mutierten Proteinen. (A) Ausrichtung der primären Aminosäuresequenz von TgCDPK1 und PfCDPK1 (Plasmodb-Zugangs-Nr. PF3D7_0217500). Threonin an Position 145 von PfCDPK1 entspricht Glycin 128, der Gatekeeper-Position in TgCDPK1 (rot hervorgehoben). (B) Karikaturistische Darstellung des Thr-Gatekeeper-Rests (rot hervorgehoben), kodiert durch das Triplett-Codon ACC (schwarzer Kreis) in WT CDPK1. Substitution des Gatekeeper-Rests durch ortsgerichtete Mutagenese zur Erzeugung rekombinanter mutierter CDPK1-Proteine mit Met (gelb hervorgehoben) in CDPKT145M und Ser (blau hervorgehoben) in CDPKT145S. (C) SDS-PAGE-Profil von rekombinanten WT- und mutierten Proteinen von CDPK1. Die rekombinanten WT- und Gatekeeper-mutierten Proteine wurden mittels GST-Affinitätschromatographie aufgereinigt und auf SDS-PAGE getrennt. Alle rekombinanten Proteine entsprechen dem erwarteten Molekulargewicht von ~87 kDa. M- Molekulargewichtsleiter. (D) Charakterisierung von rekombinantem CDPK1 WT und mutierten Proteinen durch Western Blotting. Die rekombinanten WT- und Gatekeeper-mutierten Proteine von CDPK1 wurden auf SDS-PAGE getrennt und für das Western Blot auf die PVDF-Membran übertragen. Banden, die den rekombinanten WT- und mutierten CDPK1-Proteinen in voller Länge auf SDS-PAGE entsprechen, wurden mit anti-CDPK1- und anti-GST-Antikörpern nachgewiesen, was die Identität aller rekombinanten Proteine bestätigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> Abbildung 3: Die Gatekeeper-Substitution in CDPK1 führt zu einer Abnahme der Kinaseaktivität mutierter Enzyme. (A) Karikaturistische Darstellung des halbsynthetischen Epitop-Tagging-Ansatzes zum Nachweis der Kinaseaktivität des CDPK1-Proteins. Hier wird nur die Transphosphorylierungsaktivität dargestellt. Das CDPK1-Protein thiophosphoryliert ein exogenes Substrat (S, festes grünes Quadrat) in Gegenwart von ATPγS (festes gelbes Dreieck), einer Quelle der übertragbaren terminalen Thiophosphatgruppe). Der thiophosphorylierte Rückstand wird durch Behandlung mit p-Nitrobenzylmesylat (PNBM) alkyliert, wobei ein Thiophosphatester gebildet wird, der dann mit einem Antikörper nachgewiesen wird, der spezifisch alkyliertes Thiophosphataddukt erkennt. (B) Ein In-vitro-Kinase-Aktivitätsassay unter Verwendung eines halbsynthetischen Epitop-Tagging-Ansatzes wurde verwendet, um die Wirkung der Gatekeeper-Substitution auf das Autophosphorylierungs- und Transphosphorylierungspotenzial von rekombinanten CDPK1-mutierten Proteinen zu testen. Alle rekombinanten Proteine weisen eine calciumabhängige Kinaseaktivität auf. Die Autophosphorylierung von CDPK1 und die Transphosphorylierung des Myelin-Basisproteins (MBP), eines exogenen Substrats, war nur in Gegenwart von Calciumchlorid (Ca2+) nachweisbar, während in Gegenwart von EGTA, einem spezifischen Chelator von Ca2+ -Ionen, keine Phosphorylierung nachgewiesen wurde. Die Gatekeeper-Mutanten zeigen eine verminderte Autophosphorylierungsaktivität, während die Transphosphorylierung von MBP in CDPK1T145S vollständig aufgehoben wurde. CDPK1T145M behält das Transphosphorylierungspotenzial (~ 53 %) bei, wie bereits berichtet32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> Abbildung 4: Konstruktion von Plasmiden zur Einführung von SNPs an der Gatekeeper-Position im cdpk1-Locus mit Hilfe von CRISPR-Cas9. Eine Leitsequenz von 20 Nukleotiden, die 432 bis 451 bp entsprechen, wurde in der BtgZI-Restriktionsstelle im pL6eGFP-Plasmid kloniert, um pL6CK1G zu erzeugen. Ein Homologiearm (421 bp), der die gewünschten SNPs (T145M oder T145S, entsprechendes Codon in grün dargestellt) zusammen mit Schildmutationen (rot dargestellt) enthielt, wurde in pL6CK1G innerhalb der AflII- und SpeI-Restriktionsenzymstellen kloniert, um pL6CK1GT145M bzw. pL6CK1GT145M zu erzeugen. Schildmutationen verhindern das erneute Schneiden des modifizierten Locus nach der gewünschten Bearbeitung. Die Cas9-Endonuklease, die in einem zweiten Plasmid, pUF1, kodiert ist, wird mit Hilfe von Guide-RNA, die vom pL6CK1GT145M/S-Plasmid exprimiert wird, an die Zielstelle innerhalb des cdpk1-Locus gerichtet. Cas9 führt zu einem Doppelstrangbruch an der Zielstelle in Richtung der 5'-Seite der PAM-Sequenz. Das DSB wird mit Hilfe eines Homologiearms im pL6CK1GT145M/S Plasmid repariert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> Abbildung 5: Schematische Darstellung von P. falciparum-Transfektion mit CRISPR-Plasmiden zur Einführung der Gatekeeper-Mutation (T145M) im cdpk1-Locus . i) Asynchrones P. Die Falciparum-Kultur wird mit Sorbit behandelt, um synchronisierte Parasiten im Ringstadium zu erhalten. ii) Synchronisierte Ringstadien-Parasiten werden in einer Elektroporationsküvette zusammen mit pL6CK1GT145M/S und pUF1-Plasmiden, die in Pufferlösung resuspendiert werden, entnommen. iii) Die Parasiten werden mit 310 Volt, 950 μF und unendlichem Widerstand elektroporiert. iv) Nach der Transfektion werden die Parasiten in einen T25-Kolben mit frischem vollständigem RPMI-Medium (cRPMI) überführt und 48 Stunden lang kultiviert. Nach 48 h werden die transfizierten Parasiten auf cRPMI umgestellt, ergänzt mit den Medikamenten WR99210 und DSM267, und im T75-Kolben expandiert. v) Am 14. Tag werden die Objektträger vorbereitet und mit Giemsa-Beize gefärbt. vi) Anschließend wird der Blutausstrich unter einem Lichtmikroskop sichtbar gemacht, um das Vorhandensein von parasitierten Erythrozyten zu beurteilen. vii) Bei der Visualisierung werden die Parasiten in Gegenwart von Medikamenten wachsen gelassen. Anschließend werden die Parasiten verarbeitet, um das Template für die PCR und DNA-Sequenzierung zur Verifizierung der gewünschten Modifikation des cdpk1-Ziellocus zu erhalten. viii) Nach der Verifizierung werden klonale transgene Parasiten erhalten, indem die begrenzende Verdünnung in einer 96-Well-Platte eingerichtet wird. ix) Klonale transgene Parasiten aus positiven Vertiefungen werden in T25-Kolben überführt und wachsen gelassen. x) Klonale transgene Parasiten werden durch PCR und das Vorhandensein der gewünschten SNPs an der Gatekeeper-Position durch DNA-Sequenzierung und Analyse des Chromatogramms weiter validiert. Die Zahl ist von32 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> Abbildung 6: Schematische Darstellung der Schritte, die für die Transkriptanalyse von Zielgenen mittels Echtzeit-PCR (RT-PCR) verwendet werden. Die Falciparum-Kultur mit überwiegend reifen Parasiten im Schizontenstadium wird durch Sorbitbehandlung im selben Zyklus gewonnen. ii) Die Parasiten werden schonend auf einem Gradienten von 70/40 Percoll/Sorbit in einem konischen 15-ml-Röhrchen geschichtet, um die Parasiten im reifen Schizontenstadium anzureichern. iii) Der schwarz gefärbte Ring an der Interphase von 40 % und 70 % persönlichem/Sorbit wird auf ein frisches 50-ml-Röhrchen übertragen, verarbeitet und in cRPMI resuspendiert. Die mit Schizonten angereicherten Parasiten werden mit frischen Erythrozyten inkubiert, die bei 37 °C für die Invasion vorinkubiert werden. iv) Die Parasiten werden 4 h lang kultiviert und dann mit 5 % Sorbit behandelt, um hochsynchronisierte Parasiten im Ringstadium von 0-4 h zu erhalten. v) Die Parasiten werden für weitere 44 Stunden nach der Sorbitbehandlung weiter kultiviert, um hochsynchronisierte Parasiten im Schizontenstadium von 44 bis 48 Stunden zu erhalten. vi) Die synchronisierten Parasiten werden mit Saponin behandelt, um sie aus den Erythrozyten freizusetzen, und in RNA-Extraktionsreagenz gelagert. Die Gesamt-RNA wird aus der RNA-Extraktion von resuspendierten Parasiten isoliert. vii) cDNA wird aus der isolierten RNA hergestellt. viii) Es wird ein real-time PCR-Experiment mit dem cDNA-Template aufgebaut, um die Zielgene mit genspezifischen Primern zu amplifizieren. Die Platte wird auf einem real-time PCR-System ausgeführt. ix) Die Transkriptexpressionsdaten werden mit einer Analysesoftware analysiert. Das Diagramm zeigt die differentiellen Transkriptexpressionsniveaus von 11 Kinasen in CDPK1 T145M-Parasiten im Vergleich zum Wildtyp (WT). Diese Zahl ist modifiziert von32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name des Gens</td>
			<td colspan="4">Sequenz der Grundierung</td>
		</tr><tr><td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATCAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr><tr><td>ck1f1 </td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr><tr><td>ck1r3wt</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Liste der in der Studie verwendeten Primer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name des Gens</td>
			<td colspan="2">Vorwärts-Grundierung</td>
			<td colspan="2">Umgekehrte Grundierung</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAATAATATATCTATCG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC</td>
		</tr><tr><td>PKA (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr><tr><td>PKG (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr><tr><td>PI3K (PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Liste der Zielgene (PlasmoDB-Identifikationsnummer) zusammen mit der Sequenz der Primer, die für die Echtzeit-PCR-Analyse verwendet wurden.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more ...

understanding-development-compensatory-pathways-mutant-malaria

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Interview, konzentriert sich George Dimopoulos auf die physiologischen Mechanismen von Mücken verwendet werden, um Plasmodium falciparum und Dengue-Virus-Infektionen zu bekämpfen. Erklärung dafür, wie Schlüssel feuerfesten Gene gegeben ist, sind die Gene, die Resistenz gegen Pathogene Vektor, in der Mücke identifiziert und wie dieses Wissen genutzt, um transgene Moskitos, die nicht in der Lage, die Malaria-Parasiten oder Dengue-Virus in sich tragen sind zu generieren.

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos

Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen...

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Hier präsentieren wir einen systematischen Ansatz für die Entwicklung physiologisch relevant, sensitive und...

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Humane microRNAs translozieren von Wirts-Erythrozyten zu Plasmodium falciparum-Parasiten. Im Folgenden werden die Techniken beschrieben, mit denen synthetische microRNAs in Erythrozyten des Wirts transfiziert und alle RNAs aus P. falciparum isoliert werden.  Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von Polysomen in P. falciparum beschrieben, um die ribosomale Belegung und das translationale Potenzial von Parasitentranskripten zu bestimmen.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Auf subzellulärer Ebene werden Signalereignisse dynamisch durch Entwicklungs- und Umwelteinflüsse moduliert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das transiente Expressionssystem Tabak verwendet, um die dynamische Protein-Protein-Interaktion zu überwachen und die räumliche Organisation der Signaltransduktion in Pflanzenzellen aufzudecken.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Dieses Protokoll beschreibt eine optogenetische Strategie zur Modulation der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) Aktivität während der Zelldifferenzierung und der Xenopus embryonalen Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die reversible Aktivierung des MAPK-Signalwegs in der Säugerzellkultur und in multizellulären Lebendorganismen wie Xenopus- Embryonen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in Plasmodium Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

In diesem Artikel haben wir eine Reihe praktischer und praktikabler Methoden zur Charakterisierung krankheitsbedingter Mutanten von KI-Familienkinasen vorgestellt, die In-vitro-Kinase-Assay, RAF-Koaktivierungstest und komplementärer Split-Luziferase-Assay umfassen.

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das Leishmania major promastigotes verwendet, um die Bindung, Zytotoxizität und Signalisierung zu bestimmen, die durch porenbildende Toxine induziert werden. Ein Proof-of-Concept mit Streptolysin O wird bereitgestellt. Andere Toxine können auch verwendet werden, um die in L. major verfügbaren genetischen Mutanten zu nutzen, um neue Mechanismen der Toxinresistenz zu definieren.

Entschlüsselung des molekularen Mechanismus und der Funktion von porenbildenden Toxinen mit Leishmania major

Erfahren Sie, wie CRISPR-Cas9 zur Untersuchung kompensatorischer Signalwege in Malariaparasiten eingesetzt wird. Die Studie zeigt, dass die gleichzeitige Hemmung zweier Kinasen Resistenzen verhindern kann.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen (Video) | JoVE Journal

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Weitere Videos entdecken