Name: NMR 15N-Relaxationsexperimente zur Untersuchung der Strukturdynamik von Proteinen in Pikosesekunden bis Nanosekunden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Lernen Sie NMR-Relaxationsexperimente zur Analyse der Strukturdynamik von Proteinen im Pikosekunden- bis Nanosekundenbereich. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung intrinsisch ungeordneter Proteine und ihrer molekularen Funktionen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protokoll für NMR 15N-Relaxations- und hetNOE-Experimente in der Proteindynamik-Studie

Dieses Protokoll beschrieb den Aufbau von NMR 15N-Relaxationsexperimenten von Lakomek et al.69 und Stief et al.70. Wir konzentrierten uns auf NMR-Pulssequenzen unter Verwendung eines empfindlichkeitsverstärkten HSQC-Detektionsschemas. Die 15N R1 und R1ρ Experimente werden wie von Stief et al.70 ausführlich beschrieben durchgeführt, und das hetNOE-Experiment wird von Lakomek et al.69 beschrieben.
Beim Aufbau der NMR-Relaxationsexperimente ist der 15N R1ρ der kritischste, da die Wahl einer zu langen maximalen Relaxationsperiode oder einer zu hohen HF-Amplitude des Spin-Locks die Sonde beschädigen kann. Für die Relaxationsphase ist es wünschenswert, die gesamte Abklingkurve gleichmäßig von 100 % Intensität bis 25 % Intensität (im Vergleich zum Referenzexperiment) abzutasten. Bei langsam entspannenden Proteinen, wie z.B. IDPs, mit langen 15N T2-fachen ist es häufig nicht erschwinglich, die Zerfallskurve in vollem Umfang zu beproben, da die Leistungsabgabe in die Sonde begrenzt werden muss.
Für die Radiofrequenz (HF)-Amplitude von 15N gilt theoretisch: Je höher dieHF-Amplitude, ν Spin-Lock, desto besser, da mehr Austauschprozesse refokussiert werden können. Als Faustregel gilt, dass Austauschprozesse, die langsamer als 1 / (2π νSpin-Lock ) sind, refokussiert werden können. Es gelten jedoch Einschränkungen bei der HF-Leistung. In unserer Hand würden wir beispielsweise eine maximale Spin-Lock-Periode von 65 ms nicht überschreiten, wenn eine HF-Amplitude von 2 kHz angelegt wird, um auf der sicheren Seite zu bleiben. Gleichzeitig sollte die Spin-Lock-HF-Amplitude an einem 600 MHz Spektrometer höher als 1 kHz sein, z.B. 1,4 kHz bei 600 MHz, was sich für das kleine globuläre Protein gb369 als ausreichend erwiesen hat. Um die spektralen Breiten abzudecken und Off-Resonanz-Effekte bei höheren Feldstärken zu vermeiden, sollte die entsprechende HF-Amplitude mit dem Magnetfeld skalieren, z.B. 1,5-mal höher bei 900 MHz (νSpin-Lock <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2 kHz). Er muss jedoch innerhalb der Grenzen der Sonde bleiben. (Beziehen Sie sich auf die lokale Liste der Leistungsbeschränkungen des Spektrometers und wenden Sie sich an Ihren NMR-Einrichtungsleiter, um Rat zu erhalten.)
Für die Wahl des Abstands der Relaxationsverzögerungen zwischen dem Referenzexperiment (kurzgeschlossene Verzögerung) und der längsten Verzögerungszeit (bestimmt durch die oben diskutierten Faktoren) bevorzugen wir einen gleichen Abstand der Datenpunkte der Relaxationsverzögerung und wählen eine Zahl von 8 (wenn die zugewiesene Messzeit und das Signal-Rausch-Verhältnis dies zulassen). Das erste Inkrement (und die folgenden) werden von den intensivsten (und oft am langsamsten entspannenden) Resten dominiert. Abhängig vom Dynamikbereich des Proteins können daher die NMR-Signale mehrerer Reste in der Proteinsequenz nach der gewählten maximalen Relaxationsphase bereits zerfallen sein. Durch den gleichmäßigen Abstand der Verzögerungspunkte stellen wir sicher, dass die Relaxationskurven der schnell entspannenden Reste auch durch eine ausreichende Anzahl von Datenpunkten abgedeckt werden, die die Relaxationskurve abtasten.
Außerdem ist eine gute Wahl der Wiederherstellungsverzögerung unerlässlich, um genaue Relaxationsdaten zu erhalten und langfristige Schäden an der Sonde zu vermeiden. Wir wählen eine Wiederherstellungsverzögerung von mindestens D1 = 2 s, um Schäden an der Sonde zu vermeiden. Für genaue Ergebnisse muss auch der longitudinalen Polarisation der Proteine 1H und 15N ausreichend Zeit gegeben werden, um ins Gleichgewicht oder zumindest in einen stabilen, stationären Zustand zurückzukehren. Der 1H T1 variiert in der Regel zwischen 1 s und 4 s bei 600 MHz für ein kleines oder mittelgroßes Protein (bis zu 20 kDa); bei größeren Proteinen und höheren Feldern steigt der 1H T1 weiter an. Für das kleine globuläre Protein gb3 fanden wir D1 = 3,5 s ausreichend für die 15N R1 und R1ρ Experimente. Für den kleinen IDP Syb-2, der in diesem Protokoll vorgestellt wird, haben wir kürzlich gezeigt, dass D1 = 2 sausreichend 70 ist.
Der 15N hetNOE hat die geringste Empfindlichkeit, da die Anregung bei 15N beginnt und am Anfang der Pulssequenz kein 1 H-15N INEPT angelegt wird. Ferner sollte die Sättigungsperiode von 1Stunde und die Erholungsverzögerung von 15N 5 mal 15N T1 betragen, um genaue Daten zu erhalten. Während für das hier vorgestellte IDP Syb-2 eine Sättigungs-/Erholungsverzögerung von 5 s plus eine zusätzliche D1-Erholungsverzögerung von 2 s (insgesamt 7 s) ausreichend war, kann diese Zeit für größere Proteine und/oder deuterierte Proteine wesentlich länger sein, z. B. 10 s oder länger. Wenn die qualitativen Daten jedoch gut genug sind, kann ein leichter systematischer Ausgleich akzeptiert werden. In diesem Fall können bereits bei 3 mal 15N T1 vernünftige Ergebnisse erzielt werden, da 95% der Sättigung erreicht werden. In diesem Fall zeigen die resultierenden hetNOE-Werte einen systematischen Offset zu höheren Werten.
In diesem Protokoll haben wir mit vollprotoniertem 15N Syb-2 gearbeitet, was am kostengünstigsten ist. Die Seitenkettendeuterierung wird empfohlen, um die Anzahl der Relaxationswege zu reduzieren und mit den am stärksten isolierten 1 H-15N Rückgrat-Amid-Spinpaaren zu arbeiten. Beim Vergleich von 15N2H Syb-2 und 15N syb-2 stellen wir jedoch nur sehr geringe Unterschiede zwischen deuterierten und vollprotonierten Probenfest 70. Aus praktischen Gründen werden NMR-Relaxationsdaten häufig an den doppelt oder dreifach markierten Proben (15N13C oder 2H15N13C) aufgezeichnet. Die diskutierten NMR-Pulssequenzen sind in der Lage, die Entwicklung der J-Kopplung zwischen 13C und 1H- oder 15N-Kernen neu zu fokussieren. Offensichtlich nehmen auch die Relaxationswege zu, wenn die 13-C-Markierungeingeführt wird. In unseren Händen liegt der eingebrachte Fehler, wenn überhaupt, jedoch in unserer Praxis bei weniger als 5 % und könnte akzeptabel sein, wenn nur qualitative Daten benötigt werden.
Bei der Arbeit mit Proteinen unterschiedlicher Größe für den Nachweis stellt sich häufig die Frage, ob man sensitivitätsverstärkte HSQC-detektierte Experimente70 oder TROSY-detektierte Experimente69 wählen soll. Für kleine Proteine bieten die empfindlichkeitsverstärkten HSQC-detektierten NMR-Experimente eine zweifache Verstärkung des Signal-Rausch-Verhältnisses (vorausgesetzt, es kann eine gute Wasserunterdrückung erreicht werden). Bei größeren Proteinen werden sich die von TROSY detektierten Experimente durchsetzen. Der Break-Even liegt bei etwa 20 kDa für gefaltete Proteine. Bei IDPs, für die niedrigeR2-Geschwindigkeitskonstanten erhalten werden können, die mit zunehmender Kettenlänge ungefähr linear ansteigen, kann der Break-Even auf höhere Molekulargewichte verschoben werden. Für praktische Zwecke empfehlen wir, im Zweifelsfall sowohl die sensitivitätsverstärkten HSQC-detektierten als auch die TROSY-detektierten Experimente durchzuführen. Wählen Sie dann dasjenige aus, das im ersten Inkrement das beste Signal-Rausch-Verhältnis bietet.
Die Diskussion, ob man sich für die sensitivitätsverstärkten HSQC-detektierten oder TROSY-detektierten Experimente entscheiden sollte, gilt nur, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis das Hauptkriterium ist. Wenn kleinste Strichstärken und höchste Auflösungen gefragt sind, gewinnt TROSY immer. TROSY bietet zudem immer die beste Wasserunterdrückung, da weniger Protonenpulse und keine Protonenentkopplung erforderlich sind. Für eine ausführlichere Diskussion verweisen wir auf den bereits veröffentlichten Artikel69 .
Noch eine Bemerkung zum Thema Wasserunterdrückung. Während bei Bruker Avance NEO-Konsolen die Einstellung des Empfänger-Gain (rg) auf 16 ausreichend sein kann, ist bei (älteren) Bruker Avance-Konsolen in der Regel ein Empfänger-Gain im Bereich von 128-256 wünschenswert. Der erreichbare rg (bestimmt durch den Bruker-Befehl rga) wird häufig aus der Intensität des Restwassersignals zum Geräuschpegel ermittelt. Eine schlechte Wasserunterdrückung führt immer zu zusätzlichem Rauschen in den Spektren. Selbst wenn also auf einer Bruker Avance NEO-Konsole ein rg = 16 erreicht werden kann, kann das verbleibende Wassersignal erheblich zum Geräuschpegel beitragen. Dadurch würde das Signal-Rausch-Verhältnis reduziert. Daher empfehlen wir, ein rg-Niveau von 128-256 anzustreben. Die vorgestellten Pulssequenzen70 wurden bei 600 MHz und 1200 MHz getestet. Beide Feldstärken arbeiten mit dem gleichen Gradienten-Setup, wie es in der Pulssequenz geschrieben ist. Wir empfehlen sie zumindest als guten Ausgangspunkt für weitere Optimierungen.
Wie in der Einleitung erwähnt, decken die diskutierten NMR-Relaxationsexperimente nur den Zeitbereich von Pikosekunden bis Nanosekunden ab. Für Einblicke in die Dynamik von Mikrosekunden bis Millisekunden verweisen wir auf Relaxationsdispersionsexperimente, CPMG-Experimente und eine Erweiterung derR1ρ-Experimente mit sich ändernden Spin-Lock-Amplituden (oder Trägerfrequenzen) 44,46,58,59,60,61,85,86 . Dynamiken, die langsamer als Mikrosekunden sind, können 15N CEST (Chemical Exchange Saturation Transfer), NMR62, Austauschspektroskopie (EXSY, Millisekunden bis Sekunden) oder RT (Real-time) NMR (Sekunden bis Stunden)63,64 erfasst werden. Der PRE-Effekt (paramagnetic relaxation enhancement) von paramagnetischen Sonden sowie von residualen dipolaren Kopplungen (RDCs) kann verwendet werden, um den gesamten Bereich der ps- bis ms-Dynamik 65,66,67,68 zu beurteilen.
Alle diese Experimente decken nur die Dynamik des Rückgrats ab. Um die Seitenkettendynamik zu untersuchen, führten Kay und seine Mitarbeiter eine weitere Fülle von NMR-Experimenten ein, die Informationen über die Seitenkettendynamik von Proteinen bis zu 1 MDalieferten 2,87.
Um genauere quantitative Einblicke in die Dynamik des Proteinrückgrats zu erhalten, ist eine kombinierte Analyse aller drei NMR-Parameter, 15N,R1,R2 und hetNOE, notwendig - manchmal unter Einbeziehung noch weiterer Parameter, wie z.B. kreuzkorrelierter Relaxationsgeschwindigkeitskonstanten. Es wurden verschiedene ausgefeilte Analysemethoden entwickelt. Der sogenannte modellfreie Ansatz ist in der biomolekularen NMR weit verbreitet 43,88,89,90,91. Auch die Kartierung der spektralen Dichte kann wertvolle Erkenntnisse liefern 55,92,93. Während es sich hierbei um leistungsfähige Analysemethoden für globuläre Proteine mit genau definierter Rotationskorrelationszeit handelt, ist ihre Anwendbarkeit für IDPs begrenzt. Ein gefalteter Bereich ist notwendig, um eine Rotationskorrelationszeit39 zu definieren. Dies kann teilweise umgangen werden, wenn die Korrelationsfunktion C(t) durch die Summe exponentiell zerfallender Funktionen modelliert werden kann, falls die verschiedenen beteiligten Zeitskalen gut getrennt werden können 23,31,84. In Ermangelung einer klar definierten Rotationskorrelationszeit sind alternative Ansätze mit einer Verteilung von Korrelationszeiten, z. B. die IMPACT-Analyse94 oder die DETECTOR-Analyse 95,96, eine Alternative. Darüber hinaus ist eine kombinierte Analyse von NMR-Relaxationsdaten und MD-Simulationen auch für IDPs97 vielversprechend; Derzeit sind wir immer noch mit Einschränkungen bei der Abtastung und Kraftfeldeinschränkungen für Vollatomsimulationen von größeren IDPskonfrontiert 31,98.

<table><tbody><tr><td>Bruker 600 MHz AVANCE III HD Spektrometer&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html</td><td>durchgeführte NMR-Experimente&nbsp;</td></tr></tbody></table>

nmr 15n-relaxationsexperimente zur untersuchung der strukturdynamik von proteinen in pikosesekunden bis nanosekunden

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

NMR 15N-Relaxationsexperimente zur Untersuchung der Strukturdynamik von Proteinen in Pikosesekunden bis Nanosekunden

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

nmr-15n-relaxation-experiments-for-investigation-picosecond-to

Research

Forschung

JoVE Journal

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