Name: Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Erfahren Sie eine robuste Methode zur Isolierung hochwertiger Mitochondrien aus Herzgewebe von Nagetieren. Diese Technik ermöglicht präzise Analysen mitochondrialer Funktion und Bioenergetik für biomedizinische Forschung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Mitochondriale Isolierung von Nagetieren für qualitativ hochwertige bioenergetische Studien

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation%3A+Ii.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Ernster, L., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: A historical review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+tca+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation%2C+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+metabolism%3A+Glycolysis%2C+the+TCA+cycle+and+mitochondrial+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).</li>
<li>Kalpage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+C+phosphorylation%3A+Control+of+mitochondrial+electron+transport+chain+flux+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).</li>
<li>Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).</li>
<li>Mitchell, P., Moyle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiosmotic+hypothesis+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+heart+disease%3A+Critical+appraisal+of+an+overlooked+association%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association.</a> Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).</li>
<li>Zhou, B., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+pathophysiology+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure.</a> J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).</li>
<li>Holzem, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+not+different+between+nonfailing+donor+and+end-stage+failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts.</a> FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).</li>
<li>Cordero-Reyes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+isolated+mitochondria+from+failing+human+hearts+exhibit+preserved+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function.</a> J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).</li>
<li>Norat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+Exploring+mitochondrial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation.</a> NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).</li>
<li>Diaz-Vegas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+mitochondrial+dysfunction+a+common+root+of+noncommunicable+chronic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases.</a> Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+subsarcolemmal+and+interfibrillar+mitochondria+display+distinct+responsiveness+to+protection+by+diazoxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide.</a> PLoS One. 7 (9), e44667(2012).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+Functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Micakovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pure+mitochondria+from+rat+kidneys+and+western+blot+of+mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Hubbard, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+mitochondrial+magnetic+separation+for+isolation+of+synaptic+mitochondria+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue.</a> Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+mitochondrial+isolation+and+sub-cellular+localization+assay+for+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).</li>
<li>Hernandez-Camacho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+mouse+skeletal+muscle+for+respirometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays.</a> J Vis Exp. (180), e63336(2022).</li>
<li>Farrugia, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+and+parallel+isolation+of+myocytes+and+non-myocytes+from+multiple+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).</li>
<li>Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+respiration+buffer+composition+on+mitochondrial+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function.</a> PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).</li>
<li>Vinnakota, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-loop+control+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+and+cardiac+muscle+mitochondria+by+ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2).</a> Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).</li>
<li>Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+and+time+hierarchy+of+oxidative+phosphorylation+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria.</a> Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).</li>
<li>Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarnock%2C+LB+%22Statpearls%22">Statpearls</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).</li>
<li>Sercel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+stable+isolated+mitochondrial+recipient+clones+in+mammalian+cells+using+mitopunch+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> J Vis Exp. (97), e52076(2015).</li>
<li>Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+bubble+contact+with+endothelial+cells+causes+a+calcium-independent+loss+in+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential.</a> PLoS One. 7 (10), e47254(2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+of+citrate+synthase+activity+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (155), e59454(2020).</li>
<li>Tomar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-dependent+differential+regulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+the+heart+and+kidney+cortex+and+outer+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).</li>
<li>Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affinity+for+ADP+is+twofold+lower+in+creatine+kinase+knock-out+muscles.+Possible+role+in+rescuing+cellular+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis.</a> FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).</li>
<li>Gouspillou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+the+oxidative+phosphorylation+affinity+for+ADP+in+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (6), e20709(2011).</li>
<li>Strubbe-Rivera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+phenomenon+elucidated+by+cryo-em+reveals+the+genuine+impact+of+calcium+overload+on+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function.</a> Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functions+of+cytochrome+C+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease.</a> Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+bcl-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members.</a> Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).</li>
<li>Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+control+of+oxidative+phosphorylation%3A+Multiple+roles+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate.</a> J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).</li>
<li>Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glycolysis+and+mitochondrial+function+in+endothelial+cells+using+the+seahorse+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer.</a> Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).</li>
<li>Huerta, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+lamprey+cardiac+mitochondrial+bioenergetics+after+exposure+to+TFM+and+its+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites.</a> Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).</li>
<li>Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+precipitation+inhibits+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism.</a> PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL Glasbecher</td><td></td><td></td><td>Für Organdissektion und Zerkleinerung</td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td>Zentrifugation</td></tr><tr><td>Adenosin 5'-Diphosphat Monokaliumsalz</td><td>Dihydrat Sigma&nbsp;</td><td>A5285</td><td>Respirometrie-Assays</td></tr><tr><td>BSA-Protein-Assay-Kit</td><td>Thermo Scentific</td><td>PI23225</td><td>Quantifizierung mitochondrialer Proteine</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DX0145</td><td>Für Puffer (CB)</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E4378</td><td>Für Puffer (CB und IB) und Respirometrie-Assays</td></tr><tr><td>Glaskanüle</td><td>Radnoti</td><td></td><td>Meerschweinchen- und Rattenherzperfusion</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Schweineschleimhaut</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>SRE0027-250KU IP-Injektion</td><td>für Tiere</td></tr><tr><td>Hochauflösendes Respirometer</td><td></td><td></td><td>Clark-Elektrode; Oxygraph mit 2 mL-Kammern</td></tr><tr><td>Induktionskammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>792632</td><td>Anästhetikum&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Apfelsäure</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>02288-50G</td><td>Respirometrie-Assays</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M9272</td><td>Für Puffer (RB)</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>MX0214</td><td>Für Puffer (IB)</td></tr><tr><td>Mikroliter-Spritzen</td><td></td><td></td><td>Größen ab 5&ndash; 50 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td></td><td></td><td>Muss in der Lage sein, bei 37 μg zu inkubieren; C&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>475898</td><td>Für alle Puffer</td></tr><tr><td>O2 Tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMNI THQ Homogenisator</td><td>OMNI International&nbsp;</td><td>12-500</td><td>Ähnliche Rotor-Stator-Homogenisatoren funktionieren</td></tr><tr><td>mit Pipetten</td><td></td><td></td><td>Volumina von&nbsp; 2&ndash; 20 & Mikro; L; 20&ndash; 200 & Mikro; L; 200&ndash; 1000 &Mikro; L</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Für Puffer (RB und CB)</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496</td><td>Für Puffer (IB und RB)</td></tr><tr><td>Protease aus Bacillus licheniformis</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5459</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S9888</td><td>Für Puffer (CB)</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP356-100</td><td>Respirometrie-Assays</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8510-OP</td><td>Für Puffer (IB)</td></tr><tr><td>Chirurgisches Dissektionsset</td><td></td><td></td><td>Abhängig von Tier- und Gewebequelle</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td></td><td></td><td>Muss auf 4 & Grad abkühlen; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

robuste mitochondriale isolierung aus herzgewebe von nagetieren 

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Nach Abschluss der mitochondrialen Isolierung sollte die Qualität und Funktionalität der Isolate durch Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs (JO2) mittels hochauflösender Respirometrie getestet werden. Zu diesem Zweck wurden die mitochondrialen Stämme auf 40 mg/ml verdünnt, um Arbeitskonzentrationen von 0,1 mg/ml in 2 ml RB für alle Respirometrie-Assays mit isolierten kardialen Mitochondrien zu ermöglichen. Die Atmung wurde durch 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat in Gegenwart von 1 mM EGTA, einem Calciumchelator, angeheizt und 5 Minuten lang ausgeglichen, um die Atmung des Zustands 2 zu etablieren. Während dieses Zustands sollte der Sauerstoffverbrauch durchschnittlich 45-55 pmol/ml/s oder 27-33 nmol/mg/min betragen. Achten Sie auf den elektrodenabhängigen Sauerstoffverbrauch und führen Sie bei Bedarf die entsprechenden Hintergrundkorrekturen durch. Die oxidative Phosphorylierung (Zustand 3) wird bei der 5-Minuten-Marke durch einen Bolus von 500 μM ADP eingeleitet. Die Substratzugabe und die repräsentative Nachzeichnung sind in Abbildung 1 dargestellt. Funktionelle Mitochondrien haben nach der Zugabe von ADP einen sofortigen Anstieg von JO2 , der je nach Gewebequelle variiert, wie in Abbildung 2 gezeigt. Ohne die Verwendung von EGTA hat Restcalcium unterschiedliche Auswirkungen auf die maximalen Raten von JO2 während OXPHOS, abhängig von der mitochondrialen Konzentration, der Substratverfügbarkeit und anderen Umweltfaktoren. Die Zusammensetzung des Puffers ist wichtig für die Erhaltung der Integrität und Funktionalität der mitochondrialen Membran. Alle Pufferrezepte, die in dem Protokoll erwähnt werden, sind in Tabelle 1 weiter detailliert beschrieben und können für alle hierin beschriebenen mitochondrialen Zubereitungen verwendet werden.
Eine erfolgreiche Isolierung von Mitochondrien wird durch die Ermittlung von RCR-Werten gekennzeichnet, die innerhalb des gegebenen Bereichs für jede Spezies und Gewebequelle liegen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Basierend auf den mit diesem Protokoll gesammelten Daten sollten bei der Isolierung von Herzmitochondrien aus Meerschweinchen, Ratten oder Mäusen die RCRs ≥16, ≥8 bzw. ≥5 betragen. Bei der Isolierung aus Rattenleber oder -niere sollten die RCRs ≥6 betragen, während RCRs aus Zellen als akzeptabel angesehen werden, wenn sie über 3,8 liegen. Wenn die RCR-Werte unter diese Bereiche fallen oder wenn es qualitative Unterschiede in den Respirometrie-Tracings gibt, wird empfohlen, einen zusätzlichen Assay mit neuen RB und Substraten durchzuführen, um Probleme durch Kontamination auszuschließen. Obwohl die 1-1/RCR-Transformation Werte zwischen 0 und 1 begrenzt, wird diese Metrik beim Vergleich der mitochondrialen Qualität zwischen Geschlechtern oder Spezies nicht empfohlen, wenn der RCR-Wert größer als 10 ist. Aus diesem Grund wurden bei allen Experimenten die Standard-RCR-Werte (Zustand 3/Zustand 2 oder OXPHOS/LEAK) quantifiziert. Informationen zu Modulationen, die an diesem Protokoll vorgenommen werden können, um Mitochondrien aus Herzen, Leber, Nieren und Zellen von Mäusen besser zu isolieren, sind in Tabelle 3 aufgeführt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig01.jpg"> Abbildung 1: Regions of Interest für Qualitätskontrollkontrollen mittels hochauflösender Respirometrie. Die Atemkammern wurden mit 2 mL RB beladen und bei 37 °C äquilibriert, bis die Rate des Sauerstoffverbrauchs nahe 0 lag. Nach der Äquilibrierung wurde 1 mM EGTA, ein Calciumchelator, zusammen mit 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat zugegeben. Nach der Zugabe dieser Substrate wurden Mitochondrien in der gewünschten Arbeitskonzentration (0,1 mg/ml) zugegeben und 5 Minuten lang atmen gelassen, um die Atmung des Zustands 2 (gelb) zu erreichen. Nach 5 Minuten wurden 500 μM ADP hinzugefügt, um die Atmung in Zustand 3 zu initiieren (rot). Die RCRs wurden durch Zeitmittelung der durch die roten und gelben Felder gekennzeichneten Sauerstoffverbrauchsraten bestimmt, um den Zustand 3 mit dem Zustand 2 zu vergleichen. Zustand 4 wird durch das grüne Kästchen gekennzeichnet und stellt den Zeitraum der extramitochondrialen ATPase-Hydrolysierung von ATP dar und kann zur Beurteilung der Integrität der äußeren Membran in Cytochrom-C-Assays verwendet werden. Die angezeigten Daten wurden mit Hilfe von SD-Herzmitochondrien der Ratte gesammelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative JO2-Spuren und Atemkontrollverhältnisse über tierische und Gewebequellen. Die Qualität der isolierten Mitochondrien wurde durch Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs mittels hochauflösender Respirometrie getestet. Die Atmung wurde durch 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat in Gegenwart von 1 mM EGTA angeheizt. Mitochondrien und Substrate wurden 5 Minuten lang atmen gelassen, damit sich die Atmung des Zustands 2 stabilisieren konnte. Die maximalen Raten des Sauerstoffverbrauchs nach der Zugabe von ADP wurden mit den Raten des Sauerstoffverbrauchs in Zustand 2 vor ADP verglichen, um die Atemkontrollverhältnisse (RCRs) für jedes Gewebe zu berechnen. Die mitochondriale Qualität wurde weiter bewertet, indem die 1-1/RCR-Werte berechnet wurden, wie sie durch P-L-Kontrolleffizienzstandards charakterisiert wurden. Balkendiagramme rechts neben jeder Nachzeichnung zeigen die durchschnittlichen RCR-Werte für Männer (blau) und Frauen (grün) und 1-1/RCR-Werte ± SD für ein bestimmtes Gewebe an. (A), (B) und (C) beziehen sich auf Daten, die mit Meerschweinchen, Sprague Dawley (SD)-Ratten bzw. Friend-Leukämievirus B (FVB)-Mausherzen gesammelt wurden. (D) und (E) beschreiben die Ergebnisse von SD-Leber und -Niere von Ratten, während (F) sich auf HEK293-Zellen bezieht. Die drei größeren Leberlappen wurden entnommen, während beide Nieren zur Isolierung verwendet wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Puffer-Rezepte. Karoplegiepuffer (CB), Isolationspuffer (IB) und Atmungspuffer (RB), die während des gesamten Isolationsprozesses verwendet werden, sind im Voraus gemäß den aufgeführten Anweisungen vorzubereiten. CB kann bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden, während IB und RB 4 Monate bei -80 °C gelagert werden können. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Analyse des Atmungskontrollverhältnisses. Die mitochondriale Isolierung für funktionelle Analysen wurde an einer Vielzahl von Spezies und Gewebequellen sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Nagetieren sowie bei HEK293-Zellen durchgeführt. Die Stichprobengröße jedes Geschlechts, jeder Gewebequelle und jeder Spezies wird zusammen mit den durchschnittlichen RCR- und 1-1/RCR-Werten ± SD detailliert beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: Empfohlene Modulationen des mitochondrialen Isolationsprotokolls für unterschiedliche Gewebe zur Erhöhung der Proteinausbeute. Änderungen der Proteasemengen und Zentrifugationen werden je nach Gewebequelle angezeigt. Die durchschnittlichen Mengen an Gesamtprotein (mg) wurden aus den Ergebnissen des BSA-Proteinassays und dem Resuspensionsvolumen des endgültigen mitochondrialen Pellets berechnet. Die Werte werden als Mittelwert ± SD angegeben. Fettgedruckte Anweisungen in der Zentrifugationsspalte geben an, ob der Überstand verworfen, zurückbehalten oder gepoolt werden soll. Unter Verwerfen versteht man die Entsorgung des Überstands in einem Behälter für biologische Abfälle, während sich Retention und Pooling auf das Umfüllen des Überstands in das folgende Zentrifugationsröhrchen bzw. das Sammeln für die letzte Schleuderung beziehen. Weitere Details zu Änderungen des Protokolls finden Sie im Diskussionsbereich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%203.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren 

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

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