Bestimmung der Ziliarfunktion und Membranundurchlässigkeit des pseudostratifizierten Lungenepithels der Atemwege
February 21st, 2025
Die Grenzflächenkultur zwischen Luft und Flüssigkeit wird häufig verwendet, um pseudostratifiziertes Atemwegsepithel zu entwickeln, indem primäre normale menschliche Bronchialepithelzellen differenziert werden, die die apikale Seite der Lungenatemwege nachahmen. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Bestimmung seiner Qualität durch Überwachung seiner biophysikalischen Eigenschaften, wie z. B. der Ziliarfunktion und der Membranintegrität.
Unsere Forschung zielt darauf ab, zwei kritische biophysikalische Eigenschaften des pseudostratifizierten Atemwegsepithels zu messen, die durch die Differenzierung normaler humaner Bronchialepithelzellen in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erhalten werden können. Wir identifizierten unterschiedliche Merkmale verschiedener respiratorischer Viren mit Hilfe von pseudostratifiziertem Atemwegsepithel. Zum Beispiel die durch das Respiratorische Synzytialvirus ausgelöste Entzündung des Zytoskeletts, die ein nicht-kanonischer Mechanismus der Bronchiolitis ist.
Wir identifizierten auch, dass die Becherzellhyperplasie die SARS-CoV-2-Replikation im Atemwegsepithel der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung erhöht. Wir konzentrierten uns auf die Aufklärung des Mechanismus der durch das Respiratorische Synzytialvirus getriebenen Modulation der Signalübertragung des Zytoskeletts, um neue therapeutische Ziele zur Bekämpfung von RSV-Infektionen und virusinduzierter Bronchiolitis zu identifizieren. Nehmen Sie zunächst die normale humane Bronchialepithel-Zellsuspension (NHBE) ein.
Geben Sie mit einer P200-Pipette 50.000 resuspendierte Zellen in 200 Mikrolitern Medium der vollständigen Atemwegsepithelzelle (AEC) auf die apikale Seite des Einsatzes. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 85%bis 95%befeuchteten Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator. Sobald die Zellen zusammenfließen, übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in eine leere Vertiefung.
Saugen Sie mit einer P1000-Pipette das gesamte basale AEC-Medium an. Geben Sie dann 500 Mikroliter frisches vollständiges ALI-Differenzierungsmedium, ergänzt mit 2 % Penicillin-Streptomycin und 1 % Amphotericin B, in die Basalvertiefung. Übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in die Basalvertiefung mit dem zugegebenen vollständigen ALI-Medium.
Saugen Sie mit einer P200-Pipette das apikale AEC-Medium vorsichtig aus der Vertiefung an und inkubieren Sie es. Nach 48 Stunden werden die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in eine leere Vertiefung überführt. Aspirieren Sie mit einer P1000-Pipette das alte Medium und fügen Sie 500 Mikroliter frisches, vollständiges ALI-Medium hinzu.
Legen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette wieder in die Vertiefung mit frischem Medium. Geben Sie am 26. Tag mit einer P200-Pipette 100 Mikroliter DPBS auf die apikale Seite der Einsätze. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator für 30 Minuten.
Aspirieren Sie dann das DPBS mit einer P200-Pipette. Schalten Sie zunächst das Mikroskop, den angeschlossenen Computer und die Umgebungskammer ein. Öffnen Sie die Kammertür und stellen Sie die Platte mit den Einsätzen mit NBHE-Zellen auf den Mikroskoptisch.
Sobald die Platte auf der Bühne steht, schließen Sie die Kammer. Verwenden Sie dann den Bedienknopf des Mikroskoptisches, um die Platte zu bewegen und die Einsätze sichtbar zu machen. Klicken Sie auf dem Computerbildschirm auf das SAVA-Systemsymbol, um das SAVA-Programm zu öffnen.
Klicken Sie auf der Softwareoberfläche auf Experiment konfigurieren. Klicken Sie im nächsten Tab auf Experiment erstellen. Geben Sie dann auf der neuen Registerkarte das Verzeichnis ein, in dem die Daten im Feld Experimentverzeichnisnamen eingeben gespeichert werden sollen, geben Sie Details in das Feld Experimentbeschreibung eingeben ein und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie nun auf das Experiment, das erstellt wurde und im Verzeichnis unter dem Abschnitt Experimente angezeigt wird.
Klicken Sie anschließend auf Ändern und geben Sie im Feld Beispielbeschreibung Beispieldetails ein. Klicken Sie auf Hinzufügen und dann auf Beenden, um den Tab zu verlassen. Wählen Sie auf der Hauptoberfläche der Software das erstellte Experiment aus dem Dropdown-Menü im Experiment-Slot aus.
Klicken Sie dann auf Video aufnehmen, um die Frequenz des Ziliarschlags auf dem Computerbildschirm zu überwachen. Auf dem Bildschirm wird eine fokussierte Ziliarbewegung angezeigt. Zeichnen Sie für jede Einfügung sechs verschiedene Zufallsfelder für 2,1 Sekunden mit 120 Bildern pro Sekunde auf.
Klicken Sie auf Video speichern, um die Daten der Ziliarschlagfrequenz zu überwachen. Um Daten zu analysieren, klicken Sie auf der Softwareoberfläche auf Video analysieren. Klicken Sie auf der nächsten Registerkarte auf OK. Gehen Sie dann auf die folgende Registerkarte und klicken Sie auf Alle analysieren.
Laden Sie die für jedes Experiment generierte Tabelle in den SAVA-Datenerfassungsordner des Computers herunter. Nehmen Sie die Gaußsche mittlere Häufigkeit für die Datendarstellung. Die ziliäre Schlagfrequenz erreichte sowohl für das Atemwegsepithel gesunder Erwachsener als auch für solche mit COPD mindestens drei Hertz und zeigte eine vergleichbare Ziliarfunktion.
Schalten Sie zunächst das EVOM2-Volt-Ohmmeter mit dem Netzschalter ein. Verbinden Sie den Prüfwiderstand mit dem EVOM2 am Eingangssteckplatz. Überwachen Sie den Messwert auf dem EVOM2-Bildschirm.
Wenn der Messwert über oder unter 1.000 liegt, drehen Sie den ADJ-Schalter am EVOM2 mit einer Pinzette, bis er einen einheitlichen Messwert von 1.000 anzeigt, um das Gerät zu kalibrieren. Nehmen Sie nun einen leeren Einsatz für den Messwert der experimentellen Kontrolle. Geben Sie mit einer P200-Pipette 100 Mikroliter DPBS auf die apikale Seite des leeren Einsatzes.
Geben Sie dann 500 Mikroliter DPBS mit einer P1000-Pipette auf die Basalseite. Trennen Sie anschließend den Prüfwiderstand und verbinden Sie die STX2-Elektrode mit dem Eingangssteckplatz des EVOM2. Reinigen Sie dann die STX2-Elektrode vorsichtig mit 70 % Ethanol.
Führen Sie die STX2-Elektrode mit DPBS in den leeren Einsatz ein, wobei Sie den kürzeren Elektrodenschenkel auf dem apikalen Teil und den längeren Elektrodenschenkel auf dem basalen Teil belassen. Zeichnen Sie nun den stabilen Messwert auf dem EVOM2-Bildschirm auf. Geben Sie anschließend mit einer P200-Pipette 100 Mikroliter DPBS auf die apikale Seite des Einsatzes.
Führen Sie die STX2-Elektrode in den Einsatz mit dem 26-Tage-Epithel der differenzierten Atemwege ein, wie zuvor gezeigt. Zeichnen Sie dann den stabilen Messwert auf dem EVOM2-Bildschirm auf. Die Werte des transepithelialen elektrischen Widerstands stiegen bei Erwachsenen mit COPD an, was auf eine erhöhte Membranundurchlässigkeit bei COPD hinweist.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Überblick
Diese Studie konzentriert sich auf die Entwicklung eines pseudostratifizierten Atemwegsepithels unter Verwendung normaler menschlicher bronchialer Epithelzellen, die in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) differenziert wurden. Die Forschung hebt eine Methode zur Bewertung der Qualität dieses Epithelmodells hervor, indem dessen biophysikalische Eigenschaften, insbesondere die Flimmerfunktion und die Membranintegrität, überwacht werden. Diese sind entscheidend für das Verständnis von respiratorischen Virusinfektionen.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Pseudostratifiziertes Atemwegsepithel
- Respiratorische Viren
- Bronchiolitis und COPD-Komplikationen
Hintergrund
- Die Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur ahmt die Eigenschaften der Lungenluftwege nach.
- Das respiratorische Synzytialvirus (RSV) zeigt nicht-kanonische Entzündungsmechanismen.
- Becherzellenhyperplasie und ihre Auswirkungen auf die SARS-CoV-2-Replikation.
Verwendete Methoden
- Zelldifferenzierungsprotokolle und Überwachungstechniken
- Normale humane bronchiale Epithelzellen (NHBE)
- Videomikroskopie zur Beurteilung der Flimmerschlagfrequenz; transepithelialer elektrischer Widerstand zur Beurteilung der Membranintegrität
Hauptergebnisse
- Die Flimmerschlagfrequenz erreichte drei Hertz sowohl bei gesunden Erwachsenen als auch bei COPD-Patienten und zeigt eine vergleichbare Flimmerfunktion an.
- Die Werte des transepithelialen Widerstands deuten auf eine erhöhte Membranundurchlässigkeit bei COPD hin.
- RSV-gesteuerte Zytoskelettmodulation und ihre Auswirkungen auf therapeutische Ziele wurden identifiziert.
Schlussfolgerungen
- Die Studie etabliert erfolgreich eine zuverlässige Methode zur Bewertung von Atemwegsepithelkulturen.
- Die Ergebnisse liefern wesentliche Einblicke in die Pathophysiologie von respiratorischen Virusinfektionen und deren Auswirkungen bei chronischen Erkrankungen wie COPD.
Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Establishing Air Liquid Interface (ALI) Culture to Develop Pseudostratified Airway Epithelium
3:07
Determination of Ciliary Beat Frequency of the Airway Epithelium Obtained from Differentiating Primary NHBE Cells
5:37
Quantification of Transepithelial Electrical Resistance of Air Liquid Interface‐Cultured Pseudostratified Airway Epithelium
