Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Unsere Forschungsgruppe beschäftigt sich vor allem mit dem Crosstalk zwischen Krebs und den Immunzellen. Unser Ziel ist es, den Einfluss verschiedener biologischer Mechanismen auf die Evolution von Kopf- und Halskrebs durch die Modulation der Tumorimmunität zu untersuchen. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Invasion innerhalb der extrazellulären Matrix und eine räumliche Kolokalisation verschiedener Zelltypen in einem mehrschichtigen Kontext zu bewerten.

Der Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Heterosphäroiden, die neben Krebszellen zwei relevante nicht-neoplastische Zelltypen enthalten, um die Invasion mit extrazellulärer Matrix sowohl in Richtung einer mikroporösen Membran als auch auf Chemotaxis-Stimuli zu analysieren. Geben Sie zunächst magnetische Nanopartikel in die Zellsuspension und mischen Sie sie 10 Mal. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g und mischen Sie sie 10 Mal, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Übertragen und mischen Sie dann alle Zellen in ein neues Röhrchen für die Co-Kultivierung und geben Sie 100 Mikroliter co-kultivierte Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit extrem niedrigem Anheftungsgrad ab. Führen Sie das Magnetfeld des Sphäroidantriebs unter die Platte ein, um die Aggregation und Sphäroidbildung zu induzieren, und legen Sie es für drei Stunden in den Inkubator. Geben Sie mit einer 200-Mikroliter-Spitze 50 Mikroliter ECM in die Mitte einer mikroporösen 24-Well-Membran.

Entfernen Sie Blasen mit einer sterilen Nadel und stellen Sie sicher, dass die Matrix die Membranoberfläche gleichmäßig bedeckt. Inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius für die Gelbildung. Bereiten Sie zunächst die 3D-Zellkultur und die mit extrazellulärer Matrix beschichtete mikroporöse Membran vor.

Geben Sie 500 Mikroliter Nährmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, in die untere Kammer der mikroporösen Membran als Chemolockstoff. Entfernen Sie dann vorsichtig das Medium von den gebildeten Heterospheroiden und fügen Sie vorsichtig 50 Mikroliter frisches, nicht supplementiertes Medium pro Vertiefung über das Sphäroid hinzu. Schneiden Sie mit einer sterilen Schere den Rand einer 200-Mikroliter-Spitze mit geringer Retention ab und sammeln Sie das Sphäroid zusammen mit 50 Mikrolitern Medium.

Legen Sie das Sphäroid vorsichtig auf die extrazelluläre Matrix. Fügen Sie dann vorsichtig 150 Mikroliter unergänztes Medium Tropfen für Tropfen hinzu, um ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen. Legen Sie die Platte für 48 Stunden in den Inkubator.

Klicken Sie in der Analysesoftware auf Datei. Wählen Sie Öffnen, wählen Sie dann das Bild aus und klicken Sie auf OK. Klicken Sie dann auf Analysieren, gefolgt von den festgelegten Messungen, um den Bereich, die integrierte Dichte und die Anzeigebeschriftung auszuwählen.

Klicken Sie auf OK. Klicken Sie abschließend auf Analysieren und dann auf Messen. Die Hellfeldbilder stellen die Lokalisierung von Sphäroiden oder Zellen dar, die durch dunkle oder schwarze Konglomerate identifiziert werden.

Bilder der verschiedenen Zellen zeigten Variationen in der Fluoreszenzintensität und -menge in verschiedenen Bildern entlang der Z-Achse, was auf unterschiedliche Proliferations- und Invasionsmuster zwischen den Zellen hinweist. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wurden verschiedene Kanäle überlagert, um Kolokalisationsmuster während der Invasion sichtbar zu machen. Die Bildanalyse der vorgestellten repräsentativen Ergebnisse zeigte, dass Monozyten zuerst eindringen, gefolgt von neoplastischen Zellen, und Fibroblasten sind die letzten Zellen, die in die extrazelluläre Matrix eindringen.