Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode

Unser Forschungsschwerpunkt liegt auf dem Mechanismus der epigenetischen Vererbung. Insbesondere koppelte die DNA-Replikation den elterlichen Histon-Recycling-Prozess, der den ersten emittierenden Schritt der epigenetischen Vererbung darstellt. Es wurde festgestellt, dass die multiple elterliche Histonablagerung, die an der DNA-Replikation beteiligt ist, eine wichtige Rolle beim elterlichen Histonrecycling spielt.

Dazu gehören der D-Helikase-Komplex, die DNA-Polymerase und der Replikations-für-Schutz-Komplex. Traditionelle genetische und biochemische Ansätze sind Werte, die in diesem Forschungsbereich verwendet werden. Traditionell werden Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden eingesetzt, um den Prozess des elterlichen Histontransfers zu verstehen.

Bevor die Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter DNA oder die Experimentiermethode entwickelt wurde, war es eine Herausforderung, den elterlichen Histontransferprozess zu untersuchen. Die Experimentiermethode war ein leistungsfähiges Werkzeug, um diese grundlegenden Fragen zu beantworten. Feilen Sie zunächst die Hefezellpellets und suspendieren Sie sie durch sanftes Vortexen.

Waschen Sie es dann mit 0,4 Millilitern CHIP-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren und einer Antibiotikamischung, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. Die Mischung eine Minute lang bei 5.000 g zentrifugieren. Geben Sie anschließend 0,1 Milliliter CHIP-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren und Antibiotikamischung zum Pellet.

Gefolgt von ca. 100 Mikrolitern 0,5 Millimeter Glasperlen. Lysieren Sie die Zellen durch Bead-Beading für drei Zyklen in einem Kühlraum von vier Grad Celsius. Stanzen Sie mit einer 16 Gauge heißen Nadel Löcher in den Boden des Rohrs.

Sammeln Sie das Lysat, indem Sie das punktierte Röhrchen in ein 1,5-Milliliter-leeres DNA-Röhrchen mit niedriger Bindung einbetten und zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.600 g zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören. Die Zelltrümmerfraktion enthält das Chromatin.

Suspendieren Sie die Zellpellets erneut, indem Sie 0,35 Milliliter supplementierte Microkokken-Nuklease oder MNase-Verdauungspuffer einpipettieren. Fügen Sie als Nächstes 10 Einheiten MNase zur Suspension hinzu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie vier- bis sechsmal umdrehen und 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren.

Quaktieren Sie den MNase-Verdau, indem Sie fünf Mikroliter 0,5 molare EDTA zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig durch Inversion und stellen Sie die Tube mindestens 30 Minuten lang auf Eis. Mit 1,5-Milliliter-Bioruptor-Mikroröhrchen wird das Reaktionsgemisch drei Minuten lang mit hoher Leistung beschallt, wobei die Zyklen 30 Sekunden lang ein- und 30 Sekunden lang unterbrochen wurden.

Zentrifugieren Sie dann fünf Minuten lang bei 10.000 g bei vier Grad Celsius. Den Überstand in neue Röhrchen überführen und erneut bei 10.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Sammeln Sie dann etwa 400 Mikroliter des Überstands.

Sparen Sie 30 Mikroliter als Input-DNA für die DNA-Extraktion und frieren Sie sie bei minus 20 Grad Celsius ein. Verwenden Sie die restlichen 370 Mikroliter Zelllysat für die Immunpräzipitation mit Histon-Chromatin. Zu Beginn kochen Sie etwa 150 Mikroliter des zuvor erhaltenen Eingangs und der H3K4me3 CHIP-Proben auf einem 100 Grad Celsius heißen Block fünf Minuten lang und kühlen Sie die Probe sofort fünf Minuten lang auf Eis ab.

Geben Sie dann die erforderliche Menge der genannten Komponenten in die Probe. Mutieren Sie die Probe zwei Stunden lang auf einem Rotor bei vier Grad Celsius und 10 U/min. Übertragen Sie die Mischung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 20 Mikrolitern gewaschener Protein-G-Sepharose-Kügelchen.

Mutieren Sie das Gemisch eine Stunde lang bei vier Grad Celsius am Rotor bei 10 U/min. Schleudern Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur bei 800 g eine Minute lang. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter kaltem Brom-Desoxyuridin oder BrdU-Immunpräzipitationspuffer, der bei jeder Wäsche drei Minuten lang rotiert.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut und waschen Sie es drei Minuten lang mit einem Milliliter TE-Puffer. Die Röhrchen erneut bei 800 g für eine Minute bei Raumtemperatur drehen und den Überstand vorsichtig ansaugen. Geben Sie 100 Mikroliter TE-Puffer mit 1 % SDS zu den Kügelchen.

Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius und schleudern Sie sie dann eine Minute lang bei 800 g bei Raumtemperatur. Aufreinigung des Überstands in 18 Mikroliter Elutionspuffer unter Verwendung von DNA-Aufreinigungssäulen, um die BrdU-Immunpräzipitation und H3K4me3 eSPAN-Proben zu erhalten. Bereiten Sie die einzelsträngige DNA-Bibliothek mit den genannten Proben gemäß dem Handbuch des Vorbereitungskits für ssDNA- und DNA-Bibliotheken mit geringem Input vor.

Reinigen Sie das Ligationsprodukt in 20 Mikroliter Puffer mit niedrigem EDTA-Elutionsgehalt. Amplifizieren Sie die DNA-Bibliothek mit 50 Mikrolitern Reaktionsmischung aus dem Vorbereitungskit für einzelsträngige DNA-Bibliotheken. Amplifizieren Sie den PCR-Mix nach dem angezeigten Zyklus.

Reinigen Sie die PCR-Produkte, indem Sie sie mit 60 Mikrolitern Kügelchen mischen, die auf 30 Grad Celsius vorgewärmt werden. Mischen Sie die PCR-Produkte und -Kügelchen gründlich. Lassen Sie die Mischung fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Binden Sie die Kügelchen drei Minuten lang an einen Magnetständer und waschen Sie sie zweimal mit 200 Mikrolitern frisch zubereitetem 80%igem Ethanol. Trocknen Sie die Kügelchen zwei Minuten lang an der Luft und verdünnen Sie die DNA in 20 Mikroliter Puffer mit niedrigem EDTA-Gehalt, der im Vorbereitungskit für die DNA-Bibliothek enthalten ist. Messen Sie die Bibliothekskonzentration und die Fragmentgrößenverteilung mit hochauflösenden Elektrophoresesystemen.

Bündeln Sie gleiche Mengen einzelner Bibliotheken, einschließlich der Eingangs-H3K4me3-Chromatin-Immunpräzipitation, BrdU-Immunpräzipitation und eSPAN-Proben, um eine parallele Paired-End-Sequenzierung durchzuführen. Eine typische Gelanalyse der DNA-Sequenzierungsbibliothek von H3K4me3 eSPAN ergab ein Chromatin-Nukleosomen-Leitermuster. Die Haupt-Mononukleosomenbande trat bei 270 Basenpaaren auf, wo die Adapter an das aus der Verdauung gewonnene DNA-Fragment angehängt wurden.

Die verschiedenen Probenkartierungen zeigten Peaks an einzelnen Nukleosomen, die den Ursprung der autonom replizierenden Sequenz 607 in Wildtyp- und mcm2-3A-Zellen umgeben. Die durchschnittliche Strangverzerrung zeigte, dass in Wildtyp-Hefezellen die elterliche Histonablagerung eine leichte Verzerrung in Richtung des nacheilenden Strangs aufwies. In der mutierten elterlichen Histon wurde H3H4 jedoch auf den führenden Strang übertragen.