Name: Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Lernen Sie die eSPAN-Methode zur Analyse von Protein-DNA-Interaktionen während der DNA-Replikation in Hefe und Maus-Stammzellen. Diese Technik ermöglicht Einblicke in die epigenetische Vererbung und Chromatin-Dynamik.

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Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der National Institutes of Health R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) und dem Hormel Startup Fund (C.Y.) unterstützt.

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
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<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der Nachweis von Proteinen, die mit führenden und verzögerten Replikationssträngen assoziiert sind, ist wichtig, um die Mechanismen der Chromatinreplikation und den damit verbundenen Prozess zu verstehen, die direkt für die humane Krebsforschung und die Mechanismen der Arzneimittelresistenz relevant sind. Mehrere Methoden, wie 2D-Gel, native Chromatin-Immunpräzipitation (nChIP), iPOND und der entstehende Chromatin-Capture 29,30,31, wurden eingesetzt, um DNA-Replikation und verwandte Pro...

Bei eukaryotischen Organismen wird die Genomduplikation von mehreren Stellen initiiert, die als Replikationsursprünge bezeichnet werden, wo der Ursprung-Erkennungskomplex (ORC) bindet und die Rekrutierungsprotein-Maschinerie, einschließlich der CMG-Helikase, initiiert, um DNA-Replikation1 einzuleiten. Die Replisom-Maschinerie an jedem Replikationsursprung bildet zwei Replikationsgabeln, die bidirektional 2,3 bewegen. Die Zwillings-Replikationsgabeln replizieren die beiden Elternstränge der DNA durch kontinuierliche Synthese des führenden Strangs und diskontinuierliche Synthese des nachliegenden Strangs. Aufgrund dieser asymmetrischen Natur jeder Replikationsgabel unterscheiden sich die Replikationskomponenten, einschließlich der DNA-Polymerasen auf den führenden und nachfolgenden Strängen. Frühere genetische Analysen basierend auf mutierten DNA-Polymerasen zeigen, dass DNA Pol ε und DNA Pol δ die Hauptpolymerasen sind, die für die führende bzw. nachzügende Strangreplikation verantwortlich sind 4,5. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die Strängpräferenz der DNA-Polymerase zu erkennen, darunter Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 und emRiboSeq oder RiboSeq 9,10. Diese genetischen Methoden zur Analyse der Strängspezifität sind auf DNA-Polymerasen beschränkt und erfordern die Einführung von Mutationen an jedem Protein 4,5,11,12. Die Verfolgung der Assoziation eines beliebigen Zielproteins mit führenden und nachzüglichen Strängen von DNA-Replikationsgabeln liefert wertvolle Einblicke in die DNA-Replikation. In diesem Rahmen entwickelten wir zunächst die eSPAN-Technik (Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter naszenter DNA, Abbildung 1) in Hefezellen. Als Proof-of-Principal-Studie zeigten wir zunächst, dass Pol δ und Pol δ jeweils auf führenden und laggenden Strängen angereichert sind. Wir entdeckten außerdem die Strängpräferenz wichtiger DNA-Replikationskomponenten, darunter die replikative DNA-Helikase, das einsträngige DNA-Bindungsprotein (Replikationsprotein A) sowie die proliferatierende zellnukleare Antigenlampe (PCNA) und ihren Loader-Replikationsfaktor C (RFC)13. Wichtig ist, dass wir und andere diese Methode genutzt haben, um Mechanismen der elterlichen Histonübertragung aufzudecken, ein Prozess, der über vier Jahrzehnte lang unlösbar war(14,15,16,17).
Die eSPAN-Methode umfasst zwei aufeinanderfolgende Schritte: die Anreicherung des Zielproteins durch ChIP18 oder CUT&Tag19 und die Anreicherung der mit dem Protein assoziierten DNA durch BrdU-Immunpräzipitation. In einem Standard-Hefestamm (W303 oder S288C) kann extrazelluläres BrdU oder EdU nicht in Zellen eindringen und sich in Chromosomen integrieren. Diese Stämme haben keinen geeigneten Nukleosidtransporter für die Thymidinaufnahme sowie die Thymidinkinase, die zur Phosphorylierung von Thymidin zu TMP erforderlich ist, wodurch BrdU (oder EdU) in BrdUMP (EdUMP) umgewandelt wird. Die Expression des humanen Gleichgewichts-Nukleosidtransporters 1 (hENT1) und der Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK) erhöht die Thymidinaufnahme und die Umwandlung von BrdU (oder EdU) in BrdUMP (EdUMP)20. Daher mussten die Stämme, um das eSPAN-Experiment in Hefe durchzuführen, mit einer BrdU-Incorporating (BrdU-Inc) Struktur (HSV-TK und hENT1)13,21 eingefügt werden.
Zuvor stellten wir das eSPAN-Protokoll für DNA-Replikationsproteine in Hefe22 bereit. Kürzlich haben wir die CUT&Tag-Methode in das eSPAN-Protokoll in Säugetierzellen integriert, um technisch anspruchsvolle Schritte zu bewältigen, die Optimierung erfordern, wie Quervernetzung, Chromatinscherung und um die Anzahl der Startzellen zu minimieren.17,23. Hier haben wir Histon-eSPAN zur Visualisierung mit Hefe-Zellen bereitgestellt (Abbildung 2). Diese Methode wird hauptsächlich verwendet, um die Verteilung modifizierter Formen von Histonen auf replizierenden DNA-Strängen zu analysieren. Während wir mehrere Histonmarkierungen testeten, nahmen wir H3K4me3, ein Zeichen auf dem elterlichen Histon H3, als Beispiel. Zur Analyse von replisomen Komponenten und Faktoren, die an der DNA-Reparatur an Replikationsgabeln beteiligt sind, empfehlen wir, Chromatin in kleine Fragmente mittels Sonikation zu zerschneiden, wie in unserer ersten Veröffentlichungbeschrieben 22. Für Säugetierzellen haben wir die modifizierten Cut&Tag-Verfahren übernommen, um den inHefe 23 beschriebenen ChIP-Schritt zu ersetzen. Diese Modifikation reduziert die Menge an Ausgangsmaterial (Zellen) und ermöglicht vor allem die Erzeugung von eSPAN-Bibliotheken zur Sequenzierung ohne die Verwendung von Einzelsträng-DNA-Vorbereitungskits. Für das Hefeprotokoll entschieden wir uns gegen die Cut&Tag-Methode, da die Ausgangsmenge ausreichend war. Noch wichtiger ist, dass wir festgestellt haben, dass die Cut&Tag-Verfahren für Hefezellen in unseren Händen nicht durchgängig wirksam waren.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml DNA-Schwachbindungsröhren&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>10x Ampligase-Puffer</td><td>Lucigen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>BioRad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2 Zoll. BD PrecisionGlid Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>ACCEL-NGS 1S PLUS DNA-BIBLIOTHEKSSET</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>10009817</td><td>ssDNA und Low-Input-DNA-Bibliotheksvorbereitungskit&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100 bioanalyzer&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyse 2100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&nbsp;</td><td>Lucigen</td><td>A0110K</td><td>Behandeln Sie Paraformaldehyd mit Vorsicht, es ist brennbar, fest und gefährlich.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP SPRI Reagenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU-Antikörper&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3-Antikörper&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler, Modell TC10</td><td>BioRad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidinhydrochlorid &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>Brennbare Feststoffe</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Behandle BrdU mit Vorsicht, da es ein potenzielles Mutagen und Teratogen ist.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturinkubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Modell Forma Serie II Wassermantel-CO2-Inkubator</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturmedium&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zelllinie ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1422842</td><td>200&ndash; 400 Trockenmaskengröße</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A (ConA)-beschichtete magnetische Perlen&nbsp;</td><td>Polywissenschaften</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Führen Sie Ethanol vorsichtig, es ist entflammbar</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td>Behandle Isoproponol vorsichtig, es ist entflammbar</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td>Behandle KOH mit Vorsicht, es ist korrosiv</td></tr><tr><td>Niedriggeschwindigkeitsvakuum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnet-Ständer&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokokkale Nuklease&nbsp; (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR-Reinigungskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Perlenklopfer</td><td>Mini BeadBeater 24 Disruptor</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Multiplattform-Shaker</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>Multiplattform-Shaker-Inkubator</td><td>Benchmark</td><td>INCU-SHAKER 10L</td><td></td></tr><tr><td>Multithermischer Wärmeblock&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-Aminopropansulfonsäure&nbsp; (KLOPFEN)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&ndash; 400 Trockenmaskengröße</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Behandle NaOH mit Vorsicht, es ist korrosiv</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2&times; PCR-Mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>J61055. AP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Behandeln Sie Paraformaldehyd mit Vorsicht, es ist brennbar, fest und gefährlich.</td></tr><tr><td>pA-Tn5 Enzym&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>Pipette P1000, P200, P20 und P2</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktailtablette</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktailtablett&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Protein G-Sepharoseperlen&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Ausfällungslösung</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Ausfällungslösung</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>Behandle KOH mit Vorsicht, es ist korrosiv</td></tr><tr><td>Protein-Ausfällungslösung&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Spektrophotometer&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich.</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Pol</td><td>New England Biolabs, &nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

strängspezifische analyse von proteinen bei der replikation von dna-strängen durch anreicherung und sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden dna-methode

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Die Genomduplikation wird von Replisomproteinen, einschließlich Helikasen, orchestriert, die doppelsträngige DNA in einzelne antiparallele Einzelstränge umwickeln, die jeweils unterschiedliche Replikationsmodi erfordern: kontinuierlich (führend) und diskontinuierlich (verzögerend). Das Verständnis der Wechselwirkungen chromatinassoziierter Proteine mit replizierenden DNA-Strängen in vivo ist entscheidend, um die Mechanismen der Chromatinassemblage und DNA-Reparatur im Zusammenhang mit der DNA-Replikation zu klären. Dieses Protokoll umfasst die Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten nascent DNA (eSPAN)-Methode, die darauf ausgelegt ist, relative Proteinniveaus auf entstehenden führenden und hinterliegenden DNA-Strängen an Replikationsgabeln zu quantifizieren. Das eSPAN-Verfahren beginnt mit der Chromatin-Immunausfällung (ChIP, bei Hefe) oder der Spaltung unter Zielen und der Tagmentation (CUT&Tag; in Säugetierzellen) eines interessanten Proteins, gefolgt von der Anreicherung der proteinassoziierten entstehenden DNA durch Bromodeoxyuridin (BrdU)-Immunpräzipitation. Strengspezifische Next-Generation-Sequenzierung wird auf isolierte ssDNA angewendet. Diese Technik kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Protein an führenden oder verzögerten Replikationsgabeln angereichert ist. Das eSPAN bietet genomweite Strängpräferenz chromatinassoziierter Proteine, einschließlich Histonen an Replikationsgabeln.

eSPAN kann verwendet werden, um strengspezifische Informationen über ein Zielprotein zu erhalten, wie Histone und Histonmodifikationen. In diesem repräsentativen Ergebnis wurden Probenentnahme und eSPAN-Prozesse nach dem in Abbildung 2 dargestellten Schema mit dem Knospenhefesystem durchgeführt. Die Probenbehandlung und -entnahme folgt dem mit Hydroxyurea behandelten frühen S-Phasen-Zustand als dieses Protokoll. Zwei Hefestämme, WT (Wildtyp) und mcm2-3A-Mutant, wurden eingesetzt. Di...

Die Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter junger DNA (eSPAN) wurde entwickelt, um die relative Häufigkeit eines chromatinassoziierten Proteins auf zwei replizierenden DNA-Strängen zu erkennen und so molekulare Einblicke in die Chromatinreplikation und ihre gekoppelten Prozesse zu gewinnen. Dieses Protokoll beschreibt eSPAN-Verfahren in Hefe- und Mausembryonalen Stammzellen (ES).

Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

strand-specific-analysis-proteins-at-replicating-dna-strands

Research

Forschung

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Biology

Biologie

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Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

gDNA-Anreicherung für die NGS-Sequenzierung ist ein einfaches und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von konstitutionellen Mutationen. In diesem Artikel stellen wir das Verfahren vor, mit dem einfach die vollständige Sequenz von 11 Genen analysiert werden kann, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.

gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von BRCA1, BRCA2 Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige BrdU-ChIP-Slot-Western-Technik, um Proteine und Histonmodifikationen zu untersuchen, die mit neu synthetisierter oder entstehender DNA assoziiert sind.

Untersuchung von Proteinen, entstehende DNA in Säugerzellen Bound Mit BrdU-chip-Slot-westliche Technik

Wir beschreiben hier ein System, das einen ortsspezifischen, reversiblen in vivo Proteinblock verwendet, um Replikationsgabeln in Escherichia coli zu blockieren und zu kollabieren. Die Etablierung des Replikationsblocks wird durch Fluoreszenzmikroskopie evaluiert und die neutral-neutrale 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese wird zur Visualisierung von Replikationszwischenprodukten verwendet.

Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in<i&gt; E. coli</i&gt; Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden

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Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.

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Im Folgenden wird das Verfahren zur Analyse des Replikationsverlaufs durch pathogene, strukturanfällige Wiederholungen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese skizziert.

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Lernen Sie die eSPAN-Methode zur Analyse von Protein-DNA-Interaktionen während der DNA-Replikation in Hefe und Maus-Stammzellen. Diese Technik ermöglicht Einblicke in die epigenetische Vererbung und Chromatin-Dynamik.

Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode (Video) | JoVE Journal

Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode

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