Eine umfassende Pipeline zur Bewertung der Effizienz der menschlichen Erythropoese in vitro und ex vivo
10. Januar 2025
Die Modellierung der Erythropoese bietet eine wertvolle Möglichkeit, die biologische Bedeutung der Akteure in diesem Prozess zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu evaluieren, die Differenzierungsdefekte lindern können. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode, um CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen ex vivo effizient zu differenzieren.
Unsere Forschung konzentriert sich auf die Leukämie, insbesondere auf myelodysplastische Syndrome oder myelodysplastische Neoplasien. Es handelt sich um eine Stammzellerkrankung, die aus hämatopoetischen Stammzellen hervorgeht. Es betrifft verschiedene Blutzelllinien, insbesondere die erythroide Linie, die für die Produktion von Herzblutzellen verantwortlich ist.
Eine Störung dieser Linie kann zu einer Anämie führen, die häufig bei MDS-Patienten auftritt. Die Pipeline, die wir in diesem Artikel vorstellen, ermöglicht eine robuste und vereinfachte Methode zur Bewertung der menschlichen Erythroblasteneffizienz in vitro nach Genmodifikation oder medikamentöser Behandlung. Hämatopoetische Stammzellen sind von der Geburt bis zum letzten Moment unseres Lebens vorhanden.
Es gibt kein mehrwertiges Gewebe in unserem Organismus, in dem täglich Billionen von Zellen produziert werden. Es gibt noch so viele Dinge zu verstehen, daher werden wir diese erstaunlichen Zellen in gesunden Aminogeweben weiter untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf Proteostase und RNA-Biologie liegt. Tauen Sie zunächst 100.000 CD34+UCB-Zellen auf, indem Sie das Fläschchen 30 Sekunden lang in ein auf 37 Grad Celsius eingestelltes Wasserbad tauchen.
Geben Sie einen Milliliter Auftaumedium tropfenweise in die Durchstechflasche und resuspendieren Sie die Zellen dann vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren. Übertragen Sie die resuspendierte Zellsuspension Tropfen für Tropfen in fünf Milliliter Auftaumedium. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer mit DNAse. Nachdem Sie die Zellen erneut zentrifugiert haben, resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Stimulationsmedium. Übertragen Sie zwei Milliliter Zellsuspension in eine 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte vier bis sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Anschließend werden die Zellen in fluoreszenzaktivierten Zellsortierröhrchen gesammelt und mit einem Milliliter Stammzellmedium aufgefüllt. Nach dem Auftauen des Virus wird das Stimulationsmedium mit dem erforderlichen Volumen versehen, um eine Infektionsmehrheit von 30 zu erreichen. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in virushaltigen Medien mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro 100 Mikroliter Virus und überführen Sie sie in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte.
Geben Sie PBS in die leeren Vertiefungen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie dann das gesamte Volumen der Zellsuspension aus der Vertiefung der 96-Well-Platte in FACS-Röhrchen mit einem Milliliter Stammzellmedium. Waschen Sie die Vertiefung und die Pipettenspitze mit Stammzellmedium, um zwei Milliliter Stammzellmedium in das FACS-Röhrchen zu geben.
Nach dem Zentrifugieren des FACS-Röhrchens wird der Überstand verworfen und das Zellpellet in zwei Millilitern Expansionsmedium resuspendiert. Übertragen Sie die Suspension in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Zellen. Übertragen Sie zunächst das gesamte Volumen der CD34+-Zellen, die mit dem EGFP-Reporter transduziert wurden, in ein separates FACS-Röhrchen.
Bei 320 g acht Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 100 Mikrolitern FACS-Puffer. Geben Sie fünf Mikroliter CD34-Antikörper pro Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen im Dunkeln bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Anschließend werden die Zellen in einem Milliliter FACS-Puffer, der DAPI enthält, resuspendiert und acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nachdem Sie die Zellen in 200 Mikrolitern DAPI-haltigem FACS-Puffer resuspendiert haben, filtrieren Sie die Zellsuspension vor der Sortierung durch ein 40-Mikrometer-Sieb. Fügen Sie als Nächstes 0,5 Mikroliter CD34-Antikörper zu einem Tropfen Kügelchen in 100 Mikrolitern PBS hinzu.
Inkubieren Sie die Mischung im Dunkeln bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Fügen Sie dann einen Milliliter PBS zu der Mischung hinzu. Acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern PBS. Als nächstes geben Sie GFP-negative und GFP-positive Leukämiezellen in ein FACS-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen in einem Milliliter FACS-Puffer.
Nach dem Zentrifugieren der Zellen werden 100.000 GFP-negative Zellen und 100.000 GFP-positive Zellen in jeweils 500 Mikrolitern FACS-Puffer resuspendiert. Filtrieren Sie die Zellsuspension vor der Sortierung durch ein 40-Mikrometer-Sieb. Sammeln Sie dann die sortierten Zellen in Stammzellmedium.
Die Zellen werden acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in drei Millilitern erythroiden Differenzierungsmedien. Geben Sie nun einen Milliliter der resuspendierten Zellen in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
Füllen Sie alle äußeren Vertiefungen mit PBS. Um das Medium aufzufrischen, stellen Sie sicher, dass sich die Zellen am Boden der Platte abgesetzt haben. Lehnen Sie die Platte vorsichtig an und entfernen Sie 500 Mikroliter Medium.
Fügen Sie dann 500 Mikroliter 2X Zytokin-Erythroid-Differenzierungsmedium hinzu, um die Platte aufzufrischen. Übertragen Sie die Zellen am sechsten Tag auf eine 12-Well-Platte und geben Sie einen Milliliter Medium in jede Vertiefung, um ein endgültiges Volumen von zwei Millilitern zu erreichen. Sammeln Sie 200 Mikroliter Zellen aus jeder Vertiefung der 12-Well-Platte.
Ersetzen Sie das entfernte Volumen durch 250 Mikroliter 2X erythroides Differenzierungsmedium. Geben Sie einen Milliliter FACS-Puffer in jedes Sammelröhrchen. Nach dem Zentrifugieren der Röhrchen werden die pelletierten Zellen in 100 Mikrolitern FACS-Puffer resuspendiert.
Geben Sie je einen Mikroliter CD71-, CD34- und CD235a-Antikörper in die Röhrchen. Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter FACS-Puffer, der DAPI enthält. Die Röhrchen werden acht Minuten lang bei 320 g bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern FACS-Puffer mit DAPI. Legen Sie DAPI im Vergleich zu Side Scatter oder SSC fest, um tote Zellen auszuschließen. Legen Sie die SSC-Höhe im Vergleich zum SSC-Bereich fest, um Aggregate auszuschließen und einzelne Zellen auszuwählen.
Legen Sie die Streufläche nach vorne im Vergleich zum SSCA fest, um Ablagerungen basierend auf der Größe zu entfernen. Legen Sie CD235a gegen CD71 fest. Legen Sie CD34 im Vergleich zu SSCA fest.
Run beads GFP-positive Zellen und DAPI-gefärbte Zellen. Kompensieren Sie die Messwerte und wenden Sie die Kompensation auf die Zytometereinstellungen an. CD34-positive Zellen aus Nabelschnurblut zeigten einen Anstieg der Annexin-V-positiven apoptotischen Zellen von 14,4 % am vierten Tag auf 34,2 % am 17. Tag.
Das Balkendiagramm zeigt einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes der Annexin V-positiven Zellen bis zum Tag 17 auf etwa 40 %
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Differenzierung von CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ex vivo und beleuchtet die entscheidenden Prozesse der Erythropoese sowie deren Bedeutung für die Behandlung verwandter Erkrankungen wie myelodysplastischer Syndrome. Durch die Bereitstellung einer vereinfachten Methode zur Beurteilung der Erythroblasten-Effizienz zielt die Forschung darauf ab, das Verständnis der Störungen zu vertiefen, die bei diesen Patienten zu Anämie führen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Erythropoese
- Myelodysplastische Syndrome
- Hämatopoetische Stammzellbiologie
Hintergrund
- Myelodysplastische Syndrome sind Stammzellerkrankungen, die die Blutzelllinien betreffen.
- Die Störung der erythroiden Linie kann zu einer Anämie führen.
- Das Verständnis hämatopoetischer Stammzellen ist entscheidend, da sie während des gesamten menschlichen Lebens bestehen bleiben.
Verwendete Methoden
- Das Auftauen und erneute Suspandieren von CD34+ UCB-Zellen
- Die Transduktion von Zellen mit Genmodifikationen
- Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
Hauptergebnisse
- CD34+-Zellen zeigten im Zeitverlauf erhöhte Apoptoseraten.
- Eine effiziente Differenzierung in Erythroblasten wurde nachgewiesen.
- Die entwickelten spezifischen Methoden ermöglichen die Beurteilung nach Genmodifikation oder Arzneimittelbehandlung.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert eine robuste Methode zur Differenzierung hämatopoetischer Zellen, die zu wirksameren Therapien für Anämie durch myelodysplastische Syndrome führen könnte.
- Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung des Verständnisses der Zelldifferenzierung in der Stammzellenbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die effiziente Beurteilung der menschlichen Erythropoese ist entscheidend, um frühe Wirkstoffentwicklungen in der Hämatologie risikominimiert voranzutreiben und die Mechanismen zugrunde liegender Anämien und myelodysplastischer Syndrome zu verstehen. Diese Pipeline ermöglicht eine robuste, quantitative Bewertung der erythroiden Differenzierung und Genfunktion sowohl in gesunden als auch in krankheitsrelevanten menschlichen Systemen. Der Ansatz stärkt die Vorhersagekraft bei der Zielstrukturvalidierung und unterstützt Portfolioentscheidungen für Therapien, die die Erythropoese modulieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Genfunktion und des Einflusses von Signalwegen auf die erythroide Linienentscheidung.
- Unterstützt die biologische Ent风险bewertung, indem die Auswirkungen genetischer oder durch Verbindungen verursachter Störungen auf die Erythropoese quantifiziert werden.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung in primären humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen.
- Bietet Einblicke in die zugrundeliegenden Mechanismen krankheitsrelevanter Störungen, wie sie beispielsweise bei myelodysplastischen Syndromen beobachtet werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte In-vitro- und Ex-vivo-Systeme für die Wirkstoff-Screening-Untersuchung zur Beeinflussung der erythroiden Differenzierung.
- Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Auswertungen mittels Durchflusszytometrie und markergestützter Zellidentifizierung.
- Unterstützt die Standardisierung von Assays für die Vergleichbarkeit zwischen Studien und Arbeitsgruppen.
- Ermöglicht skalierbare Plattformen zur Bewertung von Genmodulations- und Wirkstoff-Rettungsstrategien.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft in-vitro-Befunde mit ex-vivo-Patientenmodellen für eine translationale Kontinuität.
- Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Kandidaten mit nachgewiesener Wirkung auf die Erythropoese.
- Unterstützt die Biomarker-Entwicklung durch die Verfolgung von Differenzierungs- und Apoptosemarkern über verschiedene Zeitpunkte hinweg.
- Ermöglicht die mechanistische Ent-Risikobewertung bei der präklinischen Kandidatenauswahl in hämatologischen Portfolio-Projekten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert den Prozess von der frühen Entdeckung über die Leitstruktur-Identifizierung bis hin zur präklinischen Validierung in auf die Hämatologie ausgerichteten Arbeitsabläufen.
- Entdeckungsbiochemie Quantifiziert die Wirkungen von Genen und Verbindungen auf die Spezifikation und Reifung der erythroiden Linie.
- Screening: Bietet standardisierte, reproduzierbare, auf Durchflusszytometrie basierende Assays für die Wirkstoff- und genetische Screening-Analyse.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse wie Apoptoseraten und Markerausprägung für den vergleichenden Analysen.
- Translationale Forschung Verbindet in-vitro- und ex-vivo-Befunde mit patientenrelevanten Krankheitsmodellen.
- Unternehmensweites Wiederverwenden: Bietet einen modularen, wiederverwendbaren Arbeitsablauf, der an verschiedene Genziele und Substanzbibliotheken angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung und dem mechanistischen Verständnis der Erythropoese.
- Operationaler Wert: Standardisiert Arbeitsabläufe für Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene F&E-Teams hinweg.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Phasen hämatologischer Programme.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Targets und Wirkstoffen mit nachgewiesenen erythroiden Effekten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur hämatopoetischer Stammzellen und der Analyse mittels Durchflusszytometrie.
- Benötigt Zugang zu FACS-Geräten und validierten Antikörpanels für erythroide Marker.
- Setzt eine standardisierte Strategie zur Torgate-Definition und Dateninterpretation über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Einsatzmöglichkeiten sowohl mit Proben von gesunden Spendern als auch von Patienten erhöhen die Anwendbarkeit.
- Hängt von einer zuverlässigen Zellbeschaffung und Qualitätskontrolle ab, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
