Name: Bergmeyer Glukosequantifizierung für mikrobiologische Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Bergmeyer-Glukosequantifizierung für mikrobiologische Proben mit bakteriellen und Hefefiltern. Diese Methode verbessert Genauigkeit, Spezifität und Empfindlichkeit bei der Glukosedetektion erheblich.

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1. Vorbereitung der Lösung
<ol>
	<li>Bereiten Sie 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer vor. Wiegen Sie 1,28 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) und 0,1304 g Dikaliumphosphat (K2HPO4) ab und geben Sie sie in ein Becherglas. Fügen Sie nun 70 mL entionisiertes Wasser (H2Odi) hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M Salzsäure (HCl) oder Kaliumhydroxid (KOH) auf 5,5 ein. Füllen Sie die Lösung in einen Messkolben und stellen Sie das endgültige Volumen auf 100 ml ein. Füllen Sie dann die Lösung in einen braunen Behälter um und lagern Sie die Lösung bis zu 3 Monate lang bei 4-8 °C. ACHTUNG: Tragen Sie während des gesamten Zubereitungsprozesses Nitrilhandschuhe, um Hautkontakt und mögliche Kontamination zu vermeiden, da o-Dianisidindihydrochlorid potenziell krebserregend ist.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1%ige w/v-Lösung von o-Dianisidin-Dihydrochlorid vor. Wiegen Sie 0,01 g o-Dianisidindihydrochlorid ab und geben Sie es in ein 2,0-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie mit einer 1.000-ml-Mikropipette 1,0 ml H2Odi hinzu, um die Verbindung aufzulösen, und mischen Sie dann langsam, indem Sie auf und ab pipettieren. Schützen Sie die Lösung vor Licht, indem Sie den Behälter in Alufolie einwickeln und bei -20 °C lagern, um die Stabilität zu erhalten. HINWEIS: Um die Abstützung des Röhrchens während der Messung auf der Analysenwaage zu erleichtern, kann ein 10-ml-Becherglas als zusätzliche Unterstützung verwendet werden. Dies trägt zur Stabilisierung des Rohres bei und gewährleistet eine genaue Messung, indem das Risiko einer Verschiebung oder eines Verkippens minimiert wird, das die auf der Waage erzielten Ergebnisse beeinträchtigen könnte.</li>
	<li>In einen 100-ml-Meßkolben werden 10 ml Phosphatpufferlösung gefolgt von 1 ml der 1 % v/v o-Dianisidindihydrochloridlösung gegeben. Passen Sie dann das Endvolumen mit Phosphatpuffer auf 100 mL an, um eine Endkonzentration von 0,01 % O-Dianisidin-Puffermischung zu erhalten. Füllen Sie die Lösung in einen braunen Kolben und wickeln Sie ihn mit Alufolie ein, um ihn vor Licht zu schützen. Lagern Sie die Lösung bis zu 3-4 Monate bei 4-8 °C. HINWEIS: Die Kühlung ist unerlässlich, um eine Zersetzung zu verhindern, die die Integrität der experimentellen Messungen beeinträchtigen könnte. Um einen Abbau des o-Dianisidin-Puffer-Gemisches zu vermeiden, kann eine kleine Portion von 13 mL (ausreichend für 12 Proben) bis zur Verwendung in ein 14 mL Kunststoffröhrchen auf Eis gegeben werden.</li>
	<li>50%igeH2SO4-Lösung herstellen. Einen 100 mL Meßkolben mit 30 mL H2Odi in ein Eisbad stellen und 10 min abkühlen lassen. Dann werden langsam 51 ml H2SO4 (98 % v/v) an den Wänden des Kolbens entlang gegossen und vorsichtig geschüttelt, um die Lösung zu homogenisieren. Warten Sie, bis die Mischung abgekühlt ist, da die Reaktion exotherm ist (Wärme erzeugt). Das Endvolumen wird mit H2Odi auf 100 mL eingestellt und die Lösung in einen Braunkolben aus Glas überführt. HINWEIS: Verwenden Sie einen Abzug und befolgen Sie alle Sicherheitsprotokolle, achten Sie darauf, geeignete Schutzausrüstung zu tragen. Bereiten Sie 50 ml 40%ige Calciumcarbonatlösung vor, um mögliche Verschüttungen zu neutralisieren.</li>
	<li>50 mM Natriumacetatlösung wird hergestellt, indem 0,04 g Natriumacetat in 5 ml H2Odi in einem Becherglas gelöst werden. Stellen Sie den pH-Wert mit Eisessig auf 5,1 ein. Zum Schluss stellen Sie das Volumen mit H2Odi auf 10 mL ein.</li>
</ol>
2. Vorbereitung der Enzyme
<ol>
	<li>Wiegen Sie in einem sterilen 2,0-ml-Mikroröhrchen 0,01 g Glukoseoxidase und mischen Sie es mit 1 ml 50 mM Natriumacetat, pH 5,0, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten. Decken Sie das Röhrchen mit Alufolie ab und lagern Sie es bei -20 °C. HINWEIS: Die Lösung kann bis zu 2 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen der Enzymlösung V2 , das benötigt wird, um die gewünschte Enzymaktivität in jeder Kunststoffküvette (mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml) zu erreichen, unter Verwendung von Gl (1): V1C1 = V2C2, wobei V1 1 1.500 μL, C1 28,5 U Enzymaktivität und C2 (die Konzentration der Enzymlösung) 12.970 U/ml (10 mg des Enzyms [129.000 Einheiten/g] in 1 mL beträgt von H2Odi). V2 = (1.500 μl × 28,5 U)/12.970 U = 3,29 μl (1) HINWEIS: Für ein genaueres Pipettieren kann der Wert auf 3,3 μl gerundet werden.</li>
	<li>Wiegen Sie in einem neuen 2-ml-Mikroröhrchen 0,0031 g Peroxidase-Enzym und fügen Sie 1 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 hinzu, um eine Endkonzentration von 3,1 mg/ml zu erreichen. Decken Sie das Mikroröhrchen mit Alufolie ab und lagern Sie es bei -20 °C.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen der Peroxidaselösung, das erforderlich ist, um die gewünschte Enzymaktivität pro Küvette mit Gl (1) zu erreichen. Beginnen Sie mit einem Gesamtküvettenvolumen von 1.500 μl und einer Zielenzymaktivität von 1,25 U. Bestimmen Sie dann das erforderliche Volumen der Enzymlösung bei einer Konzentration von 1.551 U. V2 = (1.500 μL × 1,25 U)/1.551 U = 1,208 μL HINWEIS: Für eine genauere Pipettiergenauigkeit wurde der Wert auf 1,20 μl gerundet.</li>
</ol>
3. Glukose-Standard
<ol>
	<li>Es wird ein D-Glucose-Standard von 1 g/l hergestellt, indem 0,01 g D-Glucose zu 10 ml H2Odi in einem Messkolben gegeben werden. Um die Konzentration auf 0,5 g/l zu verdünnen, nehmen Sie 500 μl der Stammlösung und mischen Sie sie mit 500 μl H2Odi, um ein Endvolumen von 1 ml zu erreichen. HINWEIS: Dieser Verdünnungsprozess ist für die Herstellung präziser Standardlösungen unerlässlich.</li>
</ol>
4. Vorbereitung der Standardkurve
<ol>
	<li>Fügen Sie mit einem neuen 2-ml-Mikroröhrchen die in Tabelle 1 angegebenen Puffer- und Glukosevolumina hinzu.</li>
	<li>Stellen Sie das trockene Thermobad auf 37 °C ein. Sobald die Temperatur stabil ist, fügen Sie 3,3 μl Glukoseoxidase zu allen Röhrchen hinzu und fügen Sie dann 1,2 μl Peroxidase zu jedem Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 °C für 20 min.</li>
	<li>Nach der Inkubation sofort 750 μL 50% H2SO4 (v/v) in jedes Mikroröhrchen geben und die Mischung 2 Minuten lang in einem Eisbad abkühlen lassen. Daraus ergibt sich ein Endvolumen von 1.500 μL. Zum Schluss wird die Lösung in eine Kunststoffküvette umgefüllt und die Extinktion bei 529 nm gemessen.</li>
</ol>
Tabelle 1: Glukose-Kalibrierkurve für die GOX-H2SO4-Methode . Abkürzungen: GOD = Glukoseoxidase; POD = Peroxidase; H2SO4 = Schwefelsäure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67126/67126_Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
5. Untersuchung mikrobiologischer Proben
<ol>
	<li>Gewinnen Sie die Probe, indem Sie Bakterien oder Hefen in einem flüssigen Kulturmedium unter bestimmten Bedingungen züchten, einschließlich Temperatur, Rührgeschwindigkeit und Inkubationszeit. Sobald die Kultur die gewünschte optische Dichte (OD) oder Zellkonzentration erreicht hat, entnehmen Sie die Kultur für die weitere Verarbeitung. HINWEIS: Pseudomonas reptilivora wurde bei einer konstanten Rührgeschwindigkeit von 300 U/min und 28 °C kultiviert, während Debaryomyces hansenii mit einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/min bei 30 °C in einem Orbitalschüttler kultiviert wurde. Im speziellen Fall von D. hansenii wurde auch Speiserapsöl als Induktor für die Lipaseproduktion verwendet.</li>
	<li>Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit einer 70%igen Alkohollösung oder einem geeigneten Reinigungsmittel gemäß den Biosicherheitsprotokollen. Zünden Sie einen Brenner an, um die Asepsis zu gewährleisten.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 μl des Nährmediums mit sterilen Spitzen in ein 1,5 mL oder 2 mL Mikroröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 7.500 × g für 7 min bei 4 °C oder bei 10.000 × g für 7 min ohne Temperaturkontrolle. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren vorsichtig den Überstand, der Glukose in Lösung enthält, und entsorgen Sie das Pellet.</li>
	<li>Verwenden Sie 0,5 μl des Überstands für Glukosekonzentrationen von 1 bis 20 g/l, mischen Sie dann mit 749,5 μl o-Dianisidin-Puffer, 3,3 μl GOD und dann 1,2 μl POD. Inkubieren Sie die Mikroröhrchen 20 Minuten lang bei 37 °C, wie in Schritt 4.2 beschrieben, und fügen Sie sofort 750 μl 50 % H2SO4 hinzu und lassen Sie es 2 Minuten lang in einem Eisbad abkühlen.<ol>
		<li>Bei Konzentrationen über 20 g/L ist eine 1:1-Verdünnung mit sterilem H2Odi durchzuführen, bevor Sie fortfahren.</li>
		<li>Wurden die überstehenden Proben zuvor bei -80 °C oder -20 °C eingefroren, so sind sie vor der Verwendung bei Raumtemperatur aufzutauen und 30 s lang zu wirbeln. Wenn eine Verdünnung erforderlich ist, steriles H2Odi verwenden.</li>
		<li>Bei Proben mit Glukosekonzentrationen über 30 g/l ist eine 1:1-Verdünnung mit sterilem H2Odi durchzuführen, was zu einem Verdünnungsfaktor von 2 führt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Berechnen Sie die Gesamtglukosekonzentration in jeder Probe mit Gl (2) in einem Tabellenkalkulationsprogramm. 
	<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67126/67126eq11.jpg" style="margin: auto;">(2) Wo: 
	x = Konzentration von Glukose (g/L) δ = Endreaktionsvolumen (0,0015 L) 
	y = Extinktion M.S. = Menge der verwendeten Probe* HINWEIS: Die Werte b und m stammen aus der Gleichung, die die Trendlinie der Kalibrierkurve für die Methode modelliert (y = mx + b). *Der MS-Wert muss auf der Probenmenge basieren, die verwendet wurde, um das Verhältnis bei der entsprechenden Verdünnung zu erhalten (d. h. wenn Sie 0,5 μl des Überstands entnehmen, ist M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × 10-6 l); Wenn ein Verdünnungsfaktor (DF) verwendet wird, multipliziert man die erhaltene Extinktion mit dem DF. Wenn beispielsweise eine Extinktion von 0,5 erreicht wird und ein DF von 2 verwendet wird, wäre das Ergebnis 1,0. Daher ist y = 1,0, und dieser Wert sollte wie zuvor beschrieben in Gl (2) eingegeben werden.</li>
</ol>
6. Analytische Validierung
<ol>
	<li>Berechnen Sie die analytischen Validierungsparameter der GOX-H2SO4-Methode gemäß den vom Nationalen Metrologiezentrum und der mexikanischen Akkreditierungsstelle10 (CENAM-ema) festgelegten Standards.<ol>
		<li>Berechnen Sie die Genauigkeit als Prozentsatz des Variationskoeffizienten oder %CV = (S/x) × 100, wobei x der Mittelwert der Stichprobengruppe und S die Standardabweichung mit einem Akzeptanzwert von ≤10 % ist.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Linearität, indem Sie die Standardkurve an das lineare Modell R2 über 0,995 anpassen.</li>
		<li>Berechnen Sie die Bestimmungsgrenze (LOQ) anhand der Gleichung: LOQ = yB + 10sB, wobei yB die Analytkonzentration darstellt, die ein Signal erzeugt, das dem Zielsignal entspricht, und 10sB das 10-fache der Standardabweichung des Blindwerts darstellt</li>
		<li>Berechnen Sie den systematischen Fehler mit dieser Gleichung: Schräg = x - m, wobei x = Durchschnitt der experimentellen Konzentration und m die theoretische Konzentration ist.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Genauigkeit als den Grad der Übereinstimmung zwischen einem reellen Wert und einem theoretischen Wert. Wiederherstellung % = (CR/KS) × 100 Dabei ist CR der Durchschnitt der experimentellen Konzentration und CV der Variationskoeffizient der theoretischen Konzentration.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Beeinträchtigung durch andere reduzierende Zucker
<ol>
	<li>Bewerten Sie vier reduzierende Zucker separat: Glukose, Fruktose, Galaktose und Xylose aus einer 0,5 g/l Stammlösung. Verwenden Sie zusätzlich Trehalose als Negativkontrolle. Befolgen Sie das Protokoll für alle Proben und messen Sie die Extinktion bei 545 und 529 nm.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Enzymatische Bergmeyer-Glukose-Quantifizierung für die mikrobielle und Hefeanalytik

<ol><li>Huang, W. C., Tang, I. C. Bacterial and yeast cultures: process characteristics, products, and applications. Bioprocessing for value-added products from renewable resources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuang%2C+WC+%22New+Technologies+and+Applications%22">New Technologies and Applications</a>. , Elsevier. 185-223 (2007).</li>
<li>Hernandez-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+reducing+sugars+based+on+the+qualitative+technique+of+Benedict%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Quantification of reducing sugars based on the qualitative technique of Benedict.</a> ACS Omega. 5 (50), 32403-32410 (2020).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dinitrosalicylic+acid+reagent+for+determination+of+reducing+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.</a> Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).</li>
<li>Deshavath, N. N., Mukherjee, G., Goud, V. V., Veeranki, V. D., Sastri, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+the+3%2C5-dinitrosalicylic+acid+%28DNS%29+assay+for+the+reducing+sugars%3A+interference+of+furfural+and+5-hydroxymethylfurfural%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay for the reducing sugars: interference of furfural and 5-hydroxymethylfurfural.</a> Int J Biol Macromol. 156, 180-185 (2020).</li>
<li>De Abreu, J. R., Santos, C. D. D., De Abreu, C. M. P., Corrêa, A. D., De Oliveira Lima, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+fractionation+and+pectin+content+during+the+ripening+of+guava+cv.+Pedro+Sato%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Sugar fractionation and pectin content during the ripening of guava cv. Pedro Sato.</a> Food Sci Technol. 32 (1), 156-162 (2020).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. -A., Hamilton, J. K., Roberts, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of sugars.</a> Nature. 168 (4265), 167(1951).</li>
<li>Gonzalez, N. M., Fitch, A., Al-Bazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+RP-HPLC+method+for+determination+of+glucose+in+Shewanella+oneidensis+cultures+utilizing+1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a RP-HPLC method for determination of glucose in Shewanella oneidensis cultures utilizing 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatization.</a> PLoS ONE. 15 (3), e0229990(2020).</li>
<li>Galant, A. L., Kaufman, R. C., Wilson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%3A+Detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose: Detection and analysis.</a> Food Chem. 188, 149-160 (2015).</li>
<li>Bergmeyer, H. U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergmeyer%2C+HU+%22Methods+of+enzymatic+analysis%22">Methods of enzymatic analysis</a>. 2, Elsevier Inc. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gu%C3%ADa+t%C3%A9cnica+sobre+trazabilidad+e+incertidumbre+en+las+mediciones+anal%C3%ADticas+que+emplea+la+t%C3%A9cnica+de+espectrofotometr%C3%ADa+de+ultravioleta-visible%22">Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que emplea la técnica de espectrofotometría de ultravioleta-visible</a>. , CENAM-EMA. (2008).</li>
<li>Yuen, V. G., McNeill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+glucose+oxidase+method+for+glucose+determination+by+manual+assay+and+automated+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the glucose oxidase method for glucose determination by manual assay and automated analyzer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (3), 543-546 (2000).</li>
<li>Hansen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+glucose+oxidase+reaction+and+interference+with+quantitative+glucose+oxidase-peroxidase-O-dianisidine+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Investig%22%5BJournal%5D)">Specificity of glucose oxidase reaction and interference with quantitative glucose oxidase-peroxidase-O-dianisidine method.</a> Scand J Clin Lab Investig. 14 (6), 651-655 (1962).</li>
<li>Kumar, V., Gill, K. D. Estimation of blood glucose levels by glucose oxidase method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Basic+concepts+in+clinical+biochemistry%3A+A+practical+guide%22">Basic concepts in clinical biochemistry: A practical guide</a>. , Springer eBooks. 57-60 (2018).</li>
</ol>

Glukose dient als primäre Energie- und Kohlenstoffquelle für zahlreiche Mikroorganismen, darunter Bakterien, Hefen und Pilze. Diese Mikroorganismen nehmen Glukose über Transporter auf, die sich auf der extrazellulären Membran befinden, wo sie eine Reihe von biochemischen Reaktionen innerhalb des Glykolyse-Stoffwechselwegs durchläuft, um in Pyruvat1 umgewandelt zu werden. Für die Quantifizierung von reduzierenden Zuckern wie Glukose gibt es verschiedene Techniken. Zum Beispiel könnendas Benedict-Reagenz2, die Verwendung von 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)3,4, das Anthrona-Verfahren5 oder das Phenol-Schwefelsäure-6-Verfahren angewendet werden. Mit diesen Methoden wird jedoch in der Probe vorhandener reduzierender Zucker wie Fruktose und Maltose nachgewiesen, der zu dem Signal beitragen und die genaue Quantifizierung eines bestimmten Zuckers erschweren kann.
Darüber hinaus erfordern sie eine strenge Temperaturkontrolle und den Umgang mit gefährlichen Substanzen, was den Prozess erschweren und die Genauigkeit beeinträchtigen kann. Diese Methoden können auch durch andere in der Probe vorhandene Verbindungen gestört werden, was eine genaue Glukosequantifizierung erschwert. Umgekehrt bietet die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eine präzisere Alternative, die die Unterscheidung zwischen Glukose und anderen reduzierenden Zuckern ermöglicht, wenn auch mit höheren Betriebskosten. Diese gegensätzlichen Methoden unterstreichen den anhaltenden Bedarf an der Entwicklung genauer und kostengünstiger Glukosequantifizierungstechniken7.
Bei der Glukoseoxidase-Peroxidase-Schwefelsäure-Methode (GOX-H2SO4) werden zwei Enzyme verwendet, Glukoseoxidase (GOD) und Peroxidase (POD). GOD ist ein Oxidoreduktase-Enzym, das sehr selektiv für die Oxidation von β-D-Glukose8 ist. Dieser Komplex wirkt als Katalysator während der Reaktion, die in Gegenwart von Glukose in Gegenwart von Sauerstoff stattfindet, und produziert Gluconsäure und Wasserstoffperoxid (H2O2). H2O2 wird mittels eines chromogenen Sauerstoffakzeptors, o-Dianisidin, nachgewiesen, der bei Wechselwirkung mit POD dessen Oxidation und H2O2 -Freisetzung bewirkt, wodurch verhindert wird, dass Gluconsäure wieder in Glukose umgewandelt wird (siehe Abbildung 1). Die erhaltene Farbe wird durch Zugabe von Schwefelsäure (H2,SO4) stabilisiert, wodurch auch die enzymatische Reaktion gestoppt wird, wodurch mögliche Interferenzen vermieden werden, die auftreten könnten, wenn die Reaktion fortgesetzt wird9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67126/67126fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Überblick über die Glukosequantifizierungsmethode mit dem Enzym Glukoseoxidase, das mit Glukose zu Wasserstoffperoxid (H2O2) und Gluconsäure reagiert. Anschließend reagiert das Peroxidase-Enzym in Gegenwart von O-Dianisidindihydrochlorid mit H2O2. Im letzten Schritt wird Schwefelsäure (H2SO4) zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu stoppen, was zu einer rosa Farbe führt, die bei 529 nm gemessen wird. Abkürzungen: POD = Peroxidase; GOD = Glukoseoxidase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67126/67126fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die enzymatische Methode GOX-H2SO4 ist eine Technik, die häufig zur Messung der Glukosekonzentration in biologischen Proben verwendet wird, von denen die meisten von klinischem Interesse sind. Nur wenige Studien haben jedoch eine Technik untersucht, die es ermöglicht, die Menge an Glukose in einem Wachstumsmedium zu quantifizieren, um seinen Verbrauch zu bewerten. Daher wird in dem vorliegenden Protokoll die Methode zur Quantifizierung von Glukose mittels der enzymatischen Reaktion von Glukoseoxidase, Peroxidase, o-Dianisidindihydrochlorid undH2SO4in mikrobiologischen flüssigen Proben vorgestellt, die als Modifikation der von Bergmeyer9 durchgeführten Arbeit unter Verwendung von 50%(v/v)H2SO4und niedrigeren Mengen von Reagenzien entsteht.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikroröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-2,0 mL Mikroröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Meyer</td><td>471-34-1</td><td>Calciumcarbonat</td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Meyer</td><td>50-99-7</td><td>D-Glukose&nbsp;</td></tr><tr><td>Trockenbad</td><td>FisherScientific</td><td>11-718-4</td><td>Seriennummer 911NO251. Block BxTxH mm/Zoll: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6125-50KU</td><td>Enzympulver</td></tr><tr><td>H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Deionisiertes Wasser</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Meyer</td><td>7664-93-9</td><td>Schwefelsäure</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Meyer</td><td>7647-01-0</td><td>Salzsäure&nbsp;</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Meyer</td><td>7758-11-4</td><td>Dikaliumphosphat</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Meyer</td><td>7778-77-0</td><td>Monokaliumphosphat</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Meyer</td><td>1310-58-3</td><td>Kaliumhydroxid</td></tr><tr><td>Lambda 35</td><td>PerkinElmer-Spektralphotometer</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikroröhrchen Zentrifuge</td><td>-</td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>o-Dianisidindihydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3252</td><td>Chromogene</td></tr><tr><td>Peroxidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8125-50KU</td><td>Enzympulver-pH-Messgerät</td></tr><tr><td></td><td>Hanna&nbsp;</td><td>1131</td><td>Hanna 1170</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Meyer</td><td>127-09-3</td><td>Meyer</td></tr><tr><td>Wiegewender&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

bergmeyer glukosequantifizierung für mikrobiologische proben

Bergmeyer Glucose Quantification for Microbiological Samples

Die spektrophotometrische Analyse von GOX-H2SO4 ergab eine einzige maximale Extinktion bei 529 nm (λmax) (Abbildung 2A), wobei zusätzliche Absorptionswerte bei 545 nm beobachtet wurden. Durch die Analyse der Absorptionswerte bei verschiedenen Glukosekonzentrationen erhielten wir eine Linearität (R²) von 0,9977 für λ529 nm und R² von 0,9967 für λ545 nm (Abbildung 2B). Die Linearität innerhalb eines bestimmten Bereichs bezieht sich auf di...

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Wir präsentieren eine automatisierte modulare Hochdurchsatzmethode zur Identifizierung und Charakterisierung von mikrobiellen Exopolysacchariden in kleinem Maßstab. Diese Methode kombiniert eine schnelle Vorselektion zur Analyse der Gesamtmenge an sezernierten Polysacchariden mit einem detaillierten Kohlenhydrat-Fingerabdruck, um ein schnelles Screening von neu isolierten Bakterienstämmen oder ganzen Stammsammlungen zu ermöglichen.

Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle und hochempfindliche Quantifizierung von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Daten Sensor eine maßgeschneiderte portable FRET-Analyzer. Das Gerät wurde verwendet, Maltose innerhalb eines kritischen Temperaturbereich zu erkennen, die Detektionsempfindlichkeit maximiert, wodurch praktische und effiziente Beurteilung der Zuckergehalt.

Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

Hierin beschreiben wir einen kolorimetrischen Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von reduzierenden Zuckern während der Keimung von Bakteriensporen.

Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

Monozyten sind integrale Bestandteile des menschlichen angeborenen Immunsystems, die auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind, wenn sie aktiviert werden. Wir beschreiben ein durchflusszytometrisches Protokoll zur Messung der Glukosetransporterexpression und der Glukoseaufnahme durch Gesamtmonozyten und Monozyten-Subpopulationen in frischem Vollblut.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Es wird ein Protokoll zur Erstellung eines einfachen Modellökosystems beschrieben, das den Methan-Sauerstoff-Gegengradienten im natürlichen Lebensraum von aeroben Methan-oxidierenden Bakterien nachbildet und so die Untersuchung ihrer Physiologie in einem räumlich aufgelösten Kontext ermöglicht. Modifikationen an gängigen biochemischen Assays für die Verwendung mit dem Agarose-basierten Modellökosystem werden ebenfalls beschrieben.

Agarose-basiertes Modellökosystem für die Kultivierung von Methanotrophen in einem Methan-Sauerstoff-Gegengradienten

Erfahren Sie die Bergmeyer-Glukosequantifizierung für mikrobiologische Proben mit bakteriellen und Hefefiltern. Diese Methode verbessert Genauigkeit, Spezifität und Empfindlichkeit bei der Glukosedetektion erheblich.

Bergmeyer Glukosequantifizierung für mikrobiologische Proben

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