Name: Präparierung von Mücken-Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen für Mikrobiomanalysen auf Organebene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:25:00.000+00:00
Duration: 3 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Präparation von Mücken-Eierstöcken, Mitteldarm und Speicheldrüsen für mikrobiomanalysen auf Organebene. Diese Methode ermöglicht kontaminationsfreie Untersuchungen mikrobieller Symbionten.

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<meta charset="utf8"></head><body>Hochpräzise Isolierung von Mückenorganen für Mikrobiomanalysen

<ol><li>Achee, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+strategies+for+mosquito-borne+arbovirus+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Alternative strategies for mosquito-borne arbovirus control.</a> PLOS Negl Trop Dis. 13 (1), e0006822(2019).</li>
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<li>Ghousein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pWCP+is+a+widely+distributed+and+highly+conserved+Wolbachia+plasmid+in+Culex+pipiens+and+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Commun%22%5BJournal%5D)">pWCP is a widely distributed and highly conserved Wolbachia plasmid in Culex pipiens and Culex quinquefasciatus mosquitoes worldwide.</a> ISME Commun. 3 (1), 40(2023).</li>
<li>Juma, E. O., Kim, C. -H., Dunlap, C., Allan, B. F., Stone, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Culex+restuans+egg+rafts+harbor+diverse+bacterial+communities+compared+to+their+midgut+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Culex restuans egg rafts harbor diverse bacterial communities compared to their midgut tissues.</a> Parasit Vectors. 13 (1), 532(2020).</li>
<li>Lee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GToTree%3A+a+user-friendly+workflow+for+phylogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GToTree: a user-friendly workflow for phylogenomics.</a> Bioinformatics. 35 (20), 4162-4164 (2019).</li>
<li>Parks, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+domain-to-species+taxonomy+for+bacteria+and+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A complete domain-to-species taxonomy for bacteria and Archaea.</a> Nat Biotechnology. 38 (9), 1079-1086 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Alkoholgehalt 96°;</td><td>Fisher scientific</td><td>10332562</td><td></td></tr><tr><td>Binokularlupe&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>RAJA</td><td>145517</td><td>150 Tabletten à 1,5 g</td></tr><tr><td>DNA-Vorbereitungskit</td><td>Illumina</td><td>Bereitgestellt von der MGX-Sequenzierungsplattform</td><td>Früher bekannt als Nextera DNA Flex</td></tr><tr><td>DNA-RNA Shield (50 mL)</td><td>Zymo research</td><td>ZR1100-50</td><td>Konservierungspuffer</td></tr><tr><td>DNeasy Blut- und Gewebe-Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA-Extraktionskit</td></tr><tr><td>Filterspitzen 20 & Mikro; L</td><td>Starlab</td><td>S1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitzen 200 & Mikro; L</td><td>Starlab</td><td>S1120-8710</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitzen 1000 & Mikro; L</td><td>Starlab</td><td>S1122-1730-C</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>11252-20</td><td>Dumont Pinzette #5</td></tr><tr><td>Bibliotheksquantifizierungskit</td><td>Roche</td><td>Zur Verfügung gestellt von der MGX-Sequenzierungsplattform</td><td>KAPA Library Quanitification Kits</td></tr><tr><td>Mikropipetten 2-20 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>6.291704</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten 20-200 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>6.291703</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten 100-1000 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>7.648488</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger&nbsp;</td><td>Epredia</td><td>J1800BMNZ</td><td>Abmessung : 75 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Nadeln</td><td>Terumo</td><td>AN*2719R1</td><td></td></tr><tr><td>NGS Kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>Bereitgestellt von MGX Sequenzierungsplattform</td><td>Fragment Analyzer Systems HS Genomic DNA 50kb Kit</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>Bereitgestellt von MGX Sequenzierplattform</td><td>Sequenzierer</td></tr><tr><td>PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (steril)</td><td>Fisher scientific</td><td>10212990</td><td></td></tr><tr><td>Permanent schwarzer Marker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril Eppendorf&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>33871</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Halterung für Nadeln</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>26016-12</td><td>Moria MC1 Stifthalter 12 cm</td></tr></tbody></table>

präparierung von mücken-eierstöcken, mitteldarm- und speicheldrüsen für mikrobiomanalysen auf organebene

Dissection of Mosquito Ovaries, Midgut, and Salivary Glands for Microbiome Analyses at the Organ Level

x'Mosquito Dissektionen Gemäß dem Protokoll sammelten und isolierten wir die Eierstöcke, den Mitteldarm, die Speicheldrüsen und den Schlachtkörper von zwei Culex pipiens molestus-Exemplaren (einschließlich eines trächtigen Weibchens) aus einer Laborkolonie. Wir bestätigten saubere Dissektionen nach der Beobachtung ganzer (d.h. ungebrochener) und gut isolierter Organe ohne verbleibende Trümmer unter dem Fernglas. Der gesamte Körper, der Kopf und der Thorax, die präparierten Speicheldrüsen, Eierstöcke und der Mitteldarm eines Exemplars von Culex pipiens molestus sind in Abbildung 2 dargestellt. Erwartungsgemäß waren die Mitteldarm- und Speicheldrüsen um eine Größenordnung kleiner als die Eierstöcke der Mücke. Die Eier eines trächtigen Culex-Exemplars sind zusammen mit seinen Mitteldarm- und Malpighischen Tubuli in Abbildung 3 dargestellt. Bemerkenswert ist, dass Dissektionen anfälliger für Fehler sind, wenn das Material nicht frisch ist und das Gewebe wahrscheinlich bricht (Abbildung 4B, C). Wir empfehlen daher, das Material nach Möglichkeit direkt nach der Entnahme (innerhalb von weniger als 12 Stunden) zu präparieren, da das Gewebe noch elastisch ist (Abbildung 4A). In ähnlicher Weise kann die Dissektion von gefrorenem Material durchgeführt werden, aber es besteht ein viel höheres Risiko für Versagen und Kreuzkontamination zwischen Organen aufgrund von zerbrechlichem Gewebe (Abbildung 4).
Mikrobiom-Daten Darüber hinaus sammelten und trennten wir die Mitteldärme und Eierstöcke von drei einzelnen Culex quinquefasciatus-Exemplaren aus Noumea, Neukaledonien, nach dem gleichen Verfahren. Wir extrahierten DNA aus jedem Organ, bereiteten Proben für die Sequenzierung des gesamten Genoms vor und führten Mikrobiomdatenanalysen durch, wie in der ergänzenden Datei 1 beschrieben. Eine bakterielle taxonomische Diversitätsanalyse an nicht assemblierten, qualitätsgefilterten Short Reads mit PhyloFlash12 zeigte deutlich dominante Taxa im Mitteldarm im Vergleich zu den Eierstöcken (Abbildung 5A). Bemerkenswert ist, dass die Bakteriengemeinschaften der Eierstöcke von Wolbachia dominiert wurden, mit dem zusätzlichen Vorhandensein eines Spirochaetaceae-Phylotyps in den Eierstöcken von Individuum 3, während die Gemeinschaften des Mitteldarms eine größere Diversität aufwiesen, einschließlich Gammaproteobakterien, Spirochaetaceae und Firmicutes. Aus den gleichen Sequenzierungsdaten rekonstruierten wir vier Metagenom-Assemblierte Genome (MAGs) mit einer Vervollständigung &gt; 80% und einer Redundanz &lt; 5%, die den Klassen Spirochätien, Alpha- und Gammaproteobakterien angehören (Tabelle 1).
Wie erwartet, deckten die hier rekonstruierten MAGs aufgrund der spezifischen Mängel der Genomrekonstruktion mit metagenomischen Short-Reads nicht die gesamte taxonomische Vielfalt ab, die von den PhyloFlash-Ergebnissen vorhergesagt wurde. Der Wolbachia zugeordnete MAG (Ref. MAG 3 in Tabelle 1) wurde in allen Eierstöcken und zwei der Mitteldärme nachgewiesen und hatte eine höhere Abdeckung in den Eierstöcken (Abbildung 5B). Wir rekonstruierten auch zwei MAGs, die zur Familie der Enterobacteriaceae gehören, einschließlich der Gattung Pantoea (Ref. MAG 1 und 2 in Tabelle 1), in den Mitteldärmen, die von Culex-Individuen 2 und 3 gewonnen wurden und in den entsprechenden Eierstöcken nicht nachgewiesen wurden (Abbildung 5B). Schließlich rekonstruierten wir auch ein bakterielles Genom von Spirochaetaceae, Ref. MAG 4 (Tabelle 1), das der Gattung BR149 zugeordnet wurde und von Graña-Miraglia und Kollegen13 erfolgreich aus dem Mitteldarm von Culex pipiens isoliert wurde. Interessanterweise wurde dieser MAG sowohl im Mitteldarm von Individuum 1 und 3 als auch in den Eierstöcken von Individuum 3 nachgewiesen (Abbildung 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methode, die die verschiedenen Schritte zusammenfasst. Materialvorbereitung, Mückensammlung, Mückenreinigung, Mückensektion und Lagerung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig02.jpg"> Abbildung 2: Culex pipiens molestus Weibchen. (A) Ganzer Körper. (B) Kopf und Thorax. (C) Präparierte Speicheldrüsen. (D) Präparierte Eierstöcke. (E) Präparierter Darm mit Malpighi-Tubuli. Maßstabsbalken = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig03.jpg"> Abbildung 3: Präpariertes Abdomen eines trächtigen Culex pipiens molestus-Weibchens . Gezeigt sind der Vorderdarm, der Mitteldarm, der Hinterdarm, die Malpighischen Tubuli und die Eier des Exemplars. Rote Striche zeigen an, wo geschnitten werden muss, um den Mitteldarm vom Vorderdarm und Hinterdarm zu trennen. Maßstabsbalken = 500 μm. Abkürzungen: F = Vorderdarm; M = Mitteldarm; H = Hinterdarm; E = Eier; MT = Malpighische Tubuli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig04.jpg"> Abbildung 4: Sektion von frischen und gefrorenen Culex-Mückenproben. Weiße Rechtecke zeigen (A) Mückengewebe mit intakten Organen aus einer frisch präparierten Probe und (B,C) gebrochenes biologisches Material aus Proben, die vor der Sektion eingefroren wurden. Maßstabsbalken = 720 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67128/67218fig05.jpg"> Abbildung 5: Beispiel für eine Mikrobiomanalyse an drei Culex quinquefasciatus-Individuen . (A) Visualisierung der bakteriellen Diversität, die durch die Extraktion von SSU-rRNA-Reads mit PhyloFlash12 im Mitteldarm und in den Eierstöcken der drei Proben geschätzt wurde. (B) Mittlere Abdeckung der rekonstruierten MAGs über die Proben. Abkürzungen: MAG = Metagenome-Assembled Genome; Ind = Individuell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67218fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ILLUSTRIERTE</td>
			<td>Referenz MAG 4</td>
			<td>Referenz MAG 2</td>
			<td>Referenz MAG 1</td>
			<td>Referenz MAG 3</td>
		</tr><tr><td>Länge (bp)</td>
			<td>1,287,790</td>
			<td>4,910,866</td>
			<td>4,751,276</td>
			<td>1,298,266</td>
		</tr><tr><td>Anzahl der Contigs</td>
			<td>9</td>
			<td>162</td>
			<td>149</td>
			<td>123</td>
		</tr><tr><td>GC %</td>
			<td>34.05</td>
			<td>55.45</td>
			<td>54.05</td>
			<td>34.15</td>
		</tr><tr><td>Fertigstellung (%)</td>
			<td>84.5</td>
			<td>97.18</td>
			<td>98.59</td>
			<td>91.55</td>
		</tr><tr><td>Redundanz (%)</td>
			<td>0</td>
			<td>2.82</td>
			<td>4.22</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Domäne</td>
			<td>Bakterien</td>
			<td>Bakterien</td>
			<td>Bakterien</td>
			<td>Bakterien</td>
		</tr><tr><td>Stamm</td>
			<td>Spirochäte</td>
			<td>Proteobakterien</td>
			<td>Proteobakterien</td>
			<td>Proteobakterien</td>
		</tr><tr><td>Klasse</td>
			<td>Spirochätien</td>
			<td>Gammaproteobakterien</td>
			<td>Gammaproteobakterien</td>
			<td>Alphaproteobakterien</td>
		</tr><tr><td>Bestellung</td>
			<td>WRBN01</td>
			<td>Enterobacterales</td>
			<td>Enterobacterales</td>
			<td>Rickettsiales</td>
		</tr><tr><td>Familie</td>
			<td>WRBN01</td>
			<td>Enterobacteriaceae</td>
			<td>Enterobacteriaceae</td>
			<td>Anaplasmataceae</td>
		</tr><tr><td>Gattung</td>
			<td>BR149</td>
			<td>Pantoea</td>
			<td>-</td>
			<td>Wolbachia</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Rekonstruierte MAGs von den drei Culex quinquefasciatus-Individuen . Genomgröße, Anzahl der Contigs, Anteil der GC, Schätzungen der Fertigstellung und Redundanz basierend auf der in Anvi'o17 verfügbaren Einzelkopie-Kerngensammlung und der mit GTDB18 erhaltenen Taxonomie.
Ergänzende Datei 1: Detailliertes Beispielverfahren für die Analyse von Mikrobiomdaten, beginnend mit der Probenentnahme, der DNA-Extraktion und der Sequenzierung des gesamten Genoms, gefolgt von dem bioinformatischen Workflow für die Genomrekonstruktion und die Schätzung des prokaryotischen und eukaryotischen Leseanteils <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67128/67128_SupplementaryMaterial_15.07.2024_JR_fin.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Präparierung von Mücken-Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen für Mikrobiomanalysen auf Organebene

The global burden of mosquito-transmitted diseases, including malaria, dengue, West Nile, Zika, Usutu, and yellow fever, continues to increase, posing a ...

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Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq

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