U-förmige horizontale Schwimmtechnik zur Aufbereitung hochwertiger Spermien mit niedrigem DNA-Fragmentierungsindex

[Erzähler] Die Forschung konzentriert sich auf eine Methode zur Spermienoptimierung, die darauf abzielt, festzustellen, ob die UHS-Technik Vorteile bei der Aufbereitung hochwertiger Spermien mit einem niedrigen DNA-Fragmentierungsindex bietet. Die mikrofluidische Technologie wurde eingesetzt, um die Auswahl von qualitativ hochwertigen Spermien mit niedrigerem DFI zu optimieren. Die Haupteinschränkung der UHS-Methode besteht darin, dass sie sich stark auf die Selbstschwimmfähigkeit hochwertiger Spermien verlässt. Die UHS-Methode ist nicht für Patienten mit völlig unbeweglichen Spermien geeignet. Die Thigmotaxis spielt eine entscheidende Rolle bei der Trennung der Spermien. Die U-förmige Orbita hat eine längere Grenze, die die freie Bewegung hochwertiger Spermien erleichtert und ihre vollständige Trennung von unbeweglichen Spermien, Verunreinigungen und anderen Bestandteilen ermöglicht. Im Vergleich zur DGC-Technik erfordert die UHS-Lane-Methode weniger manuelle Bedienungsschritte für das Laborpersonal, und hochwertige Spermien, die durch die UHS-Lane-Methode gewonnen werden, werden nicht wiederholten Zentrifugationsverfahren unterzogen, was zu einer niedrigeren DFI führt. Geben Sie zunächst 20 Mikroliter Düngemedium in die Operationsschale, um U-förmige Spuren zu erzeugen. Saugen Sie mit einer Pipette 10 Mikroliter Düngemedium an, um am linken Startpunkt der U-förmigen Spur ein kreisförmiges Tröpfchen zu erzeugen. Erzeugen Sie mit Düngemedium zwei Puffertröpfchen von je 10 Mikrolitern in Abständen entlang des linken mittleren Abschnitts der U-förmigen Spur. Verbinden Sie alle Tröpfchen mit dem Düngemedium zu einer durchgehenden Spur. Verwenden Sie 2,5 Mikroliter Polyvinylpyrrolidon oder PVP, um einen langen Streifen Flüssigkeitströpfchen auf der rechten Seite der U-förmigen Schiene zu erzeugen. Stellen Sie sechs Mikrotröpfchen mit dem Eizellverarbeitungsmedium auf der rechten Seite des PVP-Streifens her. Geben Sie sieben Milliliter Kulturöl in die Schüssel und stellen Sie sicher, dass das Öl den höchsten Punkt der Tröpfchen vollständig bedeckt. Stellen Sie das Gericht über Nacht in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 6 % Kohlendioxid, um es auszugleichen. Messen Sie nach der Entnahme des Samens sein Volumen mit der Wiegemethode und stellen Sie eine Genauigkeit von 0,01 Millilitern sicher. Legen Sie die Samenprobe für 15 bis 30 Minuten in eine Umgebung von 37 Grad Celsius und aspirieren Sie sie in eine Einwegpipette aus Kunststoff mit breiter Bohrung. Wenn sich das Sperma nicht innerhalb von 60 Minuten verflüssigt, fügen Sie die gleiche Menge Befruchtungsmedium hinzu. Atme die Mischung mit einer Einweg-Transferpipette aus Kunststoff wiederholt ein und aus, bis sie sich vollständig verflüssigt hat. Messen Sie den pH-Wert des Samens mit Präzisions-pH-Testpapier mit einem Bereich von sechs bis 10. Nehmen Sie 10 Mikroliter voll verflüssigtes Sperma und tropfen Sie es in eine Makula-Zählkammer. Bewerten Sie die Beweglichkeit der Spermien unter einem 200-fachen Feld mit einem optischen Mikroskop. Geben Sie fünf Mikroliter Sperma in das Mikrotröpfchen des Befruchtungsmediums am linken Startpunkt der U-förmigen Spur in der ICSI-Operationsschale. Passen Sie den Winkel und die Position der Eizellhaltenadel und der Injektionsnadel unter der 4X-Objektivlinse an. Nachdem Sie die Einrichtung überprüft haben, übertragen Sie die ausgewählte Eizelle in das Mikrotröpfchen des Oozytenverarbeitungsmediums in der ICSI-Operationsschale. Stellen Sie die Operationsschale mit den Eizellen auf den heißen Tisch des vorbereiteten Mikroskopbedieners. Nach dem Einstellen des Fokus die Injektionsnadel in den PVP-Streifen der ICSI-Operationsschale absenken. Schieben Sie die Injektionsnadel in den langen Streifen auf der rechten Seite der U-förmigen Schiene und extrahieren Sie hochwertige Spermien. Übertragen Sie das Sperma in den PVP-Streifen auf der rechten Seite und legen Sie das Sperma auf den Boden der Operationsschale. Drücken Sie die Injektionsnadel vorsichtig in den mittleren oder unteren Bereich des Spermienschwanzes. Ziehen Sie die Injektionsnadel schnell zurück und kratzen Sie das Sperma ein, um es ruhig zu stellen. Inhalieren Sie nun das Sperma vom Schwanz bis zum Kopf in die Injektionsnadel. Injizieren Sie langsam Spermien in das Zytoplasma der Eizelle und inkubieren Sie die injizierte Eizelle. Geben Sie 1,5 Milliliter Gradientenzentrifugationslösung mit 45 % Dichte in ein steriles 15-Milliliter-Reagenzglas mit konischem Boden. Und fügen Sie langsam 1,5 Milliliter Gradientenzentrifugationslösung mit 90 % Dichte auf den Boden der 45%igen Gradientenlösung hinzu. Geben Sie nun das verflüssigte Sperma in die Gradientenzentrifugationslösung und drehen Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 g. Nach dem Entfernen des Überstands werden ca. 0,5 Milliliter des restlichen Spermiensediments aufgefangen und mit drei Millilitern Befruchtungsmedium vermischt. Die Mischung bei 200 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig heraus und lassen Sie etwa 0,2 Milliliter Sediment übrig, schütteln Sie es und mischen Sie, um das Sediment wieder zu suspendieren. Zählen Sie abschließend die Spermienkonzentration und -motilität, bevor Sie die Probe für die spätere Verwendung in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 6 % Kohlendioxid lagern. Legen Sie ein Röhrchen mit 25 Mikrolitern Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt für ein bis zwei Minuten in ein 90 bis 100 Grad Celsius heißes Wasserbad. Setzen Sie die Tube dann für fünf Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, bis sich die Temperatur stabilisiert hat. Geben Sie drei bis 10 Mikroliter Sperma in Agaroseröhrchen mit niedrigem Schmelzpunkt und mischen Sie es gründlich. Lassen Sie 30 Mikroliter der Mischung in horizontaler Position auf einen vorbehandelten Objektträger fallen. Legen Sie den vorbehandelten Objektträger nach dem Abdecken vier Minuten lang bei zwei bis acht Grad Celsius in einen Kühlschrank und stellen Sie sicher, dass er in einer horizontalen Position bleibt. Nehmen Sie die Folie aus dem Kühlschrank und schieben Sie vorsichtig das Abdeckglas ab. Tauchen Sie den vorbehandelten Objektträger sieben Minuten lang in eine denaturierende Lösung. Entfernen Sie die Rutsche und stellen Sie sie aufrecht hin. Verwenden Sie dann Filterpapier, um überschüssige Wassertropfen aufzusaugen, ohne den Probenbereich zu berühren. Waschen Sie den Objektträger fünf Sekunden lang in destilliertem Wasser. Tauchen Sie den Objektträger seriell in die passenden Lösungen für den jeweiligen Zeitraum ein. Halten Sie dann den vorbehandelten Glasobjektträger waagerecht und geben Sie etwa einen Milliliter der gemischten Farbstofflösung auf den Objektträger. Spülen Sie den Objektträger nach fünfminütigem Färben 10 bis 15 Mal vorsichtig mit destilliertem Wasser ab. Hochwertige Spermien mit guter progressiver Beweglichkeit schwammen sanft am Rand der U-förmigen Bahn entlang, was es der intrazytoplasmatischen Spermieninjektionsnadel erleichterte, sie einzeln zu greifen. Während mit beiden Methoden gute Spermien gewonnen wurden, war der DNA-Fragmentierungsindex von qualitativ hochwertigen Spermien, die mit der Dichtegradientenzentrifugationsmethode getrennt wurden, signifikant höher als bei der U-förmigen horizontalen Schwimmmethode.