Name: Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 9 s
Description: Lernen Sie den Thermal-Shift-Assay zur Untersuchung von Ligandenbindung an Proteinen. Diese Methode analysiert Nukleotid- und Metallbindung an Selenoprotein O und identifiziert stabilisierende Bedingungen für die Kristallographie.

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<meta charset="utf8"></head><body>Hochdurchsatz-Thermoshift-Assays für Protein-Liganden-Wechselwirkungen

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<li>Kotov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+interrogation+of+protein+thermal+unfolding+data+with+moltenprot%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot.</a> Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).</li>
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<li>Goldberg, T., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+pseudoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of pseudoenzymes.</a> Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).</li>
<li>Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+pseudokinases%3A+A+look+at+the+untapped+enzymatic+potential+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases.</a> IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).</li>
<li>Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+and+let+die%3A+Insights+into+pseudoenzyme+mechanisms+from+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenosin-5&prime;-triphosphat-Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383-10G</td><td>wird für repräsentative Ergebnisse verwendet, ist aber für die Durchführung nicht erforderlich TSA</td></tr><tr><td>Avanti J-15R mit Mikroplatten-Trägerbaugruppe</td><td>Beckman Coulter</td><td>C19416</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 384 Real-time PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>12011452</td><td></td></tr><tr><td>Hartschale 384-Well PCR Platten, dünnwandig, umrandet, klar/weiß</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP3805</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>wird für repräsentative Ergebnisse verwendet, ist jedoch nicht erforderlich, um TSA</td></tr><tr><td>Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat</td> zu erzielen, <td>Sigma Aldrich</td><td>M3634-500G</td><td>wird für repräsentative Ergebnisse verwendet, ist jedoch nicht erforderlich, um TSA</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR-Plattenversiegelungsfolie, selbstklebend, optisch</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td> durchzuführen</tr><tr><td>SYPRO Orange Protein Gel Färbung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5692-500UL</td><td></td></tr><tr><td>Uridin 5&prime;-Triphosphat Trinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6625-100MG</td><td>wird für repräsentative Ergebnisse verwendet, ist aber für die Durchführung von TSA nicht erforderlich</td></tr></tbody></table>

verwendung eines thermal-shift-assays zur untersuchung der substratbindung an das selenoprotein o

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Eukaryotisches SelO besteht aus einer N-terminalen mitochondrialen Targeting-Sequenz, einer Kinase-ähnlichen Domäne und einem hochkonservierten Selenocystein am C-Terminus des Proteins23. Dieses mitochondriale Enzym kodiert für eine Pseudokinase-Domäne, die von Bakterien auf den Menschen übertragen wurde23. Die Strukturanalyse des SelO-Homologs aus Pseudomonas syringae ergab Aminosäureveränderungen im aktiven Zentrum, die die Bindung von ATP in umgekehrter Orientierung im Vergleich zu kanonischen Kinasen erleichtern25. Dementsprechend katalysiert SelO die AMPylierung anstelle der Phosphorylierung mehrerer Proteine, die an der antioxidativen Signalübertragung beteiligt sind, um die Zellen vor oxidativen Schäden und Zelltod zu schützen25. Zusätzlich zur AMPylierung wurde gezeigt, dass einige prokaryotische und eukaryotische AMPylasen die UMPylierung katalysieren27,28.
Wir verwendeten gereinigtes rekombinantes E . coli SelO in TSA, um die Bindung von ATP- und UTP-Nukleotiden an SelO in Gegenwart von zweiwertigen Kationen zu untersuchen. Ähnlich wie kanonische Kinasen beherbergt SelO das DFG-Motiv, bei dem das Aspartat das Metallion an das koordinierende Nukleotid im aktiven Zentrum bindet. Zunächst optimierten wir die Konzentration von Protein und Farbstoff für robuste Fluoreszenzmessungen in TSA und stellten fest, dass 5 μM bis 10 μM E. coli SelO mit 5x SYPRO Orange optimal waren (Abbildung 2). Darüber hinaus zeigten wir, dass sowohl die No-Protein- als auch die No-Dye-Kontrollen ein niedriges Fluoreszenzsignal aufwiesen, das nicht auf den Temperaturanstieg reagierte. Wir stellten einen Anstieg der thermischen Stabilität von E. coli SelO um etwa +4 °C bzw. +12 °C in Gegenwart von ATP-Mg2+ bzw. ATP-Mn2+ fest (Abbildung 3). Wir beobachteten jedoch keine Verschiebung der thermischen Stabilität nach der Inkubation mit UTP, was darauf hindeutet, dass E. coli SelO möglicherweise keine nachweisbare Bindung an UTP zeigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig01.jpg"> Abbildung 1: Aufbau des Thermocyclers. Ein Beispiel für das Thermocycler-Programm, das verwendet wird, um die Probentemperatur um +0,5 °C/min zu erhöhen, während die SYPRO Orange-Fluoreszenz über den FRET-Kanal gemessen wird. Die Empfehlung beinhaltet auch eine Inkubation bei Umgebungstemperatur zu Beginn und am Ende des Protokolls. Abkürzung: FRET = Förster Resonanz-Energie-Übertragung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig02.jpg"> Abbildung 2: Optimierung der Protein- und Farbstoffkonzentrationen. (A) Repräsentative Ergebnisse der Optimierung der SYPRO Orange Farbstoffkonzentration mit 5 μM Escherichia coli SelO. (B) Repräsentative Ergebnisse der Optimierung der E. coli SelO-Konzentration mit dem 5x SYPRO Orange Farbstoff. Die thermische Denaturierungskurve stellt die relativen Fluoreszenzeinheiten (y-Achse) in Bezug auf die Temperatur (x-Achse) dar. Die Ergebnisse stellen den mittleren ± SD aus dreifachen Vertiefungen dar (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig03.jpg"> Abbildung 3: Thermische Denaturierungskurven und ΔTm-Analysen von SelO in Gegenwart von Nukleotiden und zweiwertigen Kationen. (A) Rohdaten der thermischen Denaturierungskurven von Proben (5 μM Escherichia coli SelO in Gegenwart von 200 μM ATP oder UTP und 2 mM zweiwertige Kationen, 5x SYPRO Orange), die von der RT-PCR-Maschine exportiert und aufgetragen wurden. SelO ATP-Mg repräsentiert Proben mit SelO, ATP und MgCl2, SelO ATP-Mn repräsentiert Proben mit SelO, ATP und MnCl2, SelO UTP-Mg repräsentiert Proben mit SelO, UTP und MgCl2, SelO UTP-Mn repräsentiert Proben mit SelO, UTP und MnCl2. Beachten Sie, dass die Kontrollen ohne Farbstoff und ohne Protein eine geringe Fluoreszenz aufweisen. Die Ergebnisse stellen den mittleren ± SD aus dreifachen Vertiefungen dar (n = 3). (B) Thermische Denaturierungskurven, die bis zur höchsten Intensität aufgetragen wurden und mit der Boltzmann-Sigmoidalgleichung übereinstimmen. Obwohl die thermische Denaturierung von SelO nicht durch UTP beeinflusst wurde, beobachteten wir eine deutliche Verschiebung der thermischen Denaturierung in Gegenwart von ATP (violette Kurven). Die Ergebnisse stellen den mittleren ± SD aus dreifachen Vertiefungen dar (n = 3). (C) Histogramm mit Darstellung der T-m-Werte, abgeleitet aus der sigmoidalen Boltzmann-Anpassung der in Abbildung 3B dargestellten Daten. Die Ergebnisse stellen den mittleren ± SD aus dreifachen Vertiefungen dar (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histogramm, das die Änderung der Schmelztemperatur ΔTm darstellt (Tm additiv - T m Puffer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle S1: Beispieldaten für TSA von SelO in Gegenwart von Metallen und Nukleotiden. Tabelle mit Rohdaten, die vom RT-PCR-Gerät exportiert wurden, und Daten, die verarbeitet wurden, um Werte nach maximaler RFU-Intensität zu löschen, wie in den Protokollschritten 5.1 und 5.2 beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

utilizing-thermal-shift-assay-to-probe-substrate-binding-to

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Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.

Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung von Glutathion-verknüpften Spenderperlen mit GST-verschmolzenen TPR-Motiv-Co-Chaperonen und Akzeptorperlen in Verbindung mit einem Hsp90-abgeleiteten Peptid vor. Wir haben diese Technik verwendet, um kleine Moleküle zu screenen, um Hsp90-FKBP51- oder Hsp90-FKBP52-Interaktionen zu stören, und potente und selektive Hsp90-FKBP51-Interaktionshemmer identifiziert.

Untersuchungen von Chaperon-Cochaperon-Interaktionen mit homogenem Bead-based Assay

Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit einem zellulären thermischen Shift-Assay, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.

Vorhersage und Validierung von Proteinzielen für niedermolekulare Verbindungen

Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Hier stellen wir ein Protokoll für die Verwendung von oberflächenexponierten Substraten der Hefe für enzymatische Modifikationsassays vor. Die Plattform wurde anhand der Analyse der Dephosphorylierungsaktivität der Tyrosinphosphatase SHP-2 gegen eines ihrer Substrate als repräsentativer enzymatischer Modifikationsassay demonstriert.

Enzymatische Modifikation und Durchflusszytometrie-Bewertung von Proteinen, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden

Lernen Sie den Thermal-Shift-Assay zur Untersuchung von Ligandenbindung an Proteinen. Diese Methode analysiert Nukleotid- und Metallbindung an Selenoprotein O und identifiziert stabilisierende Bedingungen für die Kristallographie.

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

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