Name: In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung von Calciumtransienten bei der Befruchtung und frühen Embryogenese von C. elegans mit dem genetisch kodierten CaFE-Reporter. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Signale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Verfolgung von Kalzium in den frühen Entwicklungsphasen von C. elegans

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
<li>Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Start+me+up%3A+Cell+signaling+and+the+journey+from+oocyte+to+embryo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans.</a> Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).</li>
<li>Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+A+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).</li>
<li>Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+that+influence+germline+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).</li>
<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kamath, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Reboul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+ORFeome+version+1.1%3A+experimental+verification+of+the+genome+annotation+and+resource+for+proteome-scale+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression.</a> Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).</li>
<li>Bui, Y. K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+inositol+5-phosphatase+homolog+negatively+regulates+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+signaling+in+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation.</a> Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).</li>
<li>Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+along+the+cleavage+furrows+in+cleavage-stage+Xenopus+embryos+and+its+inhibition+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin.</a> J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).</li>
<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
<li>Goldstein, B., Hird, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+anteroposterior+axis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).</li>
<li>Johnston, W. L., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+in+the+C.+elegans+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition.</a> Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).</li>
<li>Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+self-selecting+and+clone-free+integration+of+transgenes+into+engineered+CRISPR+safe+harbor+locations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).</li>
<li>Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+nuclear+%CE%B2-catenin+and+TCF+pattern+embryonic+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during zebrafish embryonic development.</a> BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).</li>
<li>Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteration+in+an+inquiry-based+undergraduate+laboratory+strengthens+student+engagement+and+incorporation+of+scientific+skills%5BTitle%5D)+AND+%22J+Scholarsh+Teach+Learn%22%5BJournal%5D)">Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills.</a> J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 kg; Pulver löst sich leichter auf als Flocken</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Alkohollampe</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>Verwendung mit 95% Ethanol</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5 g</td></tr><tr><td>AMSCO 400 Serie Kleiner Dampfsterilisator</td><td>Steris Gesundheitswesen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bacto-Trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dragonfly 200 Spinning Disk konfokal</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>Verwendet mit Leica Mikroskop</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Cytogenics Mikroskop Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035-900</td><td>144 Objektträger pro Packung</td></tr><tr><td>Flachzange, glatter Kiefer</td><td>Home Depot 305530604</td><td></td><td>Stellen Sie sicher, dass die Zange glatt ist</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;- d-1-thiogalactopyranosid&nbsp;( IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10 10</td><td>g; dioxanfrei</td></tr><tr><td>Laborklebeband</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td>0,5 Zoll Klebeband wird zum Abkleben von Objektträgern</td></tr><tr><td>verwendet Levamisol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541016</td><td>1 oz Packung</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 Laserscanning konfokal</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Konfokal</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Platindraht</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1159436</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>Scientific S271-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S471-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>steril Petri Schale (35 mm x 10 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>960 Petrischalen pro Karton</td></tr><tr><td>Sterile Petrischalen (60 mm x 15 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229665</td><td>500 Petrischalen pro Karton</td></tr><tr><td>Stamm EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG16</td><td>Erstellt von Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Stamm EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: PIE-1U; ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG25</td><td>Erstellt von Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Stamm EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG28</td><td>Erstellt von Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Stamm JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>JIM113</td><td>Erstellt von E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Stamm OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OD70</td><td>Erstellt von Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech Worm Pick Handle</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500 g</td></tr></tbody></table>

in vivo visualisierung von calciumtransienten während der befruchtung und frühen entwicklung bei c. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Unter Verwendung der in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle wurden die dynamischen Muster der Kalziumsignalgebung bei der Befruchtung und Embryogenese bei C. elegans beobachtet.
Eine typische Befruchtungssequenz bei Würmern, die den CaFE-Reporter enthalten, ist in Abbildung 2 dargestellt. Um die Analyse zu erleichtern, wurde der EAG28-Stamm verwendet, der den CaFE-Reporter mit einem Transgen13 der Pleckstrin-Homologiedomäne (PH-mCherry) kombiniert. Der PH-mCherry-Marker lokalisiert an der Plasmamembran und ermöglicht eine einfachere Visualisierung von Zellgrenzen, insbesondere im Gonadenarm. Der EAG28-Stamm entstand durch Kreuzung des EAG16-Stammes, der den CaFE-Reporter enthält, mit dem OD70 PH-mCherry-Reporterstamm13. Bei C. elegans finden Eisprung und Befruchtung gleichzeitig statt. Der Zeitpunkt 0 der Befruchtung gilt als der erste Rahmen, in dem ein Fluoreszenzsignal in der ovulierenden Eizelle nachgewiesen wird (Abbildung 2). Ein heller Fluoreszenzausbruch tritt an der Stelle der Spermienfusion auf, sobald die Vorderkante der Eizelle in die Spermatheca, das Speicherorgan für Spermien7, eintritt. Das Signal erscheint, bevor der Eisprung abgeschlossen ist. Die Kalziumwelle ist zweiphasig, mit einem schnellen anfänglichen Ausbruch, gefolgt von einer Fluoreszenzwelle vom Eintrittspunkt zum gegenüberliegenden Pol. Die gesamte Eizelle fluoresziert in &lt;30 s.
Beachten Sie, dass der CaFE-Reporter in einer einzigen Kopie vorliegt und das Signal daher nicht so hell ist wie bei anderen Transgenen. Ein Z-Stack-Zeitraffer wird während des Eisprungs nicht empfohlen, es sei denn, eine konfokale Spinning-Scheibe ist verfügbar und optimiert. Z-Stapel-Bilder können vor oder nach einem Film aufgenommen werden, um 3D-Veränderungen in der Gonadenmorphologie zu erfassen. Obwohl die Bilder hier mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden, wurden die Transienten auch mit der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, die häufiger und kostengünstiger ist als konfokal. Bei Verwendung eines Laserscanning-Konfoals beträgt die Bildrate ca. 1 fps. Bei Verwendung einer konfokalen rotierenden Scheibe beträgt die Bildrate 10 fps oder schneller. Das Hintergrundsignal des CaFE-Reporters reicht aus, um die reifenden Eizellen im Gonadenarm zu beleuchten. Bei der Befruchtung wird typischerweise ein 1,5- bis 2-facher Anstieg der GFP-Signalintensität beobachtet.
Für die Quantifizierung gibt es mehrere alternative Methoden. Zum Beispiel ist die Bildanalysesoftware Imaris, die von Oxford Instruments (der gleichen Muttergesellschaft wie das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop Andor Dragonfly) entwickelt wurde, in der Lage, das Signal in jedem Bild nur von der transitierenden Eizelle zu quantifizieren, anstatt einen größeren ROI zu erzielen. Die Imaris-Software ist jedoch nicht kostenlos. Darüber hinaus wurde eine detaillierte Bildanalysestrategie zur Messung von Kalziumwellen in der Eizelle von Takayama, Fujita und Onami sehr detailliert beschrieben und verwendet ImageJ, das frei verfügbar ist14. Alternativ erfordern Kymographen zur Veranschaulichung der Welle des Fluoreszenzsignals über eine einzelne Eizelle eine umfangreichere Bildmanipulation als hier beschrieben, werden aber in Takayama und Onamibeschrieben 3.
Ein deutlicher Vorteil von C. elegans ist seine Fähigkeit, die Expression fast jedes Gens zu unterbinden, indem die Würmer mit Bakterien gefüttert werden, die dsRNA exprimieren, um endogene RNAiauszulösen 15,16. Für eine optimale dsRNA-Expression enthalten sowohl die RNAi-Platten als auch die gesättigte RNAi-Kultur IPTG. Die dsRNA wird hergestellt, indem das interessierende Gen mit flankierenden Promotoren exprimiert wird. Hier haben wir die Ahringer-Bibliothek verwendet, die auf den größten Teil des Wurmgenoms abzielt, indem wir 16.256 Bakterienstämmeverwenden 17. Alternativ wurde ein ORFeome von ~11.000 RNAi-Klonen vom Vidal-Labor unter Verwendung des Gateway-Systems erstellt und kann über Horizon Discovery18 erworben werden.
Um den Nutzen des CaFE-Reporters in Kombination mit RNAi zu demonstrieren, untersuchten wir den vorzeitigen Eisprung. Eine partielle Deletion in ipp-5 induziert ein doppeltes Ovulationsereignis, bei dem sowohl die -1-Eizelle als auch die -2-Eizelle während desselben Eisprungs in die Spermatheca gelangen19. IPP-5 ist eine Phosphatase, die auf IP3 wirkt und den Spiegel des IP3-Botenstoffs effektiv senkt. Wir fanden heraus, dass der RNAi-Knockdown von ipp-5 einen doppelten Ovulationsphänotyp auslöst, der dem der Mutante ähnelt.
Die Analyse des CaFE-Reporters während des doppelten Eisprungs, der durch den ipp-5-RNAi-Knockdown induziert wurde, enthüllte neue Aspekte der OET. Zunächst wurde ein Kalziumsignal unmittelbar nach dem Eintritt in die Spermathek in der führenden -1-Eizelle beobachtet, nicht jedoch in der nachfolgenden -2-Eizelle (Abbildung 3). Obwohl 2 Eizellen ovuliert werden, ist die -1-Eizelle immer noch die einzige Eizelle, die Anzeichen einer ordnungsgemäßen Reifung zeigt, insbesondere den Abbau der Kernhülle (NEBD). Diese Daten deuten darauf hin, dass die -2-Eizelle, obwohl sie sich in Gegenwart von Spermien befindet, nicht befruchtet werden kann, da sie noch nicht richtig gereift ist. Zweitens weist die -2-Eizelle eine verzögerte Kalziumwelle auf, typischerweise wenn die Eizelle die Spermatheca verlässt und in die Gebärmutter gelangt. Obwohl die Eizellreifung normalerweise eine Voraussetzung für den Eisprung ist, deuten diese Daten darauf hin, dass die Reifung der Eizelle und die Befruchtungsfähigkeit auch nach dem Eisprung noch stattfinden können. Die Visualisierung der verzögerten Kalziumwelle während des ipp-5-Knockdowns unterstreicht die Vorteile des CaFE-Reporters zur Abfrage der Befruchtungskompetenz und des Timings.
Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass der CaFE-Reporter in gelegten Eiern nachweisbar ist und einzellige Kalziumtransienten während der frühen Embryogenese in C. elegans aufdeckt. Embryonen aus synchronisierten adulten EAG28 (CaFE; PH-mCherry)-Würmer wurden unter Verwendung der Protokolle aus den Abschnitten 1-5 mit der konfokalen Spinning-Scheibe der Andor Dragonfly unter Verwendung der Zyla-Kamera abgebildet (Abbildung 4). Die Kalziumtransienten sind auf einzelne Zellen beschränkt und benötigen weniger Zeit als die Befruchtungskalziumwelle (~9 s, n=11). Die Kalziumwelle während der Embryogenese scheint jedoch nicht zweiphasig zu sein. Calciumtransienten wurden vor dem 8-Zellen-Stadium nicht beobachtet. Bemerkenswert ist, dass Calcium bei C. elegans nicht in der Spaltfurche lokalisiert ist, wie es bei vielen anderen Organismen, einschließlich des Menschen und Xenopus 20,21,22, der Fall ist. Einzellige Calciumtransienten wurden gut nach der Gastrulation (~200 min nach der Befruchtung) und in gelegten Eiern beobachtet. Ein einzelner Embryo zeigt im Laufe der Zeit mehrere Kalziumtransienten, jedoch in verschiedenen Zellen und typischerweise in einer Zelle nach der anderen. Beachten Sie, dass eine kontinuierliche Exposition gegenüber der Laserstimulation die Embryonen schädigt. Es wird entweder eine geringere LED-/Laserleistung oder eine diskontinuierliche Belichtung empfohlen. Da die Kalziumwellen jedoch mit ~9 s relativ kurz sind, empfehlen wir nicht, langsamer als 2 s zwischen LED/Laser-Stimulationsereignissen zu sein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Gonadenarm von C. elegans . Bild eines Gonadenarms aus dem Wurmstamm EAG25, der den CaFE-Reporter GFP (grün) und den Histon-2B-mCherry-Marker (rot) zeigt, der die Zellkerne in der Keimbahn hervorhebt. Die proximale Eizelle wird mit der -1 direkt vor der Spermathek bezeichnet, in der die Spermien gelagert werden (Pfeil). Der Embryo, der sich am nächsten an der Spermatheca, aber in der Gebärmutter befindet, ist der jüngste Embryo. Das Bild wurde mit dem Nikon ECLIPSE Ti2 Laserscanning-Konfokal aufgenommen. Maßstabsleiste = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Visualisierung der Kalziumwelle während der Befruchtung. Zeitreihenbilder der Fluoreszenz, die intrazelluläres Kalzium während der Befruchtung im Wurmstamm EAG28 reflektiert. Der EAG28-Stamm enthält sowohl den CaFE-Reporter (grün) als auch eine Pleckstrin-Homologie-Domäne-mCherry-Fusion (gelb), die Plasmamembranen hervorhebt. Die Zeit 0 zeigt das erste Bild an, das einen deutlichen Anstieg des Fluoreszenzsignals in der Eizelle anzeigt. Die Zeit 24,4 s spiegelt das erste Bild wider, das die Fluoreszenz der gesamten Eizelle zeigt. Zeitreihenbilder wurden mit der andor Dragonfly rotierenden Scheibe konfokal mit einer Zyla-Kamera aufgenommen. Maßstabsleiste = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Kalziumwellen während eines ipp-5-RNAi-induzierten doppelten Ovulationsereignisses. Zeitrafferaufnahmen von sequentiellen Kalziumwellen der -1 Eizelle und der -2 Eizelle in einem EAG16-Stamm (CaFE in GFP grün), die ipp-5 RNAi ausgesetzt waren. Der -40,0 s-Rahmen enthält Markierungen für die -1 Eizelle (-1), die -2 Eizelle (-2), die Spermatheka (*) und die +1 Embryo (+1). Die Zeit 0 s zeigt die anfängliche Zunahme der Fluoreszenz der Kalziumwelle der -1-Eizelle. Die Zeit 4,5 s zeigt die Kalziumwelle, die sich in der -1-Eizelle zum entgegengesetzten Pol ausbreitet. Die Zeit 70,5 s zeigt die Ganzzellfluoreszenz in der -1-Eizelle, begleitet von der -2-Eizelle zu Studienbeginn des GFP-Signals; Beide Eizellen befinden sich in der Spermatheca. Die befruchtete -1-Eizelle und die unbefruchtete -2-Eizelle gelangen zum Zeitpunkt 158,3 s in die Gebärmutter. Bei 219,3 s zeigt die -2-Eizelle eine spätfluoreszierende Kalziumwelle. Die Bilder wurden mit der andor Dragonfly rotierenden Scheibe konfokal mit einer Zyla-Kamera aufgenommen. Maßstabsleiste = 30 μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Einzellige Kalziumtransienten in der frühen Embryogenese. (A) Embryonen in utero und (B) ex utero (gelegte Eizelle) zeigten während der Embryogenese ein Fluoreszenzsignal in einer einzelnen Zelle. Die Bilder wurden mit der andor Dragonfly rotierenden Scheibe konfokal mit einer Zyla-Kamera aufgenommen. Maßstabsleiste = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt eine Technik zur Visualisierung der frühen Ereignisse der Embryogenese in den...

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Dieses Video stellt die Konzepte hinter der Kalziumbildgebung vor und enthält ein Beispielprotokoll für die Zeitrafferbildgebung von Würmern, die in geformten Agarose-Vertiefungen enthalten sind.

Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Kalzium-Bildgebung in einzelnen Neuronen von sich benehmenden Caenorhabditis elegans unter Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Reporterproteine. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Abbildung der Wurmbewegung und der Messung der Reporterfluoreszenzverhältnisse von Neuronen erforderlich sind, um den intrazellulären Kalziumspiegel mit der neuronalen Aktivität und Verhaltensänderungen während der Eiablage zu korrelieren.

Calcium-Bildgebung in einzelnen Neuronen zur Regulierung des Eiablageverhaltens bei Caenorhabditis elegans

Quelle: Bancroft, E. A., et al{. Quantifizierung spontaner Ca2+ Flüsse und ihre nachgelagerten Effekte in primären Mittelhirnneuronen der Maus. J. vis. exp.  (2020) {{TAG_ 46}}Dieses Video zeigt die Echtzeit-Visualisierung des Kalziumeinstroms in ventralen Mittelhirnneuronen, die aus Mausembryonen stammen. Unter Verwendung eines viralen Vektors zur Expression eines Kalziumindikators werden die Neuronen unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet, um Änderungen der Fluoreszenzintensität während...

Visualisierung des Kalziumeinstroms in ventralen Mittelhirnneuronen aus Mausembryonen

Quelle: Doser, R., et al. Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Kalziumumgangs in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt in vivo die Bildgebung des subzellulären Kalziumflusses in den ventralen Nervenstrangneuronen von transgenen Caenorhabditis elegans-Stämmen. Es werden zwei unterschiedliche Kalziumindikatoren verwendet: ein zytoplasmatischer Indikator in einem Stamm und ein mitochondrialer Indikator in einem anderen. Neuronen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um...

Bildgebung der subzellulären Kalziumdynamik in Neuronen von Caenorhabditis elegans

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von genetisch codierte Ca2 + Reporter Datensatzänderungen in neuronale Aktivität im Verhalten Caenorhabditis Elegans Würmer.

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

In Xenopus-Embryonen sind Zellen aus dem Dach des Blastocoels pluripotent und können so programmiert werden, dass sie verschiedene Gewebe erzeugen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Verwendung von amphibischen Blastocoel-Dachexplantaten als Assay-System, um in vivo und in vitro wichtige Merkmale der frühen neuronalen Entwicklung zu untersuchen.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Erfahren Sie die Visualisierung von Calciumtransienten bei der Befruchtung und frühen Embryogenese von C. elegans mit dem genetisch kodierten CaFE-Reporter. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Signale.

In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans

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