In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans

Die Herstellung lebensfähiger Embryonen ist ein komplexer Prozess. Unser übergeordnetes Ziel ist es, die zellulären Signale zu definieren, die den Übergang von einer Eizelle zu einem Embryo koordinieren. Der CaFE-Reporter ist ein neues Werkzeug, das entwickelt wurde, um Kalziumsignale zu visualisieren, die bei der Befruchtung und während der frühen Embryogenese auftreten.

Mit Hilfe des CaFE-Reporters haben wir eine verzögerte Kalziumwelle in Eizellen entdeckt, die einen vorzeitigen Eisprung haben. Wir haben auch das Vorhandensein von einzelligen Kalziumtransienten während der frühen Embryogenese entdeckt. Beide Ergebnisse verdeutlichen den Nutzen eines genetisch kodierten Kalziumindikators während der frühen Entwicklung.

Frühere Techniken zur Visualisierung von Kalzium-Eizellen beruhten auf der Injektion von Farbstoffen in die Gonade. Diese Technik ist arbeitsintensiv und erfordert spezielle Mikroinjektionsgeräte. Der CaFE-Reporter ermöglicht eine einfache Visualisierung der Kalziumwelle in Eizellen und Embryonen mit weit verbreiteten Geräten.

Der CaFE Reporter ermöglicht die Untersuchung des Zeitpunkts und der Regulation der Kalziumsignalübertragung in Eizellen und Embryonen. Dieser Reporter kann leicht mit bestehenden Mutanten, Markern und RNAi-Knockdowns kombiniert werden, um das Verhalten von Kalzium im Vergleich zu anderen wegweisenden Ereignissen während der frühen Embryogenese, wie z.B. der myotischen Reifung, aufzudecken. Halten Sie zunächst den Wurmstochergriff fest und lösen Sie das silberne Halsband in Richtung Kopf, so dass sich die vier Teile lösen.

Platzieren Sie einen 1,5-Zoll-Platindraht in der Mitte der vier Abschnitte. Halten Sie den Draht in der Mitte, während Sie den Kragen festziehen, um die vier Teile zusammenzubringen. Bringen Sie den Draht mit einer Flachzange vorsichtig in Form und klemmen Sie das Ende des Drahtes wiederholt fest, sodass ein Fuß von etwa zwei bis drei Millimetern entsteht.

Benutze diesen Fuß, um die Würmer aufzuheben. Bereiten Sie eine Lösung aus 3%iger Agarose in Wasser vor und erhitzen Sie sie in der Mikrowelle, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Platzieren Sie einen leeren Objektträger zwischen zwei anderen Objektträgern, die aus einer einzigen Schicht Laborklebeband auf der Längsachse bestehen.

Geben Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette die erhitzte 3%ige Agaroselösung auf die Mitte des leeren Objektträgers. Legen Sie schnell einen neuen Objektträger senkrecht zum leeren Objektträger senkrecht zum leeren Objektträger auf den Agarose-Objektträger, wobei der Tropfen auf den angrenzenden Objektträgern aufliegt, und trennen Sie dann die Objektträger vorsichtig, wobei das Pad intakt bleibt. Geben Sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette einen kleinen Tropfen ein Millimolar Levamisol in M9-Puffer in die Mitte des Agarose-Pads, um die Würmer zu lähmen.

Pflücken Sie mindestens fünf synchronisierte Würmer und berühren Sie vorsichtig den Fuß des Wurmgriffs mit dem Levamisol-Tröpfchen, um die Würmer zu übertragen. Decken Sie das Agarose-Pad vorsichtig mit einem Deckglas ab. Überprüfen Sie die Position der Würmer, da der Deckschirm die Ausbreitung der Würmer verursachen kann.

Beschriften Sie den Objektträger mit entsprechenden Details, wie z. B. dem Namen des Wurmstamms. Lokalisieren Sie die Würmer mit einem schwachen Objektiv am Mikroskop unter Verwendung von Hellfeldbeleuchtung. Verwenden Sie mindestens ein 20-faches Luftobjektiv oder ein 40-faches Immersionsobjektiv, um die Kalziumwelle in Eizellen deutlich sichtbar zu machen.

Für eine optimale Visualisierung der Fluoreszenzreporter passen Sie die Verstärkung bzw. Belichtungszeit für die GFP- und RFP-Kanäle an. Untersuchen Sie jede Minus-Eins-Eizelle in den Gonadenarmen des Wurms, um festzustellen, ob ein Befruchtungsereignis unmittelbar bevorsteht. Nach dem Zusammenbruch der Kernhülle ordnet sich das Zytoskelett der proximalsten Minus-Eins-Eizelle neu an, nimmt ein abgerundetes Aussehen an und trennt sich von der Minus-Zwei-Eizelle.

Wenn der Eisprung unmittelbar bevorsteht, beginnen Sie sofort mit der Aufnahme des Videos in einer Weitwinkeleinstellung. Die proximale Eizelle wird mit dem Minus-Eins direkt vor der Spermathek bezeichnet, in der die Spermien gelagert werden. Der jüngste Embryo befindet sich am nächsten an der Spermathek, aber in der Gebärmutter.

Die Kalziumwelle zeigte ein zweiphasiges Muster, beginnend mit einem schnellen Ausbruch, gefolgt von einer Fluoreszenzwelle, die sich vom Eintrittspunkt zum gegenüberliegenden Pol bewegte. Ein Calciumsignal wurde unmittelbar nach dem Eintritt in die Spermatheca in der führenden Minus-Eins-Eizelle beobachtet, nicht jedoch in der nachfolgenden Minus-Zwei-Eizelle. Embryonen in-utero und ex-utero zeigten während der Embryogenese ein Fluoreszenzsignal in einer einzelnen Zelle.