Name: Entwicklung und Anwendung von Rapamycin-regulierten Tyrosinphosphatasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines rapamycin-regulierten Systems zur Steuerung von Tyrosinphosphatasen in HEK-293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht spezifische und zeitliche Kontrolle von SHIP-2 zur Untersuchung zellulärer Signalwege.

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<meta charset="utf8"></head><body>Zeitliche Regulation der Phosphatase-Aktivität mit dem Rapamycin-regulierten System

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

Protein-Tyrosin-Phosphatasen sind eine wichtige Familie von Proteinen, die an einer Vielzahl von zellulären Signalereignissen beteiligt sind. Es wurde gezeigt, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Zellproliferation, -migration und -apoptose spielen 1,2,3. Folglich führt die Dysregulation von Protein-Tyrosin-Phosphatasen zu einer Vielzahl von schwächenden Krankheiten und Störungen 4,5,6,7. Die Untersuchung der physiologischen Funktion von Tyrosinphosphatasen und ihrer Rolle bei der Entwicklung dieser Pathologien wurde in der Vergangenheit durch einen Mangel an Instrumenten behindert, die für die Untersuchung der Feinheiten der Phosphatase-Signalübertragung erforderlich sind8.
Traditionell werden Phosphatasen mit Methoden untersucht, die nicht die gewünschte Spezifität aufweisen und/oder keine zeitliche Kontrolle ihrer Aktivität bieten. Diese kritischen Einschränkungen der verfügbaren Werkzeuge machen es schwierig, die spezifische Rolle von Phosphatasen in Signalwegen zu untersuchen. Die Überexpression konstitutiv aktiver und dominanter negativer Mutanten oder die Herunterregulierung der Expression der Phosphatase sorgen für Spezifität, haben aber keine zeitliche Kontrolle und können oft kompensatorische Mechanismen auslösen, die die wahre Funktion des Enzyms verschleiern.
Pharmakologische Inhibitoren ermöglichen die zeitliche Regulation von Phosphatasen. Viele Phosphatasehemmer sind jedoch aufgrund der gut konservierten Zusammensetzung des aktiven Zentrums in Tyrosinphosphatasen notorisch unspezifisch9. Darüber hinaus weisen Inhibitoren, die auf die katalytische Stelle abzielen, aufgrund von Designeinschränkungen eine schlechte Permeabilität der Zellmembranauf 10. Eine weitere Einschränkung von Inhibitoren besteht darin, dass sie nur die Untersuchung der Auswirkungen der Phosphatase-Inaktivierung ermöglichen11. Daher besteht ein Bedarf an Werkzeugen, die eine spezifische, zeitlich regulierbare Aktivierung von Phosphatasen ermöglichen. Diese Werkzeuge werden es den Forschern ermöglichen, die direkten Auswirkungen der Phosphatase-Aktivierung zu identifizieren und sie von mehreren parallelen Signalkaskaden zu trennen, die oft durch biologische Reize aktiviert werden. Wichtig ist, dass eine strenge zeitliche Kontrolle der Aktivität die Identifizierung von vorübergehenden Ereignissen ermöglicht, die durch eine Phosphatase induziert werden, und die Auswirkungen von akuter und anhaltender Phosphataseaktivität trennt. Die Kombination von zeitlicher Regulation und Mutationsanalyse wird es ermöglichen, die spezifischen Rollen einzelner Domänen der Phosphatase detailliert zu entschlüsseln und ihre nachgeschaltete Signalübertragung zu hinterfragen12.
Um den Mangel an gewünschten Fähigkeiten in den bestehenden Instrumenten zu beheben, hat die Karginov-Gruppe das Rapamycin Regulated (RapR) System 13,14,15 entwickelt. Das RapR-System verwendet eine speziell entwickelte Schalterdomäne, iFKBP, die eine allosterische Regulation des interessierenden Proteins (POI) ermöglicht. Die Insertion der iFKBP-Domäne an einer Position, die allosterisch an die katalytische Stelle des POI gekoppelt ist, macht ihn anfällig für eine Regulation durch Rapamycin. In Abwesenheit von Rapamycin stört iFKBP aufgrund der intrinsisch hohen Strukturdynamik von iFKBP die katalytische Stelle und inaktiviert somit den POI. Die Zugabe von Rapamycin induziert die Interaktion von iFKBP mit dem co-exprimierten Protein FRB (Abbildung 1). Dies bewirkt eine Stabilisierung der Switch-Domäne, wodurch die Struktur und Funktion der katalytischen Domäne des POI wiederhergestellt wird. Damit ermöglicht das Tool eine gezielte und zeitlich einstellbare Aktivierung des POI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des RapR-Shp2-Rapamycin-regulierten Systems. RapR ermöglicht die allosterische Aktivierung des interessierenden Proteins unter Zugabe von Rapamycin. Diese Abbildung wurde von Fauser et al.12 modifiziert. Abkürzungen: iFKBP = insertable FKBP12; FRB = FKBP-Rapamycin-Bindungsdomäne; R = Rapamycin; Shp2 = Src-Homologie-2-Domänen-enthaltendes Protein Tyrosinphosphatase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das RapR-Tool kann auf verschiedene Proteinfamilien angewendet werden. Es kann sowohl zur Regulierung von Proteinkinasen als auch von Phosphatasen verwendet werden12,14. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Anwendung des RapR-Tools zur Kontrolle der Shp2-Phosphatase. Shp2 ist eine ubiquitär exprimierte Protein-Tyrosinphosphatase, die an Signalprozessen wie Proliferation, Migration, Immunmodulation und Differenzierung beteiligt ist 1,16,17,18. Eine Dysregulation von Shp2 wurde mit einer Reihe von soliden Krebserkrankungen, myeloischer Leukämie und Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht 5,7. Shp2 ist jedoch den gleichen Tool-Unzulänglichkeiten zum Opfer gefallen wie oben beschrieben. Um diesen Einschränkungen entgegenzuwirken, wurde mit RapR-Shp2 ein spezifisch und zeitlich regulierbares Shp2-Konstrukt entwickelt und charakterisiert12.
Vor der Entwicklung von RapR-Shp2 war bekannt, dass Shp2 an der Zellmigration beteiligt ist 19,20,21. Seine spezifische Rolle bei der Signalübertragung, die an diesem Prozess beteiligt ist, war jedoch unbekannt. Es war auch nicht bekannt, auf welcher Zeitskala Shp2 die Wanderung von Zellen reguliert und welche spezifischen morphodynamischen Veränderungen es zu verschiedenen Zeitpunkten seiner Aktivierung hervorruft. Darüber hinaus war unklar, ob eine akute und anhaltende Aktivierung von Shp2 unterschiedliche Effekte hervorruft. Unter Verwendung von RapR-Shp2 wurde festgestellt, dass die akute Aktivierung von Shp2 eine vorübergehende Zellausbreitung, eine Zunahme der Protrusionen, die Zellpolarisation und die Migration induziert. Spezifische Signalwege stromabwärts von Shp2, die unterschiedliche morphodynamische Veränderungen regulieren, wurden ebenfalls identifiziert12. Dieses Protokoll enthält Details für das Design und die Charakterisierung von RapR-Shp2, die zur Entwicklung und Anwendung anderer RapR-Phosphatasen verwendet werden können.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Glasdeckgläser 25 mm Rund</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Puffer</td><td></td><td></td><td>Für 500 mL: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 mL Glycerin, 52,5 mL 20% SDS, 0,5 g Bromphenolblau, final pH 6,8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Agarsose</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor Zellkammer</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Produkte</td><td>100-106</td><td>Hitzeinaktiviertes Triple 0,1 &Mikro; m steril gefiltert</td></tr><tr><td>Brig 35,30 w/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Veröffentlicht in 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red Plasmamembranfarbstoff</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a kompetent Zellen</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzym</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagenzien</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin aus Rinderplasma</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>GeneJET Gel-Extraktionskit</td></tr><tr><td>Gel Grüne Nukleinsäure-Beize</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Farbstoff Lila 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>HEK 293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Verarbeitungssoftware</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol Puffer</td><td></td><td></td><td>25 mM Imidazol pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Lysepuffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>R 2022b Update wurde verwendet, um die CellGeo-Funktionen</td></tr> auszuführen <tr><td>Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Gen Choice</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 Well</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Water</td><td>Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>Multiband Polychroic Mirror</td><td>Chroma Technology</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanSAPO 40x Objektiv</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca und Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0,2 mL 8-Streifen-Röhrchen und -Kappen, starrer Streifen Einzeln angebrachte Domkappen</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membranen</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/Filter Papier Sandwiches</td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Fisher</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin, 2,21 mM EDTA, 1x [-] Natrium</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetat-EDTA (TAE) 50x</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td><td>für Elektrophorese</td></tr><tr><td>Waschpuffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3446I-100<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFR Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK 1/2 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag Antikörper</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP Antikörper</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Paxillin Antikörper</td><td>Thermo Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-EGFR Y992 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-Paxillin Y31 Antikörper</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-PLC & gamma; Y783</td><td>Antikörper-Zell-Signalgebung</td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLC&gamma; </td><td>Antikörper-Zell-Signalübertragung</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung und anwendung von rapamycin-regulierten tyrosinphosphatasen

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse, die von dem Paxillin-basierten Phosphatase-Aktivitäts-Assay erwartet werden können. In diesem Experiment wurde die konstitutiv aktive und dominante negative Shp2-Phosphatase-Aktivität mit der von aktivem und inaktivem RapR-Shp2 verglichen, wobei Phospho-Paxillin als Messwert verwendet wurde. Die Shp2-Konstrukte wurden immunpräzipitiert und dem Aktivitätsassay unterzogen, wie im Protokoll beschrieben. Die Phospho-Paxillin-Messwerte für konstitutiv aktives Shp2 und aktives RapR-Shp2 waren ähnlich, was darauf hindeutet, dass das aktive RapR-Shp2 durch die Einführung der RapR-Domäne nicht negativ beeinflusst wurde und nach der Aktivierung seine volle Aktivität behielt. Dominantes negatives Shp2 und inaktives RapR-Shp2 waren ebenfalls ähnlich, was darauf hindeutet, dass das RapR-Shp2-Konstrukt keine Aktivität aufweist, wenn es inaktiv ist. Dies deutet auf das erfolgreiche Design einer RapR-Phosphatase hin. Das für diesen Assay verwendete Phosphosubstrat kann je nach interessierender Phosphatase unterschiedlich sein.
Abbildung 5, ähnlich wie Abbildung 4, vergleicht konstitutiv aktives, dominant negatives sowie aktives und inaktives RapR-Shp2. Dieses Experiment wurde ohne Immunpräzipitation der Konstrukte durchgeführt. Stattdessen wurde es entwickelt, um die nachgeschalteten Signaleffekte des RapR-Shp2-Konstrukts innerhalb von Zellen zu charakterisieren. Hier wurden die Shp2-Konstrukte in HEK293T Zellen exprimiert. Es wurde gezeigt, dass der nachgeschaltete Effektor ERK1/2 die Phosphorylierung als Reaktion auf die RapR-Shp2-Aktivierung erhöht, genau wie in der konstitutiv aktiven Probe. Das inaktive RapR-Shp2 induzierte diese Veränderung nicht. Dies deutet darauf hin, dass die nachgeschaltete Signalübertragung von Shp2 durch den Einbau der RapR-Domäne erhalten bleibt. In ähnlicher Weise wurden die bekannten Phospho-Substrate EGFR und PLCγ als Reaktion auf die Aktivierung von RapR-Shp2 in A431-Zellen dephosphoryliert.
Schließlich zeigt Abbildung 6 die Ergebnisse der RapR-Shp2-Aktivierung auf die Morphodynamik von HeLa-Zellen. Sobald RapR-Shp2 aktiviert war, zeigten die Zellen eine Zunahme der protrusiven Aktivität sowie der Zellfläche. Dies deutet darauf hin, dass die Aktivierung von RapR-Shp2 ausreicht, um morphodynamische Veränderungen in HeLa-Zellen zu induzieren, und könnte es den Forschern ermöglichen, spezifische nachgeschaltete Signalwege zu untersuchen, die für diesen Effekt verantwortlich sind.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> Abbildung 4: Ergebnisse des Paxillin-basierten Aktivitätsassays: Konstitutiv aktiv, dominant negativ und RapR-Shp2 wurden immunpräzipitiert und dem Aktivitätsassay unter Verwendung des skizzierten Protokolls unterzogen. Die Spiegel von pY31-Paxillin sowohl in CA als auch in RapR-Shp2 waren ähnlich, was darauf hindeutet, dass das RapR-Shp2-Konstrukt eine ähnliche Aktivität aufwies wie CA Shp2, sobald es aktiviert wurde. Die nicht aktivierte RapR-Shp2-Probe wies keine Aktivität auf, ähnlich wie die DN-Probe, was darauf hindeutet, dass sie nicht "undicht" war. Diese Abbildung wurde von Fauser et al.12 modifiziert. Abkürzungen: RapR = Rapamycin-reguliert; Shp2 = Src-Homologie-2-Domänen-enthaltendes Protein Tyrosinphosphatase; DN = dominant negativ; CA = konstitutiv aktiv; FRB = FKBP-Rapamycin-Bindungsdomäne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> Abbildung 5: Ergebnisse des Ganzzell-Lysat-Assays: Konstitutiv aktiv, dominant negativ und RapR-Shp2 wurden in HEK293T Zellen exprimiert und das Ganzzelllysat-Protokoll abgeschlossen. Wenn RapR-Shp2 inaktiv war, aktivierte es ERK1/2 nicht durch Phosphorylierung, ähnlich wie die DN Shp2-Probe. Dies deutet darauf hin, dass RapR-Shp2 keine Aktivität aufweist, wenn es inaktiv ist. Nach der Aktivierung war das Ausmaß der ERK1/2-Phosphorylierung ähnlich wie bei der CA Shp2-Probe, was auf eine erfolgreiche Aktivierung und nachgeschaltete Signalübertragung von Shp2 hinweist. In ähnlicher Weise zeigten A431-Zellen, die RapR-Shp2 exprimieren, eine Abnahme der Phosphorylierung sowohl von EGFR als auch von PLCγ, beides bekannte Substrate von Shp2. Diese Abbildung wurde von Fauser et al.12 modifiziert. Abkürzungen: RapR = Rapamycin-reguliert; Shp2 = Src-Homologie-2-Domänen-enthaltendes Protein Tyrosinphosphatase; DN = dominant negativ; CA = konstitutiv aktiv; ERK = extrazelluläre signalregulierte Kinase; GAPDH = Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; EGFR = epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor; PLCγ = Phospholipase C gamma; FRB = FKBP-Rapamycin-Bindungsdomäne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> Abbildung 6: Analyse der Zellfläche und der protrusiven Aktivität basierend auf Live-Bildgebung: HeLa-Zellen wurden mit RapR-Shp2 transfiziert und dem skizzierten Live-Imaging-Protokoll unterzogen. Die Daten wurden wie im Datenanalyseprotokoll beschrieben analysiert. Nach der Aktivierung (gekennzeichnet durch die vertikale graue Linie) zeigten HeLa-Zellen eine Zunahme sowohl der Zellprotrusionsaktivität als auch der Zellfläche. In den negativen Proben, die nur FRB exprimierten, war diese Aktivität nicht vorhanden. Dies deutet darauf hin, dass die Aktivierung von RapR-Shp2 schnelle morphodynamische Veränderungen innerhalb der HeLa-Zellen induziert und die Ausbreitung und Protrusion der Zellen fördert. Diese Abbildung wurde von Fauser et al.12 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Entwicklung und Anwendung von Rapamycin-regulierten Tyrosinphosphatasen

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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