Strukturgesteuertes Design und Entwicklung neuartiger Cyclophilin-A-Inhibitoren und Ganoderiol-F-Derivate: Ein In-Silico-Ansatz
23. Juni 2026
Hier stellen wir ein Protokoll für das strukturgesteuerte Design der Protein-Ligand-Bindungsinteraktion zwischen Sanglifehrin A und Cyclophilin A/Ganoderiol-F vor, das für die Entdeckung neuer Medikamente unerlässlich ist. Die Stabilität des Ligandenrezeptorkomplexes wurde mittels molekularer Dynamiksimulation bewertet.
Diese Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung neuartiger Cyclophilin-A-Inhibitoren und gan-it-role Antiproliferativen, um die Cyclophilin-DCDK-Achse anzusprechen und die Proliferation von Zellkrebs zu hemmen. Die Hauptaufgabe ist die optimale geometrische Interaktion zwischen Liganden und Rezeptor sowie die Aufrechterhaltung stabiler Liganden-Protein-Komplexe unter dynamischen experimentellen und physiologischen Bedingungen. Um zu beginnen, öffne die 1NMK"-Datei.
Finde die Aminosäure Arginin an Position Nummer 55 und notiere die X-, Y- und Z-Koordinaten in der AutoDock-Schnittstelle. Öffnen Sie das Menü Datei", wählen Sie Moleküle lesen. Wähle die Datei 1NMK" und klicke auf Öffnen.
Fügen Sie Wasserstoffatome hinzu, indem Sie Bearbeiten, Wasserstoff auswählen und auf Hinzufügen klicken. Dann wähle "Nur polar" und bestätige mit OK. Gehe dann wieder ins Menü "Bearbeiten", wähle Atome aus und wähle AD4 Atomtyp zuweisen. Als Nächstes wählen Sie "Charges" und wählen Sie Kollman Charges.
Speichere den vorbereiteten Rezeptor als 1NMK. pdbqt", indem man Datei auswählt, Speichert speichert, den Dateityp einlegt und den Speicherort bestätigt. Öffne als Nächstes das Menü "Ligand", wähle Eingabe.
Klicken Sie auf Öffnen, wählen Sie die PDB-Datei aus und klicken Sie erneut auf Öffnen. Wenn das Informationsfenster erscheint, überprüfen Sie die Ligandendetails. Um die Ligandwurzel zu erkennen, wählen Sie Ligand, dann Torsion Tree und klicken Sie auf Root erkennen.
Speichern Sie den Liganden, indem Sie Ligand auswählen, Ausgabe auswählen und auf Speichern als PDBQT klicken. Bereite das Rezeptorgitter vor, indem du Gitter auswählst, Makromolekül auswählst, 1NMK auswählst und Molekül anklickst. Bestätigen Sie die Warnung und speichern Sie sie als 1NMK.pdbqt.
Um die Kartentypen festzulegen, wählen Sie Raster aus, gefolgt von Kartentypen setzen, Ligand. Wähle Ligand" und schließlich Ligand" nochmal. Dann definiere die Mitte der Gitterbox, indem du Raster auswählst, Rasterbox auswählst und auf Zentrum klickst.
Wählen Sie dann ein Atom aus und geben Sie die Koordinaten des Rasterfelds ein. Speichere den Grid-Parameter als GPF-Datei. Konfigurieren Sie das Andocken, indem Sie Andocken auswählen, gefolgt von "Macromolecule" und Rigid File Name festlegen.
Navigiere zum erforderlichen Ordner und klicke auf 1NMK.pdbqt, um ihn zu öffnen, wähle Docking, wähle Output, klicke auf Lamarckian GA und speichere die Docking-Parameterdatei als 1NMK.dpf. Im Cygwin"-Terminal geben Sie cd C: ein und drücken Sie Enter; Dann tippe CD Projekt" und drücke nochmal Enter.
Als Nächstes gibst du cd-Moleküle ein und drückst Enter. Dann gib CD 3" ein und drücke Enter. Gib den Befehl AutoGrid" ein, um Rasterkarten zu generieren, und drücke Enter zum Ausführen von AutoGrid.
Nach der Ausführung wird Tail f 1NMK getypt. glg"und drücken Sie Enter, um den Logfortschritt zu sehen, geben Sie den Befehl für die molekulare Andocksimulation ein. Um die Andockungsdatei zu generieren, drücken Sie Enter, um AutoDock zu starten.
Dann typibe Tail f 1NMK. dlg" und drücke Enter, um den Andockprozess zu überwachen. Nachdem du alle DLG-Dateien erstellt hast, gehe in Ordner 1 und öffne die DLG-Datei in WordPad, drücke Strg+F.
Geben Sie das Suchwort ein und drücken Sie dreimal, um zur RMSD-Tabelle zu gelangen. Kopieren Sie die Bindungsenergie und die entsprechenden Laufinformationen für jedes Molekül aus der RMSD-Tabelle, stellen Sie die 20 besten Moleküle in einer Tabelle mit Spalten für Seriennummer, minimale Bindungsenergie zusammen und führen Sie diese aus. Im Cygwin"-Terminal navigieren Sie zum spezifischen Moleküle-Ordner im Projektverzeichnis.
Gib den Befehl ein, um angedockte Ligandenkoordinaten aus DLG zu extrahieren und die Daten zu trimmen. Drücken Sie erneut Enter, um zu finalisieren und bestätigen damit die Erstellung der 1NMK run PDBQT"-Datei. Überprüfen Sie, dass die 1NMK-ausgeführte PDB"-Datei im selben Ordner erstellt wurde.
Als Nächstes öffnen Sie die PyMOL 2.5"-Software und das AutoDock vom Desktop aus und öffnen Sie die Rezeptordatei, um die Rezeptorstruktur für die Visualisierung auszuwählen. Öffnen Sie die entsprechende Ligand-Konfigurationsdatei für das gewählte Molekül und zeigen Sie den geladenen Liganden im 3D-Arbeitsbereich an. Wähle "Alles ausblenden" aus dem Menü, importiere die Datei in Maestro, um die Struktur zu visualisieren, und klicke dann auf "Ligand-Interaktion", um das Liganden-Interaktionsdiagramm zu erhalten.
Öffnen Sie die UCSF Chimera"-Software vom Desktop aus. Datei auswählen, gefolgt von Öffnen. Navigiere zum Laufwerk C, Projekt und Moleküle.
Wählen Sie die Datei 1NMK aus. pdb" und klicke auf Öffnen. Im Menü wählen Sie "Residue" und "UNL Zoom" aus, um sich auf die UNL-Residue-Region zu konzentrieren.
Wähle Zone. Dann drücke OK" zur Bestätigung. Wähle als Nächstes Aktion aus.
Wähle Label, dann Residue und Name Plus Specifier, um die Residuen zu beschriften. Öffnen Sie Werkzeuge, wählen Sie Strukturanalyse und klicken Sie dann auf FindHBond. Im Standardfenster "FindHBond" aktivieren Sie die Kästchen für Farb-H-Bindungen, die keine genauen Kriterien erfüllen und finden Sie nur H-Bindungen mit Ausgewählt.
Räumen Sie die Zonenauswahl, um eine neue Vermessung zu beginnen. Wählen Sie dann die Zonenparameter aus, zoomen Sie in das molekulare Display und beobachten die blauen und orangen Linien, die Wasserstoffbrücken darstellen. Untersuchen Sie schließlich die visualisierte Struktur und zählen Sie die Gesamtzahl sichtbarer Wasserstoffbrücken.
Die Andockbestätigung des Liganden-Rezeptor-Komplexes wurde mit PyMOL 2.5 visualisiert und zeigte 109 Hydroxy-Six-Hydroxyethyl-gebundene Bindungen in der aktiven Tasche des 1NMK"-Rezeptors. Der 4-Hydroxymandelsäureligand bildete Wasserstoffbrücken mit dem 1NMK"-Rezeptor, insbesondere mit Arginin 55 in einer Entfernung von 1,53 Ångström. Die zweidimensionale Strukturanalyse veranschaulichte die Aminosäuren, mit denen die Liganden durch Wasserstoffbrückenbindungen interagieren.
Molekulardynamische Simulationen bestätigen die Stabilität des Liganden-Rezeptor-Komplexes durch die Analyse des Gyrationsradius über 1000 Pikosekunden. Der RMSD-Graph zeigte eine konsistente Stabilisierung des Komplexes nach einer Nanosekunde Simulation, was auf eine stetige Protein-Ligand-Bindung hinweist. Die durchschnittliche Dichte des Systems betrug etwa 1019 Kilogramm pro Kubikmeter, was das Gleichgewicht unter NVT-Bedingungen bestätigt, und der Druck des Systems bleibt während des NPT-Gleichgewichts für 100 Pikosekunden stabil.
Die Temperatur stabilisierte sich während der NVT-Phase um etwa 300 Kelvin, was eine erfolgreiche thermische Gleichstellung bestätigte. Die Liganden-Protein-Komplex-Trajektorienbox wurde nach der Simulation visualisiert und zeigt die Verteilung der Wassermoleküle rund um den angedockten Komplex. Nur wenige Studien untersuchen gan-it-role antiproliferativ als onkogenes therapeutisches Ziel.
Dieses Protokoll schließt diese Lücke, indem Inhibitoren mittels molekularer Andockung und Dynamikanalyse entworfen und validiert werden. Unser Protokoll analysiert mehrere rechnergestützte Werkzeuge zu einem einheitlichen Workflow und gewährleistet so eine umfassende Analyse von Ligandenproteinen oder Rezeptoren. Unsere zukünftige Forschung wird sich darauf konzentrieren, diese Inhibitoren in vitro und in vivo zu validieren, indem wir die Grenzanwendung von Cyclophilin-A-Inhibitoren auf mehrere Krebszelltypen untersuchen.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Entwicklung und Validierung neuartiger Cyclophilin-A-Inhibitoren, die auf die Cyclophilin-D-CDK-Achse abzielen, um die Proliferation von Krebszellen zu hemmen. Mithilfe eines strukturgeleiteten Ansatzes entwickelten die Forscher 117 Ligandenmoleküle und bewerteten deren Wechselwirkungen mit dem Sanglifehrin-A-Enzymrezeptor (1NMK) durch molekulares Docking und dynamische Simulationen. Der Arbeitsablauf integrierte mehrere computergestützte Werkzeuge, um die Ligand-Rezeptor-Bindung zu optimieren, die Stabilität zu bewerten und wichtige wechselwirkende Reste für die potenzielle Entwicklung von Antikrebsmedikamenten zu identifizieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Krebspharmakologie
- Computerbasierte Wirkstoffentwicklung
- Molekulares Docking und Simulation
Hintergrund
- Cyclophilin A (Cyp A) ist an der Krebsprogression durch die Regulation von Proliferation und Zellüberleben beteiligt.
- Die Cyclophilin D-CDK-Achse stellt ein aussichtsreiches therapeutisches Ziel in der Onkologie dar.
- Ganoderiol-F-Derivate haben sich als potenzielle onkogene Zielstrukturen in mehreren Krebstypen erwiesen.
- Eine genaue Vorhersage von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen erfordert robuste computergestützte Modellierung.
Zweck der Studie
- Neuartige Cyclophilin-A-Inhibitoren unter Verwendung strukturgeleiteter Methoden zu entwickeln.
- Die Bindungsaffinität zwischen Ligand und Rezeptor sowie die geometrische Kompatibilität mittels Docking zu bewerten.
- Die Stabilität des Komplexes durch molekulardynamische Simulationen zu bestätigen.
- Die wichtigsten Aminosäurereste zu identifizieren, die an Wasserstoffbrückenbindungen mit führenden Liganden beteiligt sind.
Verwendete Methoden
- Chemsketch zur Erstellung von 117 neuartigen Ligandenmolekülen als Cyclophilin-Inhibitoren.
- AutoDock 4.2.6 für das Docking von Ligand und Protein zur Bestimmung optimaler Bindungsgeometrien.
- PyMOL 2.5 zur Visualisierung der Docking-Positionen und der Wechselwirkungen zwischen Ligand und Rezeptor.
- Chimera und Maestro zur Detektion und Analyse von Wasserstoffbrückenbindungen.
- Gromacs mit dem CHARMM-36-Kraftfeld für die Molekulardynamik-Simulation des Ligand-Rezeptor-Komplexes.
Hauptergebnisse
- Arginin 55 im 1NMK-Rezeptor bildete eine Wasserstoffbrücke mit dem Liganden in einem Abstand von 1,53 Å.
- Zu den wichtigsten wechselwirkenden Resten gehörten Asn, Gly, Thr, Lys, Ile, His, Phe und Cys.
- Der Ligand bildete 45 Wasserstoffbrücken mit dem Rezeptor, was auf ein starkes Bindungspotenzial hindeutet.
- Die Docking-Box war im 1NMK-Rezeptor bei X=38,86, Y=10,987, Z=40,734 zentriert.
- Die MD-Simulation in Gromacs zeigte eine Stabilisierung des Komplexes nach 1 ns, mit konsistentem RMSD und Trägheitsradius.
- Das System befand sich im Gleichgewicht unter NVT/NPT-Bedingungen, mit einer durchschnittlichen Dichte von ~1019 kg/m³ sowie stabilen Druck- und Temperaturwerten (~300 K).
Schlussfolgerungen
- Der konzipierte Ligand-Rezeptor-Komplex weist eine ausreichende Stabilität für die weitere Entwicklung als Krebsmedikament auf.
- Arginin 55 spielt eine entscheidende Rolle bei der Ligandenbindung in der aktiven Stelle von Cyclophilin A.
- Die integrierte computerbasierte Arbeitsabfolge identifiziert erfolgreich aussichtsreiche Cyp-A-Inhibitoren.
- Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Validierung in vitro und in vivo über mehrere Krebszelltypen hinweg konzentrieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die strukturgeführte computergestützte Entwicklung ermöglicht die schnelle Identifizierung von Cyclophilin A-Inhibitoren mit optimierter Bindung an die Cyclophilin D-CDK-Achse, ein validiertes Onkologie-Target. Dieser Ansatz verringert die Ausscheidung in frühen Stadien, indem Liganden mit starker vorhergesagter Targetbindung und Komplexstabilität priorisiert werden. Der Arbeitsablauf unterstützt die Identifizierung von Leitstrukturen, indem er Docking, Interaktionsanalyse und molekulare Dynamik integriert, um mechanistische Hypothesen vor der Synthese abzusichern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Modellierung von Liganden-Wechselwirkungen mit Cyclophilin A in atomarer Auflösung.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Vorhersage der Bindungsaffinität und der Beteiligung entscheidender Reste, wie beispielsweise Arginin 55.
- Predictiver Wert: Steigert das Vertrauen in die Zielmodulation, indem Liganden identifiziert werden, die mehrere Wasserstoffbrücken eingehen, darunter 45 in dem Leitkomplex beobachtet wurden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt validierte Ligand-Rezeptor-Komplexe, die für die Entwicklung biochemischer oder biophysikalischer Assays geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert Docking-Parameter (Gitterzentrum bei X=38,86, Y=10,987, Z=40,734) und die Bewertung zur konsistenten virtuellen Bildschirmanalyse.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Bewertung großer Ligandenbibliotheken (117 synthetisierte Moleküle) mithilfe automatisierter Docking-Workflows.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Konzentriert sich auf Cyclophilin A, das an der Proliferation und dem Überleben von Krebszellen in mehreren Tumortypen beteiligt ist.
- Translationale Kontinuität: Schafft eine mechanistische Verbindung vom In-silico-Design hin zur zukünftigen In-vitro- und In-vivo-Validierung.
- Risikominimierung: Bewertet die Komplexstabilität mittels RMSD und Trägheitsradius, um Go/No-Go-Entscheidungen vor der Synthese der Verbindung zu unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und ermöglicht eine computergestützte Vorselektion vor experimentellen Tests im Labor.
- Entdeckungsbiochemie: Prüft therapeutische Hypothesen, indem modelliert wird, wie Liganden die Funktion von Cyclophilin A in der D-CDK-Achse hemmen.
- Screening: Liefert assaysichere Ergebnisse durch standardisierte Docking-Posen und Rangfolgen der Bindungsenergie zur Priorisierung von Verbindungen.
- Analytik: Stellt quantitative Metriken (Bindungsenergie, Anzahl der Wasserstoffbrücken, RMSD) bereit, um die Leistung von Liganden zu vergleichen und die Optimierung zu leiten.
- Translationale Forschung: Verbindet computergestützte Treffer mit der präklinischen Weiterentwicklung, indem die Stabilität des Komplexes über eine 1000-ps-Simulation validiert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Pipeline zur gezielten Untersuchung anderer Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung derselben Tool-Integration (Chemsketch, AutoDock, PyMOL, Gromacs).
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Mechanistische Entlastung durch Vorhersage von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen und Identifizierung kritischer Bindungsreste.
- Operationaler Wert: Standardisierung von Workflows über verschiedene Tools hinweg reduziert Variabilität und ermöglicht die Zusammenarbeit zwischen Teams.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem Verbindungen anhand vorhergesagter Stabilität und Zielinteraktion gefiltert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Chemotypen mit starken Docking-Scores und durch MD bestätigter Stabilität.
Durchführungsaspekte
- Kenntnisse in molekularer Modellierung, Docking-Software (AutoDock) und Simulationsplattformen (Gromacs).
- Zugang zu rechnerischer Infrastruktur für die Erzeugung von Gittern, das Docking und MD-Simulationen von Protein-Ligand-Systemen.
- Standardisierung von Protokollen zur Ligandenpräparation, Ladungszuweisung (Kollman) und Speicherung von Gitterparametern.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Rezeptorsysteme jenseits von 1NMK, einschließlich der Neuzentrierung des Gitterkastens und analysenbezogener Betrachtung spezifischer Reste.
- Zu den Einschränkungen zählen die Abhängigkeit von der Genauigkeit des Kraftfelds (CHARMM 36) und der Zeitskalen der Simulationen, um seltene Bindungsereignisse erfassen zu können.
